FK506은 스트렙토마이세스 종의 발효에 의해 생성되는 삼원환 마크로라이드이다. FK506은 면역억제활성을 가지는 마크로라이드계 락톤 화합물로서, 장기 이식, 신생아 적아구증(Rh hemolytic disease) 예방 및 자기면역질환, 감염성 질환 등의 치료에 사용된다. FK506은 1987년 처음 보고되었고(J. Antibiotics, 16, No.9, 1249-1255,1987) 아스텔라스 제약에서 판매 중인 화합물이다. 개발 이후 여러 논문 및 특허에서 FK506의 다양한 분리 및 정제 방법이 제시되었다.
통상 미생물 배양으로 얻어지는 발효 산물은 배양액에 배양 배지와 다양한 대사 산물이 함께 존재한다. FK506 발효 산물에는 FK520 및 다이하이드로FK506과 같은 구조적 유사체가 포함되어 있다. 이들 물질은 주로 미생물, 특히 방선균 속 미생물에 의해 생산되는 것으로 알려져 있다. FK506은 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis) 9993, 스트렙토마이세스속 ATCC55098, 스트렙토마이세스속 ATCC53770, 스트렙토마이세스속 BICC7522 등의 균주에서 생산되는 것으로 보고되었으며(Muramatsu, H., S. I. Mokhtar, M. Katsuoka and M. Ezaki. 2005. 미국 특허 제4,894,366호, WO 05/098011), FK506의 구조적 유사체인 FK520 또한 면역억제 활성과 항진균 활성(antifungal activities)을 가지며, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아속 아스코마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus) ATCC14891, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아속 야쿠시마엔시스(Streptomyces hygroscopicus subsp. yakusimaensis) 7238과 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis) 9993 등에서 생산되는 것으로 보고되었다. FK506 생산 균주의 발효 산물에는 FK520 및 그와 유사한 구조체가 다수 포함되어 있으며, 고품질의 의약용 FK506을 생산하기 위해서는 FK520과 같은 유사물질을 제거하는 것이 매우 중요하다.
그러므로, 산업계에서는 FK520 및 다이하이드로FK506을 제거하고 고순도의 FK506을 얻기 위한 방법이 모색되어 왔다. 이러한 정제 기술은 통상적으로 컬럼 크로마토그라피 방법을 기반으로 하고 있다. 은 이온 (Ag+)을 사용한 컬럼 크로마토그라피는 통상적으로 동일한 탄소수를 가지는 불포화 지방산의 시스-트랜스 이성질체를 구분하기 위해 사용된다는 것이 널리 알려져 있다(J. chromatography 149(1978) 417). 고순도 FK506의 생산을 위해 은 이온을 사용하는 컬럼 크로마토그라피 법은 기술적으로 크게 둘로 구별된다. 하나는 은 이온으로 전처리된 수지를 사용하는 방법(미국특허 등록번호 6,492,513, 미국특허 출원번호 US 08/0000834, 국제특허 공개번호 WO 05/054253)이고, 또 다른 하나는 분리하고자하는 화합물을 수지에 흡착시킨 후 은 이온이 함유된 용매로 용리시키는 방법(미국특허 등록번호 6,576,135 및 6,881,341)이다.
위 방법들을 좀더 구체적으로는 살펴보면, 미국 등록특허 제6,492,513호는 FK506, FK520 등의 고분자 화합물을 질산은 등 은 이온으로 전처리된 설폰산 그룹-함유 강력 양이온 교환수지를 사용하여 상호 분리하는 방법이 기술되어 있다.
또한, 미국특허 공개 US08/0000834호에는 알루미늄 옥사이드(aluminum oxide), 지르코늄 옥사이드(zirconium oxide), 스티렌 다이비닐벤젠 코폴리머(styrene divinylbenzene copolymer), 흡착 수지, 양이온 교환수지, 음이온 교환수지, 역상 실리카 겔, 시아노실리카 겔에 은 이온으로 수식된 흡착 수지를 사용하여 크로마토그라피법으로 FK506을 분리하는 방법이 기술되어 있다.
그리고, 국제특허 공개번호 WO05/054253호에는 층 분리가 가능한 용매를 이용하여 FK506을 유기용매에 전이시키고, 암모니아가스로 처리하여 상으로부터 불순물을 제거하거나 역상 크로마토그라피 방법을 반복적으로 수행하여 FK506을 정제하는 방법이 기술되어 있다.
상기 기술된 FK506 정제방법들은 고가의 수지, 은 이온 및 다량의 유기용매를 사용하기 때문에 제조 비용이 높아 비경제적이며, 컬럼 크로마토그라피 수행에 많은 시간이 걸리고, 정제도가 높지 않다.
또한, 미국 등록특허 제6,576,135호는 하나 이상의 알케닐 그룹과 알콕시 그룹 측쇄를 가진 락톤 함유 고분자 화합물의 혼합물을 대상으로 하는 분리방법에 대한 내용으로써, 화합물을 비이온성 흡착수지에 흡착시키고 은 이온을 함유하는 용매로 용출시키는 방법과, 활성형 알루미나에 흡착 후 용출시켜 락톤함유 고분자 화합물로부터 FK506과 유사한 유연물질을 제거하는 방법을 개시하고 있다.
상기 발명은 FK520 및 다이하이드로FK506의 분리도가 큰 장점은 있으나, 고가의 수지 및 은 이온이 포함된 다량의 유기용매 사용으로 제조비용이 매우 높으며, 또한 사용된 수지 내에 존재하는 은 이온 및 질산의 제거에 많은 비용과 시간이 소요되어 비경제적이다.
본 발명이 제공하는 것은 고가의 수지를 사용하는 컬럼 크로마토그라피 방법을 사용하지 않으면서도 효과적으로 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물과, 그와 구조적 유사체이지만 포화 알킬기를 가진 락톤 화합물을 분리하는 것이다. 본 발명은 락톤 화합물의 구조 변형이 없이 간단한 방법으로 불포화 알킬기를 가진 락톤화합물, 특히 FK506을 분자량과 그 구조 및 유기용매에 대한 물성이 비슷한 포화 알킬기를 가진, 특히 FK520, 다이하이드로FK506으로부터 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 물과 혼합될 수 있는 유기용매에 락톤 화합물을 녹인 후 은 이 온(Ag+) 수용액을 첨가하는 1단계;
상기 은 이온 수용액이 첨가된 유기용매를 감압 농축하여 락톤 화합물을 결정화하고, 결정을 제거하는 2단계;
상기 결정이 제거되고 남은 용액에 존재하는 은 이온(Ag+)을 제거하고 목적 화합물을 수거하는 3단계;를 포함하는 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물이 FK506인 것을 특징으로 하는, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 1단계의 물과 혼합될 수 있는 유기용매는 알콜, 케톤 및 극성 비양자성 유기용매(dielectric aprotic organic solvent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 1단계의 물과 혼합될 수 있는 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜, 아세톤 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 1단계에 사용하는 은 이온이 질산은 (AgNO3) 또는 초산은(AgCH3COOH), 황산은(Ag2SO4)과 같은 은염으로부터 제공되는 것을 특징으로 하는, 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법을 제공한다.
본 발명에서는 물과 혼합될 수 있으면서 과량의 락톤 화합물을 녹일 수 있는 용매에 락톤 화합물을 녹이고 은 이온 수용액을 가한 후 감압, 증발을 통해 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물을 불포화 알킬기를 가지는 락톤화합물보다 먼저 결정화시킨다. 그 후 은 이온이 포함된 수용액을 회수하여 불포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물을 회수한다.
본 발명의 방법을 적용하는 락톤 화합물은 단일환(monocyclic), 이환(bicyclic) 또는 삼환(tricyclic) 고리(ring)를 가질 수 있으며, 단일환 락톤 화합물로는 에리쓰로마이신(erythromycins), 류코마이신(leucomycins), 메티마이신(methymycins)과 같은 것이 될 수 있으며, 삼환 고리(tricylclic ring)를 가지는 것은 US 5,624,842와 US 4,894,366에 언급된 구조의 물질(화학식 1) 및 라파마이신과 그 유도체가 될 수 있다. 더욱 특별하게는 화학식 2로 대별되는 락톤 화합물로 R group이 알릴기, 프로필기, 에틸기, 메틸기로 각각 표시되는 FK506, 다이하이드로FK506, FK520, FK523이 될 수 있다.
(R1은 하이드록시기 또는 1-(저급 알킬티오)(-저급)알킬옥시기, 트리(저급)알킬실릴옥시기, 저급 알킬-다이페닐실릴옥시, 약학적으로 수용 가능한 유기 카복실릭 아실옥시기 및 약학적으로 수용 가능한 유기 술포닉 아실옥시기로부터 선택된 약학적으로 수용 가능한 보호된 하이드록시기, R2는 수소, 하이드록시기 또는 저급 알캐노일옥시기, R3는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 알릴기, n은 1 또는 2, 그리고, 실선과 점선 표시는 단일결합 또는 이중결합이고, R1과 R2가 각각 하이드록시기, n이 2이고 실선과 점선이 단일결합일 때 R3는 메틸기, 프로필기 또는 알릴기 및 그들의 약학적으로 수용 가능한 염기성 염이다.)
(또는 상기 R1은 하이드록시기; 저급 알킬티오알콕시; 트리(저급)알킬실릴옥시기; 저급 알킬다이페닐실릴옥시기; 선택적으로 카복시기로 치환되는 저급 알캐노일옥시기; 선택적으로 저급 사이클로알킬기 부분 상의 두 개의 저급 알킬기로 치환되는 저급 사이클로알콕시(저급)알캐노일옥시기; 캠포술포닐옥시기; 선택적으로 하 나 또는 그 이상의 니트로기로 치환되는 아로일옥시기, 여기서 아로일 부분은 벤조일기, 톨루오일기, 자일로일기 및 나프토일기로 구성된 그룹 중에서 선택된다; 선택적으로 할로겐으로 치환되는 아레네술포닐옥시기, 여기에서 상기 아레네 부분은 벤젠, 톨루엔, 자일렌 및 나프탈렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다; 또는 선택적으로 저급 알콕시기 및 트리할로(저급)알킬기로 치환되는 페닐(저급)알캐노일옥시기; R2는 수소, 하이드록시기 또는 저급 알캐노일옥시기, R3는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 알릴기, n은 1 또는 2, 그리고, 실선과 점선은 단일결합 또는 이중결합이며, R1과 R2가 각각 하이드록시기이고, n이 2, 실선과 점선이 단일결합일 때 R3는 메틸기, 프로필기 또는 알릴기 및 그의 약학적으로 수용 가능한 염기성 염이다.)
(R=메틸기, FK523; R=에틸기, FK520; R=프로필기, 다이하이드로FK506; R=알 릴기, FK506이다.)
본 발명에서 불포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물의 "불포화 알킬기"는, 특별히 저급 알케닐기로 비닐기, 프로페닐기(알릴기 또는 1-프로페닐기), 부테닐기, 이소부테닐기, 펜테닐기, 헥세닐기 등과 같은 것이며, 더욱 바람직하게는 비닐기와 프로페닐기이다. 포화 알킬기는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 펜틸기, 헥실기 등과 같은 것이며, 더욱 바람직하게는 에틸기와 프로필기이다.
락톤 화합물을 녹일 수 있고 물과 혼합될 수 있는 용매는 알콜, 케톤, 혹은 극성 비양자성 유기용매(dielectric aprotic solvent)가 될 수 있으며, 대표적으로는 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜, 아세톤, 아세토니트릴이 선택될 수 있으며, 또는 이들의 혼합물이 될 수 있다.
상기 용매에 녹일 수 있는 락톤 화합물의 농도는 다양한 범위에서 조절될 수 있으며, 예컨대 FK506 및 그 구조 유사체의 경우 1~250g/수용성 유기용매(ℓ), 바람직하게는 25~150g/ℓ 범위이며, 용매로는 아세톤이 가장 바람직하다. 락톤 화합물 용액의 농도가 낮을 경우 FK506 정제에 상대적으로 은 이온 양의 사용이 많아지므로 비경제적이며, 높은 농도인 경우 물을 첨가하면 과도한 결정이 생성되어 선별 결정이 어렵다.
본 발명에 사용된 은 이온 수용액은 은 이온이 공급될 수 있는 질산은과 같은 은염을 1~10M의 범위로 녹인 수용액이 적절하며, 바람직하게는 2~5M 범위가 적절하다.
본 발명에서 사용되는 알킬기를 가지는 락톤 화합물은 미생물의 발효로부터 수득할 수 있고, 또한 인공적인 합성으로도 제공될 수 있다. 본 발명에서는 통상적으로 미생물 발효에 의해 수득되는 화합물로 불포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물과 포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물의 혼합물, 특히 FK506 및 그 구조 유사체인 FK520 및 다이하이드로FK506이 일부 혼합된 화합물을 사용하였다.
상기 시료를 사용하여 은 이온 수용액을 사용한 본 발명은 은 이온의 농도, 은 이온 수용액의 양 및 은 이온 수용액 상에서의 결정화 횟수가 증가할수록, FK506의 순도가 증가하고 상대적으로 FK520 및 다이하이드로FK506이 감소한다. 또한, 은 이온 농도가 증가할수록 FK506의 회수율이 증가한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다.
실시예
1: 시료의 조제
알킬기 측쇄(alkyl side chain)가 있는 락톤 화합물, 특히 FK506, FK520, 다이하이드로FK5006 혼합액의 준비를 위해 전배양 배지(산화전분 0.3g, 글리세린 0.21g, 미트펩톤 0.09g, 효모추출물 0.09g, 소이펩톤 0.15g, AZ-20R 0.015㎖) 20㎖를 제조하여 500㎖ 평판 삼각플라스크에 넣어 살균한 후 스트렙토마이세스속 GT1005 균주를 1㎖ 접종하여 27-30℃, 240rpm 조건으로 36시간 배양하였다. 1차 종 배양 배지(산화전분 20g, 글리세린 20g, 생대두분 10g, 탄산칼슘 4g, CSL(45%) 10㎖, AZ-20R 1㎖, pH 6.5) 2ℓ를 5ℓ 평판 삼각플라스크에 넣어 살균하고 상기 전 배양액 10㎖를 접종하여 27-30℃, 36시간 배양하였다. 500ℓ 발효조에 산화전분 6㎏, 글리세린 3㎏, 생대두분 1.5㎏, 효모추출물 0.6㎏, 탄산칼슘 0.6㎏, CSL(45%) 1.5L, AZ-20R 0.3㎏를 함유한 2차 종배양배지 300ℓ를 조제한 후 살균하고 1차 종배양균액 2ℓ를 식균하였다. 27-30℃에서 통기량 0.5-1VVM, 교반 속도 50-300rpm으로 24시간 배양하였다. 5㎘ 발효조에 산화전분 210㎏, 생대두분 15㎏, 효모가루 51㎏, 탄산칼슘 3㎏, 황산암모늄 3㎏, AZ-20R 6ℓ를 함유한 본배양 배지 2.7㎘를 조제하고 가성소다를 첨가하여 pH 8.5로 보정하고 살균하였다. 흡착수지 HP-20 150ℓ를 물로 수화하여 300ℓ를 제조하여 별살하여, 살균한 배지와 별살한 흡착수지를 혼합용액에 2차 종배양액 전량을 무균적으로 식균한 후 27-30℃에서, 통기량 0.5-1VVM, 교반속도 50-200rpm으로 6일 동안 배양하였다.
실시예
2: 조정제 시료 준비
배양액에 HP20 수지(150ℓ)를 누체 필터로 회수 후 물로 세척하였다. 아세톤 500ℓ를 사용하여 수지에서부터 FK506 및 FK520, 다이하이드로FK506 등을 포함하는 추출액을 얻었다. 상기 추출액에 동일 부피의 물을 가한 후 HP20 수지 200ℓ가 충진된 컬럼에 2RV(Resin volume)/hr 유속으로 흡착시키고 75% 아세톤을 1RV(Resin volume)/hr 유속으로 3RV를 용출시켰다. 용출액의 HPLC 분석 결과, 순도는 62%였고, 873.6g의 FK506을 수득할 수 있었다. 상기 용출액에 과량의 NaCl을 첨 가하여 물과 아세톤 층을 분리한 후 상등액을 회수하여 감압 농축하였다. 농축액을 아세톤:헥산:트리에틸아민=20:80:0.5 용매에 녹인 후 동일 용매로 충진된 실리카겔(30kg)에 흡착시켰다. 동일 용매 100ℓ를 1RV/hr 유속으로 세척 후 아세톤:헥산:트리에틸아민=30:70:0.5 용매 200ℓ와 아세톤:헥산:트리에틸아민=40:60:0.5 100ℓ를 각각 1RV/hr 유속으로 용출하였다. HPLC로 분석하여 FK506을 포함하는 용출액을 모아 50℃에서 감압 농축하였다. 상기 농축액을 80ℓ아세톤에 녹인 후 물 240ℓ를 가하고 4℃에서 12시간 동안 결정을 형성시켰다. 형성된 결정을 여과포로 여과한 후 45℃ 진공건조기에서 6시간 동안 건조하였다. 건조된 FK506의 순도는 87.2%였으며 총 453.7g을 수득하였다. 상기 회수된 결정 중 15g을 아세톤 100㎖에 녹인 후 CG161M 수지( 3ℓ, 3.7L/D)가 충진된 컬럼에 흡착 시킨 후 55% 아세톤 30ℓ를 0.5RV/hr 유속으로 흘리면서 용리액을 수거하였다. HPLC로 분석하여 FK506을 포함하는 용출액을 모아 감압 농축하였다. 농축액을 0.6ℓ아세톤에 녹인 후 물 1.4ℓ를 가수 후 감압 농축하면서 결정을 형성시켰다. 형성된 결정을 여과포로 여과한 후 45℃ 진공건조기에서 6시간 동안 건조하였다. 이와 같은 과정을 통해 원 시료를 얻었다.
실시예
3: 분석법 및 시료
FK506 및 그 유사체들의 함량 및 순도를 확인하기 위하여 두 가지 분석법을 사용하였다. 수용액 상의 함량 분석은 C18 컬럼을 사용한 HPLC 방법(컬럼, Hypersil GOLD C18 4.6x250㎜]; 이동상, 50% 아세토니트릴; 유속, 1㎖/min; 컬럼 온도, 55 ℃; 검출파장, 210㎚)으로 분석하였다.
본 발명의 이하의 실시예에서 사용한 시료는 상기 실시예 1, 2와 같이 준비하였으며, C18 컬럼 HPLC 분석 결과, 원 시료는 93.4% FK506, 1.56% FK520, 1.69% 다이하이드로FK506을 함유하고 있었다(도 1, 표 1).
실시예
4: 은 이온 수용액 상 결정화 방법
원 시료 0.5g을 아세톤 30㎖에 녹인 후 1.65M 질산은(AgNO3) 수용액 30㎖를 천천히 첨가하면서 교반하였다. 은 이온 수용액이 완전히 첨가된 상태에서 1시간 동안 섞어준 후 최종 100㎖이 될 때까지 증류수를 첨가하여 최종 아세톤 농도가 30%가 되도록 하였다.
이 용액은 감압 하에 80~85㎖ 정도로 농축시킨 후 4℃에서 하룻밤 정치시켰다. 형성된 1단계 결정을 여과로 분리하여 제거하고, 남은 은 이온 용액을 동일한 방법으로 농축시킨 후 다시 4℃에서 정치하여 2단계 결정을 형성하고 제거하였다. 최종적으로 남은 은 이온 용액과 각 단계에서 제거된 1, 2차 결정시료를 HPLC로 분석한 결과는 표 1, 도 1b, 도 1c와 같다. 은 이온 용액 상에서 생성된 1차 결정에 9.9% FK520과 28.8% 다이하이드로FK506이 함유되어 있었는데, 이는 원 시료 내의 FK520, 다이하이드로FK506의 함량보다 매우 증가한 것이다. 2차 결정에는 FK520(4.96%)과 다이하이드로FK506(8.81%)의 함량비가 1차 결정보다는 낮았으나, 원 시료보다 높아져 있었다. 반면, 은 이온 용액에서 회수한 시료에는 FK506 함량 비(순도)가 크게 높아졌으며(93.4%에서 97.1%로), 반면 FK520은 1.76%에서 0.111%, 다이하이드로FK506는 1.69%에서 미검출로 현저히 감소하였다.
이와 비교하여 은 이온을 첨가하지 않은 대조구의 경우 결정이 제거된 후 용액시료의 HPLC 분석결과 FK520 함량은 2.1%, 다이하이드로FK506의 경우 0.7%이었고, 결정으로 회수된 시료도 93.6% FK506, 3.6% FK520, 1.3% 다이하이드로FK506으로 결정 혹은 용액시료 모두 순도의 개선은 없었다. 또한, 은 이온 무첨가 대조구에서는 1단계 결정화에서 FK506의 72.9%가 결정화되지만 은 이온 첨가시험구의 경우 FK506의 16%만 결정화되었다. 상기 결과들은 은 이온 용액하에서 불포화 이중결합이 있는 알킬기를 가지는 락톤화합물인 FK506의 결정화가 은 이온을 첨가하지 않은 대조구에 비해 방해되는 반면 포화 알킬기를 가지는 락톤화합물인 FK520 및 다이하이드로FK506은 은 이온에 의해 영향을 받지 않기 때문일 것으로 예측된다. 본 실시예로 은 이온 용액 상에서 포화 알킬기를 가지는 FK520 및 다이하이드로FK506을 선별 결정화하여 불포화 알킬기를 가지는 락톤 화합물, 예컨대 FK506 등의 순도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
시료 |
FK506 |
FK520 |
DH-FK506 |
Yield |
원 시료 |
93.4% |
1.76% |
1.69% |
- |
은 이온 무첨가 대조구 |
결정 |
93.6% |
3.6% |
1.3% |
72.9% |
용액 |
84.2% |
2.1% |
0.7% |
27.1% |
은 이온 첨가 시험구 |
1단계 결정 |
69.8% |
9.9% |
28.8% |
1.4% |
2단계 결정 |
83.6% |
4.96% |
8.81% |
14.6% |
은 이온 용액 |
97.1% |
0.111% |
미검출 |
84.0% |
실시예
5: 은 이온 수용액으로부터
FK506
회수
상기 실시예 4에서 결정을 제거한 은 이온 수용액에 2배 부피의 에틸아세테이트 첨가 후 1 시간 이상 강하게 혼합하였다. FK506이 포함된 에틸아세테이트 층을 회수하여 감압 농축하였다. 감압 농축액에 시험구에서 사용한 동일한 부피의 아세톤을 가하여 완전히 녹인 후 NaCl 포화 수용액을 첨가하여 은 이온을 AgCl 형태로 침전시켰다. 여기에 동일 부피의 에틸아세테이트로 강하게 1시간 이상 혼합한 후 정치시켜 층을 분리하였다. 에틸아세테이트 층만을 회수하여 완전히 감압 농축한 다음, 시료를 아세톤에 녹이고 여기에 4배 부피의 물을 천천히 가수하여 결정화시켜 최종 결정의 FK506을 얻을 수 있었다.