CN105669789A - 一种去甲万古霉素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种去甲万古霉素的制备方法。该方法首先以超顺磁性微球吸附发酵液中的去甲万古霉素活性组分，经洗脱、结晶、干燥，得到去甲万古霉素粗粉；粗粉再经装有C8填料的色谱柱制备分离，得到纯度大于99%的去甲万古霉素产品。超顺磁性微球对去甲万古霉素的活性组分具有高选择性，该微球介质的引入使纯化工艺大大简化，收率大幅提高；工业色谱分离技术的应用，进一步降低了杂质组分的比例，得到了高纯度的去甲万古霉素产品。本发明操作简便，溶媒消耗少，产品收率高，适合于商业化生产。

Description

一种去甲万古霉素的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种去甲万古霉素的制备方法。

背景技术

盐酸去甲万古霉素是我国唯一一个自主研制并成功应用于临床的糖肽类抗生素，由链霉素发酵产生，用于治疗革兰氏阳性菌感染。去甲万古霉素具有和万古霉素类似的化学结构、药理性质、抗菌活性和抗菌谱，其作用机制为抑制细菌细胞壁的合成，是临床上治疗由甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌引起的严重感染的首选药物。

去甲万古霉素分子由两个基本结构组成，即糖基部分α-o-vancosamine-β-o-glucosyl和肽基部分的中心七肽核。在临床上使用的是去甲万古霉素盐酸盐。盐酸去甲万古霉素为白色或类白色无定形粉末，极易溶于水，可溶于含水甲醇，不溶于高级醇类、丙酮或乙醚，低浓度尿素可增加其水溶解度。

去甲万古霉素为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中。因此，对去甲万古霉素的研究，一般多从发酵液固液分离开始，先得到含有目标产物的滤液，再进行进一步的纯化除杂，得到目标产物。专利CN200310109688.9公开了一种从发酵液中分离制备去甲基万古霉素的方法，该方法通过发酵液预处理、树脂脱色、葡聚糖凝胶吸附及溶剂结晶等步骤，从去甲万古霉素发酵液中分离制备去甲万古霉素产品，所得产品含量大于90%，但该方法步骤繁琐，有机溶剂消耗量大，收率低。专利CN200910198279.8公开了一种采用聚合物填料从糖肽类粗品中分离纯化糖肽类化合物的方法，所得终产品纯度在95.0-98.5%之间，且该工艺过程为间歇操作，效率低，不便于商业化应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有去甲万古霉素生产技术的不足，开发一种操作方便、效率高、成本低的去甲万古霉素制备方法，本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。

本发明所述一种去甲万古霉素的制备方法，包括以下步骤：

a、发酵液中加入超顺磁性微球，搅拌使其吸附完全，然后分离出超顺磁性微球。

b、将分离出的超顺磁性微球先用水洗，再用乙醇-酸性水溶液洗脱，得到含有去甲万古霉素的洗脱液，洗脱液结晶、过滤、干燥，得到去甲万古霉素粗粉。

c、粗粉加水溶解，注入装有C8填料的色谱柱，乙醇-酸性水溶液洗脱，收集HPLC纯度≥98.5%的制备液，纳滤浓缩、脱水干燥，得到去甲万古霉素产品。

其中步骤a中所述超顺磁性微球的粒径为10-30μm，粒径分布为单分散，表面的功能基团为羧基基团。

其中步骤a中所述超顺磁性微球的用量为每升发酵液添加30-50g超顺磁性微球。

其中步骤b或c所述乙醇-酸性水溶液中酸性水溶液为磷酸-磷酸盐缓冲液，pH值为3.8-4.2，乙醇在溶液中的体积百分比为10-15%。

其中步骤b中所述乙醇-酸性水溶液用量为每克超顺磁性微球加入2.5-3毫升。

其中步骤b中所述洗脱液结晶为加入0.5mol/L的NaOH溶液调pH值至7.5-8.5。

其中步骤c中所述C8填料粒径为30-50μm。

其中步骤c中所述的纳滤浓缩，纳滤截留大小为200-500Da，浓缩液浓度为150-200mg/ml。

其中步骤c中所述的纳滤浓缩，纳滤过程中补加去离子水或蒸馏水脱去乙醇，至乙醇浓度小于1%。

其中步骤c中所述脱水干燥，是将纳滤浓缩液用盐酸调pH3.0-4.0后，冷冻干燥。

本发明b步骤中所述超顺磁性微球经外加磁场分离，用水冲洗表面附着物后用乙醇-酸性水溶液洗脱吸附的去甲万古霉素，超顺磁性微球再生后重复使用。

超顺磁性微球预处理及再生方式为每克微球加入3-5ml的2moL/L的HCl，静态浸泡2-4小时后过滤，除去盐酸，然后用去离子水洗涤至pH值4.0-5.0。

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步为：

1）超顺磁性微球对去甲万古霉素的活性组分具有高选择性，该介质的引入使纯化工艺大大简化，无需经过过滤、脱色、吸附等工序，粗粉制备时间由72小时缩短为16小时，收率由70%提高到85%以上，介质用量减少60%，废水排放量大幅降低。2）粗粉经装有C8填料的工业制备色谱分离提纯，可以得到纯度大于99%的去甲万古霉素产品，且溶剂用量极剧减少。3）所述方法具有操作简便、溶媒用量少，产品收率高的优点，适合于商业化生产应用。

附图说明

图1为去甲万古霉素粗粉HPLC检测图谱

图2为去甲万古霉素精粉HPLC检测图谱。

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

去甲万古霉素发酵液可按照现有技术制得，本发明所使用的去甲万古霉素发酵液由华北制药股份有限公司生产。大孔树脂X-5、D312，上海华震科技有限公司；超顺磁性微球、C8填料，聚合物微球UniPS25-300，苏州纳微生物科技有限公司；乙醇、丙酮等试剂均为市售。高效液相色谱仪器包括996型检测器、515泵，Waters公司生产；二元层析系统，江苏汉邦科技有限公司。

超顺磁性微球预处理及再生方式为每克微球加入3-5ml的2moL/L的HCl，静态浸泡2-4小时后过滤，除去盐酸，然后用去离子水洗涤至pH值4.0-5.0。

实施例1

取去甲万古霉素发酵液300ml，发酵单位为13720μg/ml，加入20μm的超顺磁性微球9g，搅拌吸附30分钟，吸附完毕，分离出发酵液中的超顺磁性微球，加入20ml水洗涤。

在超顺磁性微球中加入25ml10%的乙醇-磷酸盐缓冲液（pH3.8），洗脱吸附的去甲万古霉素，洗脱液用0.5mol/L的NaOH溶液调pH7.5，静置，结晶完全，过滤、干燥，得到去甲万古霉素粗粉4.7g，含量为74.7%（去甲万古霉素粗粉HPLC检测图谱见图1），收率为85.3%。

粗粉加14ml水溶解，注入装有30μmC8填料的色谱柱(DAC-50)，洗脱剂为10%的乙醇-磷酸盐缓冲液（pH3.8），根据色谱峰收集流出液，合并HPLC含量大于98.5%的流出液，用截留大小为200Da的卷式纳滤膜纳滤，补加蒸馏水脱去乙醇，至乙醇浓度小于1%，浓缩至去甲万古霉素浓度为150mg/ml，然后用0.5mol/L的盐酸调pH3.5，冷冻干燥，得到去甲万古霉素精粉2.6g，含量为99.1%（去甲万古霉素精粉HPLC检测图谱见图2），收率为73.4%。

实施例2

取去甲万古霉素发酵液3L，发酵单位为14678μg/ml，加入10μm的超顺磁性微球150g，搅拌吸附20分钟，吸附完毕，分离出发酵液中的超顺磁性微球，加入300ml水洗涤。

在超顺磁性微球中加入370ml12%的乙醇-磷酸盐缓冲液（pH4.0），洗脱吸附的去甲万古霉素，洗脱液用0.5mol/L的NaOH溶液调pH8.5，静置，结晶完全，过滤、干燥，得到去甲万古霉素粗粉51g，含量为73.5%，收率为85.1%。

粗粉加100ml水溶解，注入装有50μmC8填料的色谱柱(DAC-80)，洗脱剂为15%的乙醇-磷酸盐缓冲液（pH4.0），根据色谱峰收集流出液，合并HPLC含量大于98.5%的流出液，用截留大小为300Da的卷式纳滤膜纳滤，补加去离子水脱去乙醇，至乙醇浓度小于1%，浓缩至去甲万古霉素浓度为200mg/ml，然后用0.5mol/L的盐酸调pH4.0，冷冻干燥，得到去甲万古霉素精粉28g，含量为99.6%，收率为74.4%。

实施例3

取去甲万古霉素发酵液5L，发酵单位为14960μg/ml，加入30μm的超顺磁性微球200g，搅拌吸附40分钟，吸附完毕，分离出发酵液中的超顺磁性微球，加入500ml水洗涤。

在超顺磁性微球中加入600ml15%的乙醇-磷酸盐缓冲液（pH4.2），洗脱吸附的去甲万古霉素，洗脱液用0.5mol/L的NaOH溶液调pH8.0，静置，结晶完全，过滤、干燥，得到去甲万古霉素粗粉86g，含量为74.7%，收率85.9%。

粗粉加200ml水溶解，注入装有40μmC8填料的色谱柱(DAC-80)，洗脱剂为13%的乙醇-磷酸盐缓冲液（pH4.2），根据色谱峰收集流出液，合并HPLC含量大于98.5%的流出液，用截留大小为500Da的卷式纳滤膜纳滤，补加蒸馏水脱去乙醇，至乙醇浓度小于1%，浓缩至去甲万古霉素浓度为180mg/ml，然后用0.5mol/L的盐酸调pH3.0，冷冻干燥，得到去甲万古霉素精粉48g，含量为99.3%，收率为74.2%。

对比例1

取去甲万古霉素发酵液300ml，发酵单位13720μg/ml。加入300ppm的聚丙烯酰胺絮凝剂2ml，搅拌30分钟，然后加入1mol/L的盐酸调pH值至3.5，过滤除去菌丝。滤液通入25ml的大孔树脂X-5柱（径高比为1：5）脱色后，再用25ml的大孔树脂D312柱（径高比为1：5）吸附，饱和树脂用50ml水洗涤后，用10%的乙醇-酸水（0.01%HCl）解吸，收集浓度大于100μg/ml的解吸液，解吸液用0.5mol/L的NaOH溶液调pH值至7.5，静置，结晶完全，过滤、干燥，得到去甲万古霉素粗粉4.0g，含量为73.2%，收率为71.1%。

粗粉加12ml水溶解，加样于聚合物微球UniPS25-300柱（装量为300ml）进行层析分离，先用5%的甲醇-水洗涤600ml，再用10%的甲醇-酸水（0.01%HCl）洗脱至去甲万古霉素解析完毕，分管收集解析液，根据HPLC检测结果合并解析液，解析液减压浓缩至15ml，搅拌下向浓缩液中加入960ml丙酮，静置，结晶完全，过滤，湿粉在45℃条件下真空干燥8小时，得到去甲万古霉素精粉2.1g，含量为98.4%，收率为70.6%。

对比例2

取去甲万古霉素发酵液3L，发酵单位14678μg/ml。加入400ppm的聚丙烯酰胺絮凝剂20ml，搅拌40分钟，然后加入1mol/L的盐酸调pH值至4.5，过滤除去菌丝。滤液通入250ml的大孔树脂X-5柱（径高比为1：5）脱色后，再用250ml的大孔树脂D312柱（径高比为1：5）吸附，饱和树脂用500ml水洗涤后，用8%的乙醇-酸水（0.01%HCl）解吸，收集浓度大于100μg/ml的解吸液，解吸液用0.5mol/L的NaOH溶液调pH值至8.0，静置，结晶完全，过滤、干燥，得到去甲万古霉素粗粉43g，含量为71.8%的，收率为70.1%。

粗粉加90ml水溶解，分3次用聚合物微球UniPS25-300柱（装量为1L）进行层析分离，先用5%的甲醇-水洗涤2L，再用15%的甲醇-酸水（0.01%HCl）洗脱至去甲万古霉素解析完毕，分管收集解析液，根据HPLC检测结果合并解析液，解析液减压浓缩至150ml，搅拌下向浓缩液中加入900ml丙酮，静置，结晶完全，过滤，湿粉在45℃条件下真空干燥10小时，得到去甲万古霉素精粉23g，含量为97.5%，收率为72.6%。

对比例3

取去甲万古霉素发酵液5L，发酵单位14960μg/ml。加入500ppm的聚丙烯酰胺絮凝剂30ml，搅拌1小时，然后加入1mol/L的盐酸调pH值至4.0，过滤除去菌丝。滤液通入400ml的大孔树脂X-5柱（径高比为2：5）脱色后，再用400ml的大孔树脂D312柱（径高比为2：5）吸附，饱和树脂用800ml水洗涤后，用12%的乙醇-酸水（0.01%HCl）解吸，收集浓度大于100μg/ml的解吸液，解吸液用0.5mol/L的NaOH溶液调pH值至8.5，静置，结晶完全，过滤、干燥，得到去甲万古霉素粗粉73g，含量为74.3%，收率为72.5%。

粗粉加150ml水溶解，分3次用聚合物微球UniPS25-300柱（装量为2L）进行层析分离，先用5%的甲醇-水洗涤4L，再用12%的甲醇-酸水（0.01%HCl）洗涤至去甲万古霉素解析完毕，分管收集解析液，根据HPLC检测结果合并解析液，解析液减压浓缩至380ml，搅拌下向浓缩液中加入3000ml丙酮，静置，结晶完全，过滤，湿粉在45℃条件下真空干燥12小时，得到去甲万古霉素精粉39.5g，含量为98.1%，收率为71.4%。

表1本技术粗提工艺与对比技术粗提工艺效果比较

从上表1可以看出，本工艺技术制备得到的粗粉收率在85%以上，较对比例平均提高13.2%，单批次粗提时间平均缩短约50小时，显著降低了人力、物力成本。

Claims (9)

1.一种去甲万古霉素的制备方法，包括以下步骤：

a、发酵液中加入超顺磁性微球，搅拌使其吸附完全，然后分离出超顺磁性微球；

b、将分离出的超顺磁性微球先用水洗，再用乙醇-酸性水溶液洗脱，得到含有去甲万古霉素的洗脱液，洗脱液结晶、过滤、干燥，得到去甲万古霉素粗粉；

c、粗粉加水溶解，注入装有C8填料的色谱柱，乙醇-酸性水溶液洗脱，收集HPLC纯度≥98.5%的制备液，纳滤浓缩、脱水干燥，得到去甲万古霉素产品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤a中所述超顺磁性微球的粒径为10-30μm，粒径分布为单分散，表面的功能基团为羧基基团。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤a中所述超顺磁性微球的用量为每升发酵液添加30-50g超顺磁性微球。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤b或c所述乙醇-酸性水溶液中酸性水溶液为磷酸-磷酸盐缓冲液，pH值为3.8-4.2，乙醇在溶液中的体积百分比为10-15%。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤b中所述乙醇-酸性水溶液用量为每克超顺磁性微球加入2.5-3毫升。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤b中所述洗脱液结晶为加入0.5mol/L的NaOH溶液调pH值至7.5-8.5。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤c中所述C8填料粒径为30-50μm。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤c中所述的纳滤浓缩，纳滤截留大小为200-500Da，浓缩液浓度为150-200mg/ml。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤c中所述脱水干燥，是将纳滤浓缩液用盐酸调pH3.0-4.0后，冷冻干燥。