KR102645011B1 - 고상 추출법을 이용한 타크롤리무스의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 불포화 알킬기(unsaturated alkyl group)를 가지는 락톤 화합물, 특히 타크롤리무스(FK506)의 공정품으로부터 화학구조는 유사하지만 불포화 알킬기가 없는 불순물, 특히 아스코마이신(FK520) 및 타크롤리무스의 프로필아나로그 등을 제거하여 고순도의 타크롤리무스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 타크롤리무스 공정품을 은 이온 수용액에 용해시킨 다음 은 이온과 결합하지 않는 유사 불순물들을 소량의 흡착수지를 활용하여 제거함으로써 고순도의 타크롤리무스를 높은 수율로 회수할 수 있는 경제적인 정제 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 미생물의 발효에 의해서 수득된 타크롤리무스에 포함된 특정 불순물을 고상 추출법을 이용하여 제거하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 자세히는 본 발명은 고가의 수지를 다량 사용하며 공정 시간이 길고 절차가 복잡한 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하지 않으면서도 효과적으로 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물, 특히 타크롤리무스와 구조 및 물성이 유사하고 포화 알킬기를 가진 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그 등으로부터 타크롤리무스를 분리, 정제하는 고상 추출법에 관한 것이다.
타크롤리무스(I)는 미생물인 스트렙토마이세스 종에 의하여 생성되는 트리사이클릭 마크로라이드계 락톤 화합물로서, 주로 장기이식후 거부반응을 줄이기 위한 면역억제제로 처방되고 있으며 중증 아토피성 피부염 치료제로도 활용되고 있다. 1987년 처음 보고된 (J. Antibiotics 16, No.9, 1249-1255, 1987) 이후, 1994년 미국 FDA로 부터 사용허가를 받은 의약품이며 여러 문헌에서 타크롤리무스의 정제방법이 제시되었다.
통상 미생물 배양으로 얻어지는 발효 산물에는 배지성분과 함께 다양한 대사 산물이 존재한다. 또한 타크롤리무스 생산 균주의 발효물에는 타크롤리무스와 구조적으로 유사한 물질들이 다량 포함되어 있으며, 이러한 불순물들이 제거되어야만 타크롤리무스를 의약품용으로 사용할 수 있다.
타크롤리무스(I)는 측쇄에 존재하는 이중결합 때문에 은 이온(Ag+)에 대한 결합력을 나타내지만, 타크롤리무스의 구조 유사체인 아스코마이신(II)과 타크롤리무스의 프로필아나로그(III)는 이중결합이 없기 때문에 은 이온과 결합하지 않는다 (J Chromatogr B Biomed Appl. 1995 Sep 15;671(1-2):197-222). 따라서 타크롤리무스 제조공정에서 화합물 (II) 즉, 아스코마이신과 화합물 (III) 즉, 타크롤리무스의 프로필아나로그를 제거하는 목적으로 은 이온이 응용되고 있으며 그 방법은 크게 세 가지로 구분지을 수 있다.
첫째 방법은 은 이온으로 전처리된 고정상을 사용하는 크로마토그래피 법이고 (US 6,492,513 B1; US 2008/0000834 A1; WO 2005/054253 A1; WO 2006/031664 A1; KR 859,670 B1), 두 번째 방법은 분리하고자 하는 화합물을 수지에 흡착시킨 후 은 이온이 포함된 이동상을 사용하는 크로마토그래피 법이다 (US 6,576,135 B1; US 6,881,341 B2; KR 1,022,067 B1; KR 10-2007-0083930 A1). 크로마토그래피 방법보다 간단한 세 번째 방법으로는 은 이온 수용액에서의 용해도 차이를 이용하여 이중결합이 없는 불순물을 추출하여 부유물로 제거하는 방법 (KR 910,165 B1; KR 1,033,845 B1)이 보고되어 있다.
위 방법들을 좀더 구체적으로 살펴보면, US 6,492,513 B1에는 설폰산 그룹-함유 양이온 교환수지에 은 이온을 전처리하여 이것을 고정상으로 사용하여 FK506, FK520 등의 화합물을 크로마토그래피로 분리하는 방법이 기술되어 있다.
또한, US 2008/0000834 A1에는 알루미늄 옥사이드(aluminum oxide), 지르코늄 옥사이드(zirconium oxide), 스티렌 다이비닐벤젠 코폴리머(styrene divinylbenzene copolymer), 흡착 수지, 양이온 교환수지, 음이온 교환수지, 역상 실리카겔, 시아노실리카겔을 은 이온으로 수식하여 고정상으로 사용하고 이동상으로는 물을 제외한 유기용매를 사용하는 크로마토그래피 법으로 FK506을 분리하는 방법이 개시되어 있다.
또한, WO 2005/054253 A1와 WO 2006/031664 A1에는 은 이온을 실리카겔 고정상에 처리하여 크로마토그래피하는 방법이 기술되어 있으며 그 실시 행태와 결과는 앞선 방법과 유사하다. KR 859,670 B1에도 실리카겔 또는 활성알루미나에 은 이온을 처리하는 유사한 시도가 있었다.
상기 기술된 크로마토그래피 정제방법들은 고가의 수지가 다량 필요하며, 은 이온 및 다량의 유기용매를 사용하기 때문에 제조 비용이 높으며, 용출 분획을 각각 분석한 후 일부 분획을 취하는 절차가 필요하기 때문에 공정 수행이 복잡하고 많은 시간이 필요하며, 정제 순도 및 수율이 높지 않다.
한편, US 6,576,135 B1과 US 6,881,341 B2는 하나 이상의 알케닐 그룹과 알콕시 그룹 측쇄를 가진 락톤 함유 고분자 화합물의 혼합물을 대상으로 하는 분리방법에 대한 내용으로, 화합물을 비이온성 흡착수지에 전부 흡착시키고 은 이온을 함유하는 용매로 용출시키는 FK506 정제 공정이 실시예에 개시되어 있다. 이 방법은 FK506의 수득율은 99.7%로 아주 높지만, FK520의 제거율이 80.8%로 미흡하며, 화합물 200 mg 정제시 200 mL(고정상 대비 시료의 사용량: 1%)의 비이온성 흡착수지를 고정상으로 사용하므로 많은 양의 흡착수지를 사용해야하는 단점이 있다. 또한 용리액으로 0.294 M의 질산은(AgNO3)을 포함한 50% (v/v) 아세톤 수용액을 사용하기 때문에 질산은의 회수비용 및 아세톤의 소모량이 무시할 수 없다는 단점이 있다.
KR 1,022,067 B1도 이와 흡사한 방법을 개시하였으며 KR 10-2007-0083930 A1에도 이들과 유사한 방법이 개시되어 있으나 크로마토그래피 고정상으로 고가의 C18 역상 실리카겔을 사용하지만, 대신 비교적 적은 부피의 고정상(고정상 대비 시료의 사용량: 5~8%)을 필요로 한다는 장점을 개시하였다. KR 910,165 B1과 KR 1,033,845 B1에서 개시된 질산은 수용액에서의 용해도 차이를 이용한 정제방법도 유용한 기술로 활용될 수 있지만 불순물 (II) 의 농도가 0.1% 이하로 낮은 고순도의 FK506 제품을 제조하기는 어렵다는 결점이 있다.
Dobson G et al., J Chromatogr B Biomed Appl. 1995 Sep 15;671(1-2):197-222. doi: 10.1016/0378-4347(95)00157-e. PMID: 8520692,
Kino T et al., J Antibiot (Tokyo). 1987 Sep;40(9):1249-55. doi: 10.7164/antibiotics.40.1249. PMID: 2445721,
Ferraboschi et al., J Antibiot 65, 349-354 (2012). https://doi.org/10.1038/ja.2012.28,
EUROPEAN PHARMACOPOEIA 11.0, TACROLIMUS MONOHYDRATE,
Badawy et al., ANAL. SCI. 38, 1457-1487 (2022). https://doi.org/10.1007/s44211-022-00190-8.
통상적으로 활용되는 FK506 의약품에 포함된 FK520의 함량은 0.5% 이하로 제조되고 있는 반면(EUROPEAN PHARMACOPOEIA 11.0, TACROLIMUS MONOHYDRATE), FK506 고순도 제품은 0.1% 이하의 FK520이 포함된 것으로 보고되어 있다[Evaluation, synthesis and characterization of tacrolimus impurities. The Journal of Antibiotics (2012) 65, 349-354].
이러한 고순도 FK506 제품을 제조하기 위해서는, 배경기술에서 설명된 바와 같이 은 이온을 이용한 크로마토그래피 공정이 필수적으로 활용되어 왔으나 본 발명자들은 기존 기술의 단점들이 개선된 좀 더 경제적이고 환경친화적인 공정을 개발하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 위와 같은 과제를 해결하기 위하여 다양한 공정 조건들을 검토하였고 다음과 같은 특징을 가지는 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 특징은 (1) 아스코마이신 및 타크롤리무스의 프로필아나로그 불순물의 농도를 0.1% 미만의 낮은 농도로 제공하며, (2) 80% 이상의 고수율로 FK506을 회수할 수 있으며, (3) 고정상으로 사용되는 흡착수지의 사용량이 적고, (4) 크로마토그래피 작업을 수행하며 분획을 분석하는 복잡한 절차를 회피하고, (5) 유기용매의 사용을 최소화하며, (6) 공정의 부피가 적고 은 이온(Ag+)의 재활용이 용이하다.
본 발명자들은 크로마토그래피를 대체할 수 있는 고상 추출법(Solid-phase extraction)의 응용가능성에 주목하였다. 특히 생산물 중 다수를 차지하는 FK506은 고정상에 흡착시키지 않고 약 1% 내지 10%의 미량으로 존재하는 FK520(II)과 타크롤리무스의 프로필아나로그(III)만을 고정상에 흡착시킬수 있는 조건 즉, FK506은 은 이온 수용액 상에서 은 이온과 결합하여 고정상에 대하여 낮은 흡착능을 가지는 반면 FK520과 타크롤리무스의 프로필아나로그는 높은 흡착능이 유지되어, 세가지 물질이 고정상과 접촉할 때 FK520과 타크롤리무스의 프로필아나로그는 고정상에 강하게 흡착되고 FK506은 흡착되지 않거나 약하게 흡착되는, 선택적인 흡착 성능을 가지는 고상 추출법을 착안하였다.
또한 기존의 유사한 공정들은 크로마토그래피 용리액으로 약 50% 정도의 고농도 아세톤을 사용하였는데 높은 농도의 유기용매 조건에서는 흡착된 불순물 즉, FK520과 타크롤리무스의 프로필아나로그가 용리되는 현상이 나타나기 때문에 본 발명자들은 이동상의 용매조건도 불순물이 용리되지 않는 조건을 찾아내었다.
또한, 본 발명자들은 질산은 용액 내의 모든 (II), (III) 불순물들이 소량의 고정상에 충분히 접촉하여 흡착될 수 있도록 용액 전체를 고정상 컬럼에 10회 이상 통과시키는 재순환 공정을 착안하였다.
고상 추출법은 시료에 있는 물질을 선택적으로 추출하여 그 농도를 측정하는 분석적인 목적으로 흔히 사용되고 있으며(ANAL. SCI. 38, 1457-1487, 2022) 액-액 추출법 (liquid-liquid extraction)이나 크로마토그래피 법에 비해 공정이 대단히 간단하고 경제적이기 때문에 그 활용분야가 다양하지만 은 이온(Ag+)과 함께 활용되어 고순도의 FK506을 정제하기 위한 공정으로는 이전에 보고된 바가 없다.
본 발명은 물과 혼합될 수 있고 락톤 화합물이 용해되는 유기용매 (1)에 락톤 화합물을 녹인 후 은 이온 (Ag+) 수용액과 혼합하는 1 단계;
상기 1 단계에서 제조된 혼합 용액을 비이온성 수지에 반복적으로 통과시킴으로써 락톤 화합물 중에서 불포화 알킬기를 가지지 않은 물질들은 전량 수지에 흡착시키고 불포화 알킬기를 가진 성분은 은 이온의 도움으로 수지에 흡착되지 않고 통과하여 회수되는 고상 추출법을 실시하는 2 단계;
물과 난 혼합성이지만 락톤 화합물에 대한 용해성이 높은 유기용매 (2)를 처리하여 회수된 은 이온 수용액에 존재하는 고순도 락톤 화합물을 액-액 추출하고 분리하는 3 단계; 및
상기 3 단계에서 회수된 은 이온 수용액을, 2 단계에 사용된 고상추출용 수지에 반복적으로 통과시킴으로써 수지 속에 잔류하는 불포화 알킬기를 가진 성분을 추가적으로 회수하고, 유기용매 (2)로 액-액 추출하여 분리하는 4 단계;를 포함하는 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물을 제거하는 타크롤리무스 정제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 포화 알킬기를 가진 락톤 화합물이 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그, 에버롤리무스, 피메크로리무스 및 라파마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하며 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물이 타크롤리무스인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 1단계의 물과 혼합될 수 있고 락톤 화합물이 용해되는 유기용매 (1)은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 아세톤, 에탄올, 메탄올, 이소프로필알콜 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 1 단계에서 사용하는 은 이온이 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 질산은(AgNO3), 초산은(AgCH3COO) 및 황산은(AgSO4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 2 단계에서 사용하는 흡착 수지가 폴리스티렌/디비닐벤젠(polystyrene/divinylbenzene), 폴리디비닐벤젠(polydivinylbenzene), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 폴리메타크릴레이트/디비닐벤젠(polymethacrylate crosslinked with divinylbenzene), 알리파틱폴리머(crosslinked aliphatic polymer) 계열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 3 단계 및 4 단계에서 액-액 추출 시 사용하는, 물과 난 혼합성이지만 락톤 화합물에 대한 용해성이 높은 유기용매 (2)는 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 다이클로로메탄, 에틸아세테이트, 이소부틸아세테이트, n-부틸아세테이트 및 t-부틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 2 단계에 고상추출 시 사용하는 흡착 수지의 양은 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 타크롤리무스 조정제 시료량 대비 0.1~5배 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법에 관한 것이다. 흡착 수지 사용량은 시료에 포함되어 있는 포화 알킬기를 가지는 불순물의 양에 비례하여 사용 가능하나 시료 대비 적은 양의 흡착 수지를 사용할 경우(<0.1배) 불순물 제거율이 감소하며, 과량을 사용할 경우(>5배) 타크롤리무스 수율 감소 및 원가 상승을 초래할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 2 단계에 흡착 수지를 사용한 고상추출 시 투입되는 은 이온 혼합 용액의 유기용매(1) 농도는 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 5~30(v/v)% 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법에 관한 것이다. 은 이온 혼합 용액 제조 시 유기용매(1)을 사용한 조정제 시료의 용해가 필수적이며 유기용매(1)의 농도가 낮을 경우(<5%) 조정제 시료의 유기용매(1)에 대한 용해도 문제로 인하여 충분한 양의 시료 용해가 불가하며 수율 또한 감소하는 경향을 나타낸다. 반면 유기용매(1)의 농도가 높을 경우(>30%) 포화 알킬기를 가지는 불순물이 흡착 수지로부터 용리되는 현상이 발생하여 불순물 제거율 감소를 야기한다.
본 발명의 방법을 단계별로 자세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 락톤 화합물들은 단일환(monocyclic), 이환(bicyclic) 또는 삼환 고리(tricyclic ring)를 가질 수 있으며, 단일환 락톤 화합물로는 에리쓰로마이신, 류코마이신, 메티마이신 등을 들 수 있으며, 삼환 고리 구조 락톤 화합물로는 도 1에 나타낸 화학식의 R기가 알릴기, 에틸기, 프로필기로 각각 표시되는 타크롤리무스, 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그가 될 수 있다.
상기 락톤 화합물의 불포화 알킬기는 특별히 저급 알케닐기(lower alkenyl group)로서, 비닐기, 프로페닐기(알릴기 또는 1-프로페닐기), 부테닐기, 이소부테닐기, 펜테닐기, 헥세닐기 등과 같은 것이며 더욱 바람직하게는 비닐기와 프로페닐기이다. 상기 락톤 화합물의 포화 알킬기는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 펜틸기, 헥실기 등과 같은 것이며 더욱 우선하게는 에틸기와 프로필기이다.
락톤 화합물을 용해시킬 수 있고 동시에 물과 혼합 가능한 용매는 알콜, 케톤 또는 극성 비양자성 유기용매(dielectric aprotic solvent)가 될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜, 아세톤, 아세토니트릴이 선택될 수 있으며, 이들의 2종 이상의 혼합물이 될 수 있다.
상기 단계에서 유기 용매에 용해하는 락톤 화합물의 농도는 조절 가능하며, 예를 들어 타크롤리무스 및 그 구조 유사 물질의 경우 100 ~ 300 g/유기용매(ℓ) 범위이며, 용매로는 아세톤이 좀 더 바람직하다. 락톤 화합물의 농도가 낮을 경우(<100 g/L) 시료 대비 처리하는 은 이온 수용액의 농도가 높으므로 원가 절감 효과가 감소하며, 락톤 화합물의 농도가 높을 경우(>300 g/L) 포화 알킬기를 가진 불순물의 제거 효과 및 수율이 감소하는 경향을 나타낸다.
상기 단계에서 사용된 은 이온 수용액은 질산은(AgNO3), 초산은(AgCH3COO) 및 황산은(AgSO4)과 같이 은 이온을 공급할 수 있는 다양한 은 염을 다양한 농도로 사용할 수 있고, 바람직하게는 3~5 mol/ℓ의 범위에서 정제수에 용해하여 사용할 수 있다. 시료에 포함되어 있는 타크롤리무스가 모두 은 이온과 결합할 수 있는 정도의 은 이온 수용액을 처리해야 하며 타크롤리무스 대비 질산은의 몰비가 약 1:100일 경우가 적절한 것으로 확인되었다. 은 이온 수용액의 농도가 낮을 경우(<3 mol/L) 수율이 감소하며, 농도가 높을 경우(>5 mol/L) 원가 상승을 야기할 수 있다.
상기 단계에서 사용된 흡착 수지는 중합성 단량체 종류에 따라 폴리스티렌/디비닐벤젠(polystyrene/divinylbenzene), 폴리디비닐벤젠(polydivinylbenzene), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 폴리메타크릴레이트/디비닐벤젠(polymethacrylate crosslinked with divinylbenzene), 알리파틱폴리머(crosslinked aliphatic polymer) 계열일 수 있다. 흡착 수지의 입자 크기는 10~1200 μm 범위에서 선택될 수 있으며, 흡착 수지의 공극 크기는 50~600 Å 범위에서 선택될 수 있다. 입자 크기와 공극 크기가 상기 범위 내일 때 불포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물의 정제 효율이 현저하다.
본 발명에서 사용한 시료로서 락톤 화합물은 통상적인 미생물 발효에 의하여 수득되는 화합물로서 불포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물인 타크롤리무스와 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물인 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그 등이 혼합된 화합물을 사용하였다.
상기 시료를 사용하여 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물의 제거를 위한 고상 추출법을 제시한 본 발명은 산업적 적용이 쉬운 비교적 간단한 공정으로 적은 양의 수지를 사용하여 제조 원가를 경감시킴과 더불어 서로 다른 불순물 함량을 가지는 정제 중간체들을 타겟으로 다양하게 적용이 가능하다. 최종적으로 본 발명을 통하여 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물인 아스코마이신 및 타크롤리무스의 프로필아나로그 불순물의 함량을 0.1% 미만으로 제거 가능하며 동시에 80% 이상의 고수율로 타크롤리무스의 회수가 가능함을 제시하였다.
본 발명의 정제방법은 고상 추출법을 사용하기 때문에 기존에 보고된 컬럼 크로마토그래피 방법보다 산업적 적용이 용이하다.
본 발명의 방법에 의하면 최종 정제 산물 중 아스코마이신 및 타크롤리무스의 프로필아나로그 불순물의 농도를 0.1% 미만으로 낮출 수 있고, 80% 이상의 고수율로 FK506을 회수할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의하면 고정상으로 사용되는 흡착수지의 사용량이 적고, 유기용매의 사용을 최소화할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법을 적용하면 공정의 부피가 적고 은 이온의 재활용이 용이하기 때문에 고순도 FK506을 제조하는데 있어서 정제시간과 제조원가를 크게 경감할 수 있고, 아울러 고순도 FK506의 생산성을 현저히 높이는 효과를 거둘 수 있다.
도 1은 불포화 알킬기를 가지는 타크롤리무스와 포화 알킬기를 가지는 아스코마이신 및 타크롤리무스의 프로필아나로그의 구조를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 제안하는 고상 추출법을 모식화한 도면이다. 조정제 시료가 혼합되어 있는 은 이온 수용액을 고정상 컬럼에 10회 이상 통과시키는 재순환 공정을 수행하여 시료에 포함되어 있는 포화 알킬기를 가지는 불순물인 FK520과 타크롤리무스의 프로필아나로그를 효과적으로 제거할 수 있다.
도 2는 본 발명에서 제안하는 고상 추출법을 모식화한 도면이다. 조정제 시료가 혼합되어 있는 은 이온 수용액을 고정상 컬럼에 10회 이상 통과시키는 재순환 공정을 수행하여 시료에 포함되어 있는 포화 알킬기를 가지는 불순물인 FK520과 타크롤리무스의 프로필아나로그를 효과적으로 제거할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
실시예 1: 조정제 시료 준비
타크롤리무스를 생산하기 위한 발효 및 정제 기술은 이미 여러 문헌을 통하여 보고된 바 있다(KR 910,165 B1; KR 1,033,845 B1). 따라서 본 발명에서 사용된 알킬기 측쇄가 있는 락톤 화합물, 특히 타크롤리무스, 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그의 혼합액은 기존에 보고되어 있는 통상적인 스트렙토마이세스 속 균주의 발효 배양 및 정제 기술을 기반으로 제조하였다. 락톤 화합물 혼합액 내 포화 알킬기를 가지는 불순물, 특히 아스코마이신 및 타크롤리무스의 프로필아나로그의 제거 효과를 확인하기 위하여 서로 다른 함량의 불순물이 포함된 세가지 시료를 제조하였다. 시료(1)은 90.2% 타크롤리무스, 3.91% 아스코마이신, 2.53% 타크롤리무스의 프로필아나로그를 함유하고 있으며, 시료(2)는 94.8% 타크롤리무스, 0.27% 아스코마이신, 0% 타크롤리무스의 프로필아나로그, 그리고 시료(3)은 98.0% 타크롤리무스, 0.14% 아스코마이신, 0% 타크롤리무스의 프로필아나로그를 함유하고 있었다.
실시예 2: 분석법
타크롤리무스와 그 유사체들의 함량 및 순도 분석에는 Eclipse XDB C8(4.6x150 mm, 5 um) 컬럼을 사용한 HPLC 분석법(이동상, 40~54% 아세토니트릴; 유속, 2 ml/min; 주입량, 10 ul; 컬럼 온도, 60℃; 검출 파장, 210 nm)을 사용하였다..
실시예 3: 흡착 수지를 이용한 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물 제거 - 시료(1)
실시예 1에서 제조된 타크롤리무스, 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그를 함유하는 혼합물 시료(1) 0.5 g을 아세톤에 용해하여 2.22 ml의 아세톤 용해액을 준비하였다. 12.23 g의 질산은을 정제수에 용해하여 20 ml의 3.6 M 질산은 수용액을 제조한 후 아세톤 용해액과 혼합하고 200 rpm으로 1시간 동안 교반하여 10%(v/v) 아세톤 농도의 은 이온 수용액 내에서 은 이온과 불포화 알킬기를 가지는 타크롤리무스의 결합을 유도하였다. 이때 아세톤 용해액 속의 고농도 락톤화합물이 질산은 수용액과 혼합되며 석출물이 형성됨을 확인하였다. HPLC 분석 결과, 석출물에는 12.3% 아스코마이신, 11.2% 타크롤리무스의 프로필아나로그가 포함되어 있음이 확인되었으며 이를 통하여 용해액 내 포화 알킬기를 가지는 불순물의 일차적인 제거가 가능하였다. 상기 석출물이 제거된 은이온 수용액에는 1.82% 아스코마이신, 0.51% 타크롤리무스의 프로필아나로그가 함유되어 있었으며 수율은 66.2%로 확인되었다. 투입된 시료(1)과 동일한 양인 0.5 g의 폴리스티렌/디비닐벤젠 계열 흡착 수지인 디아이온 HP-20(상표명, 일본 소재 미츠비시 케미칼 코포레이션사 제조)을 컬럼(15x140 mm)에 채우고 수지 세척 및 10%(v/v) 아세톤 용액으로 평형화한 후 페리스탈틱 펌프를 이용하여 3.4 ml/min의 유속으로 상기 은 이온 수용액을 20회 반복 통액시켰다. 통액 완료 후 은 이온 수용액에 존재하는 타크롤리무스 및 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그의 함량은 C8 HPLC로 분석하였다. HP-20 흡착 수지 통액 전 은 이온 수용액의 포화 알킬기를 가지는 불순물인 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그의 함량은 각각 1.82%, 0.51%였으나 통액 후 회수된 은 이온 수용액 내 동일 불순물의 함량은 0.82% 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그 미검출로 감소되었으며 수율은 79.4%로 확인되었다(표 1). 결론적으로 원시료 내 포화 알킬기를 가지는 불순물, 특히 아스코마이신 및 타크롤리무스의 프로필아나로그의 함량이 비교적 높은 경우 석출에 의한 일차적인 불순물 제거 후 고상 추출법을 이용한 불순물 추가 제거가 가능하였다.
| 실시예 3 |
아스코마이신
(%) |
타크롤리무스의 프로필아나로그
(%) |
타크롤리무스
누적 수율 (%) |
| 시료(1) | 3.91 | 2.53 | 100 |
| 석출물 | 12.3 | 11.2 | no data |
| 석출물 제거 후 은 이온 수용액 |
1.82 | 0.51 | 66.2 |
| HP-20 처리 후 은 이온 수용액 |
0.82 | 0.0 | 52.5 |
실시예 4: 흡착 수지를 이용한 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물 제거 - 시료(2)
실시예 1에서 제조된 타크롤리무스, 아스코마이신을 함유하는 혼합물 시료(2) 0.5 g을 아세톤에 용해하여 2.22 ml의 아세톤 용해액을 준비하였다. 12.23 g의 질산은을 정제수에 용해하여 20 ml의 3.6 M 질산은 수용액을 제조한 후 아세톤 용해액과 혼합하고 200 rpm으로 1시간 동안 교반하여 은 이온과 불포화 알킬기를 가지는 타크롤리무스의 결합을 유도하였다. 본 공정에서 시료(2)의 경우 시료(1) 대비 포화 알킬기를 가지는 아스코마이신 및 타크롤리무스의 프로필아나로그의 함량이 크게 낮으며 이에 따라 실시예 3에서와 같은 석출물의 형성은 확인할 수 없었다. 투입된 시료(2)와 동일한 양인 0.5 g의 폴리메타크릴레이트 계열 흡착 수지인 PCG950M(상표명, 퓨로라이트사 제조)을 컬럼(15x140 mm)에 채우고 수지 세척 및 10%(v/v) 아세톤 용액으로 평형화한 후 페리스탈틱 펌프를 이용하여 3.4 ml/min의 유속으로 은 이온 수용액을 20회 반복 통액시켰다. 통액 완료 후 은 이온 수용액에 존재하는 타크롤리무스 및 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그의 함량은 C8 HPLC로 분석하였다. PCG950M 흡착 수지 통액 전 시료(2)의 포화 알킬기를 가지는 불순물인 아스코마이신의 함량은 0.27%였으나 통액 후 회수된 은 이온 수용액 내 동일 불순물의 함량은 0.13%로 감소되었으며 수율은 85.1%로 확인되었다(표 2).
| 실시예 4 |
아스코마이신
(%) |
타크롤리무스의 프로필아나로그
(%) |
타크롤리무스
수율 (%) |
| 시료(2) | 0.27 | 0.0 | 100 |
| PCG950M 처리 후 은 이온 수용액 |
0.13 | 0.0 | 85.1 |
실시예 5: 흡착 수지를 이용한 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물 제거 - 시료(3)
실시예 1에서 나타낸 방법으로 제조된 타크롤리무스, 아스코마이신을 함유하는 혼합물 시료(3) 0.5 g을 아세톤에 용해하여 2.22 ml의 아세톤 용해액을 준비하였다. 12.23 g의 질산은을 정제수에 용해하여 20 ml의 3.6 M 질산은 수용액을 제조한 후 아세톤 용해액과 혼합하고 200 rpm으로 1시간 동안 교반하여 은 이온과 불포화 알킬기를 가지는 타크롤리무스의 결합을 유도하였다. 본 실시예에서는 중합성 단량체 종류, 입자 및 공극 크기가 서로 다른 총 13종의 흡착 수지를 사용하였으며 그 목록은 표 3에 정리하였다. 상기 종류별 흡착 수지 0.5 g을 컬럼(15x140 mm)에 채우고 수지 세척 및 10%(v/v) 아세톤 용액으로 평형화한 후 페리스탈틱 펌프를 이용하여 3.4 ml/min의 유속으로 은 이온 수용액을 20회 반복 통액시켰다. 통액 완료 후 은 이온 수용액에 존재하는 타크롤리무스 및 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그의 함량은 C8 HPLC로 분석하였다. 흡착 수지 통액 전 시료(3)의 포화 알킬기를 가지는 불순물인 아스코마이신의 함량은 0.14%였으며 종류별 흡착 수지의 통액 후 회수된 은 이온 수용액 내 동일 불순물의 함량 및 수율 결과는 표 3에 정리하였다. 표 3의 결과에서 폴리스티렌/디비닐벤젠 계열 흡착 수지를 사용한 경우 모든 최종 시료 내 아스코마이신 함량이 0.1% 미만으로 감소하였으며 특히 입자 크기가 가장 작은 EPRUI-PSD40 수지를 사용한 경우 아스코마이신이 모두 제거됨과 더불어 수율 또한 83.2%로 가장 높게 나타났다. 상기 결과와 동일하게 작은 입자 크기를 가진 폴리디비닐벤젠 계열 수지 중 PCG1200M, 폴리메타크릴레이트 계열 수지 중 PCG950M 수지를 사용한 경우 아스코마이신이 모두 제거되고 각 계열 수지 중 가장 높은 수율을 보였다.
| 실시예 5 |
아스코마이신
(%) |
타크롤리무스의 프로필아나로그
(%) |
타크롤리무스
수율 (%) |
Particle size
(μm) |
Pore diameter
(Å) |
제조사 | Polymer | |
| 시료(3) | 0.14 | 0.0 | 100 | |||||
| 사용된 수지 | EPRUI-PSD40 | 0.0 | 0.0 | 83.2 | 40 | 300 | EPRUI Biotech | PS/DVB |
| PCG1200M | 0.0 | 0.0 | 83.0 | 50~100 | 300~500 | Purolite | DVB | |
| PCG950M | 0.0 | 0.0 | 82.1 | 50~100 | 150~300 | Purolite | PMA | |
| PCG900M | 0.0 | 0.0 | 80.2 | 50~100 | 150~300 | Purolite | DVB | |
| HP-20SS | 0.0 | 0.0 | 78.6 | 63~150 | 290 | Mitsubishi Chemical | PS/DVB | |
| EPRUI-PSD65 | 0.0 | 0.0 | 77.9 | 65 | 300 | EPRUI Biotech | PS/DVB | |
| CG161M | 0.0 | 0.0 | 77.1 | 75 | 150 | DuPont | PS/DVB | |
| HP-20 | 0.07 | 0.0 | 80.3 | >250 | 580 | Mitsubishi Chemical | PS/DVB | |
| HP-2MG | 0.09 | 0.0 | 80.0 | 297~707 | 170 | Mitsubishi Chemical | PMA | |
| PAD600 | 0.10 | 0.0 | 81.8 | 300~1200 | 90 | Purolite | DVB | |
| XAD7HP | 0.10 | 0.0 | 80.7 | 430~690 | 550 | DuPont | CAP | |
| PAD950C | 0.10 | 0.0 | 80.4 | 425~1200 | 120 | Purolite | PMA | |
| PAD610 | 0.10 | 0.0 | 80.3 | 350~1200 | 300 | Purolite | PMA/DVB | |
| DVB: Divinylbenzene PMA: Polymethacrylate PS/DVB: Polystyrene crosslinked with divinylbenzene PMA/DVB: Polymethacrylate crosslinked with divinylbenzene CAP: Crosslinked aliphatic polymer |
||||||||
실시예 6: 은 이온 수용액 재사용을 통한 흡착 수지에 결합된 타크롤리무스 회수
실시예 5에서 PS/DVB 계열 EPRUI-PSD40 흡착 수지를 사용하여 흡착 수지 공정 완료 후 얻어진, 타크롤리무스를 함유한 은 이온 수용액에, 1배 부피의 에틸아세테이트 첨가 후 10분 동안 강하게 혼합하고 분별 깔대기를 이용하여 1시간 동안 정치하여 층 분리를 유도하였다. 타크롤리무스가 포함된 에틸 아세테이트 층(상층)은 분리하여 보관하고, 은 이온 수용액만 회수하여 포화 알킬기 불순물 제거 공정에 사용된 흡착 수지에 페리스탈틱 펌프를 이용하여 3.4 ml/min의 유속으로 20회 반복 통액시켰다. 통액 완료 후 은 이온 수용액에 존재하는 타크롤리무스 및 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그의 함량은 C8 HPLC로 분석하였다. EPRUI-PSD40 흡착 수지 통액 전 시료(3)의 아스코마이신의 함량은 0.14%였으나 통액 후 회수된 은 이온 수용액 [시료(4)] 내 동일 불순물은 모두 제거되었으며 수율은 83.2%로 확인되었다. 에틸아세테이트 층분리를 통하여, 타크롤리무스가 제거된 은 이온 수용액을 흡착 수지에 다시 통액시켜, 흡착 수지 내 잔류 타크롤리무스의 회수를 진행하였으며, 10.9%의 타크롤리무스가 추가적으로 용출됨을 확인하였다 [시료(5)]. 이로써 94.1%의 전체 공정 수율을 나타냄을 확인하였다 (표 4).
| 실시예 6 |
아스코마이신
(%) |
타크롤리무스의 프로필아나로그
(%) |
타크롤리무스
누적 수율 (%) |
| 시료(3) | 0.14 | 0.0 | 100 |
| EPRUI-PSD40 처리 후 은 이온 수용액 [시료(4)] |
0.0 | 0.0 | 83.2 |
| 흡착 수지 용리 후 은 이온 수용액 [시료(5)] |
0.0 | 0.0 | 94.1 |
본 발명을 통하여 불포화 알킬기를 가지는 타크롤리무스와 포화 알킬기를 가지는 구조 유사체 불순물을 분리하기 위한 고상 추출법 적용 시 예상 밖의 효과를 얻었다. 본 발명의 분리 방법은 기존에 보고된 컬럼 크로마토그래피 방법보다 산업적 적용이 쉬우며 흡착 수지 및 유기용매의 사용을 최소화함으로써 경제적이고 환경 친화적인 공법을 제공한다. 그러므로 본 발명은 고순도의 타크롤리무스 의약원료품 대량 생산 산업에 적용할 수 있다.
Claims (12)
1) 물과 혼합될 수 있고 락톤 화합물이 용해되는 유기용매(1)에 락톤 화합물을 녹인 후 은 이온 (Ag+) 수용액(1)과 혼합하고 교반하는 1 단계;
2) 1 단계에서 제조된 은 이온 혼합 용액의 상청액을 고상 추출용 비이온성 수지에 반복적으로 통과시킴으로써 락톤 화합물 중에서 불포화 알킬기를 가지지 않은 성분은 입자 크기 250 μm 이하의 고상 추출용 비이온성 수지에 흡착시키고 불포화 알킬기를 가진 성분은 은 이온 혼합 용액에 용해되어 고상 추출용 비이온성 수지에 흡착되지 않고 통과하여 회수되는 고상 추출법을 실시하는 2 단계;
3) 물과 난혼합성이지만 락톤 화합물에 대한 용해성이 높은 유기용매(2)를 상기 2 단계에서 회수된 은 이온 혼합 용액에 처리하여 은 이온 혼합 용액에 존재하는 락톤 화합물을 액-액 추출하고 분리하는 3 단계; 및
4) 3 단계에서 회수된 은 이온 수용액(2)을 2 단계에 사용된 고상 추출용 비이온성 수지에 반복적으로 통과시킴으로써 고상 추출용 비이온성 수지 속에 잔류하는 불포화 알킬기를 가진 성분을 추가로 회수하고, 회수한 은 이온 수용액(3)에 물과 난혼합성이지만 락톤 화합물에 대한 용해성이 높은 유기용매(2)를 가하여 액-액 추출하여 분리하는 4 단계;를 포함하는 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
2) 1 단계에서 제조된 은 이온 혼합 용액의 상청액을 고상 추출용 비이온성 수지에 반복적으로 통과시킴으로써 락톤 화합물 중에서 불포화 알킬기를 가지지 않은 성분은 입자 크기 250 μm 이하의 고상 추출용 비이온성 수지에 흡착시키고 불포화 알킬기를 가진 성분은 은 이온 혼합 용액에 용해되어 고상 추출용 비이온성 수지에 흡착되지 않고 통과하여 회수되는 고상 추출법을 실시하는 2 단계;
3) 물과 난혼합성이지만 락톤 화합물에 대한 용해성이 높은 유기용매(2)를 상기 2 단계에서 회수된 은 이온 혼합 용액에 처리하여 은 이온 혼합 용액에 존재하는 락톤 화합물을 액-액 추출하고 분리하는 3 단계; 및
4) 3 단계에서 회수된 은 이온 수용액(2)을 2 단계에 사용된 고상 추출용 비이온성 수지에 반복적으로 통과시킴으로써 고상 추출용 비이온성 수지 속에 잔류하는 불포화 알킬기를 가진 성분을 추가로 회수하고, 회수한 은 이온 수용액(3)에 물과 난혼합성이지만 락톤 화합물에 대한 용해성이 높은 유기용매(2)를 가하여 액-액 추출하여 분리하는 4 단계;를 포함하는 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물은 타크롤리무스인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물은 타크롤리무스인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 락톤 화합물 중에서 불포화 알킬기를 가지지 않은 물질은 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그, 에버롤리무스, 피메크로리무스 및 라파마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 락톤 화합물 중에서 불포화 알킬기를 가지지 않은 물질은 아스코마이신, 타크롤리무스의 프로필아나로그, 에버롤리무스, 피메크로리무스 및 라파마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 1 단계의 물과 혼합될 수 있고 락톤 화합물이 용해되는 유기용매(1)은 아세톤, 에탄올, 메탄올, 이소프로필알콜 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 1 단계의 물과 혼합될 수 있고 락톤 화합물이 용해되는 유기용매(1)은 아세톤, 에탄올, 메탄올, 이소프로필알콜 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 1 단계에서 사용하는 은 이온은 질산은(AgNO3), 초산은(AgCH3COO) 및 황산은(AgSO4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 1 단계에서 사용하는 은 이온은 질산은(AgNO3), 초산은(AgCH3COO) 및 황산은(AgSO4)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 물과 난 혼합성이지만 락톤 화합물에 대한 용해성이 높은 유기용매(2)는 다이클로로메탄, 에틸아세테이트, 이소부틸아세테이트, n-부틸아세테이트 및 t-부틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 물과 난 혼합성이지만 락톤 화합물에 대한 용해성이 높은 유기용매(2)는 다이클로로메탄, 에틸아세테이트, 이소부틸아세테이트, n-부틸아세테이트 및 t-부틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 1 단계에서 유기용매(1)에 용해하는 락톤 화합물의 농도는 100~300 g/L 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 1 단계에서 유기용매(1)에 용해하는 락톤 화합물의 농도는 100~300 g/L 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 1 단계 및 3 단계에서 사용하는 은 이온 수용액의 농도는 3~5 mol/L 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 1 단계 및 3 단계에서 사용하는 은 이온 수용액의 농도는 3~5 mol/L 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 2 단계의 고상 추출용 비이온성 수지의 양은 타크롤리무스 조정제 시료량 대비 0.1~5배 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 2 단계의 고상 추출용 비이온성 수지의 양은 타크롤리무스 조정제 시료량 대비 0.1~5배 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 2 단계의 비이온성 수지를 사용한 고상 추출 단계에서 투입되는 은 이온 혼합 용액의 유기용매(1) 농도는 5~30(v/v)% 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 2 단계의 비이온성 수지를 사용한 고상 추출 단계에서 투입되는 은 이온 혼합 용액의 유기용매(1) 농도는 5~30(v/v)% 범위인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 2 단계에서 고상 추출용 비이온성 수지는, 폴리스티렌/디비닐벤젠, 폴리디비닐벤젠, 폴리메타크릴레이트, 폴리메타크릴레이트/디비닐벤젠 또는 알리파틱폴리머를 기질로 하는 것인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 2 단계에서 고상 추출용 비이온성 수지는, 폴리스티렌/디비닐벤젠, 폴리디비닐벤젠, 폴리메타크릴레이트, 폴리메타크릴레이트/디비닐벤젠 또는 알리파틱폴리머를 기질로 하는 것인, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 1 단계 이후 2 단계 이전에 포화 알킬기를 가지는 화합물을 포함하는 석출물을 제거하는 단계;가 추가되는 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
상기 1 단계 이후 2 단계 이전에 포화 알킬기를 가지는 화합물을 포함하는 석출물을 제거하는 단계;가 추가되는 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제 방법.
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| KR1020230138638A KR102645011B1 (ko) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 고상 추출법을 이용한 타크롤리무스의 정제방법 |
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Citations (9)
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|---|---|---|---|---|
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