CN105585578B - 一种雷帕霉素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种雷帕霉素的制备方法，具体从雷帕霉素发酵液中提取出菌丝体后，进行浸提，将浸提液萃取，脱色，硅胶柱层析得到粗品I，再将粗品I通过大孔吸附树脂吸附，得到粗品II，后进行结晶，即可得到高纯度雷帕霉素；本发明提供的技术方案，对设备要求低，适合工艺化生成，采用特定的洗脱液，分离效果好，纯化效率高。

Description

一种雷帕霉素的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高纯度雷帕霉素的制备方法。

背景技术

雷帕霉素（Rapamycin，RPM，PAPA），又名西罗莫司（Sirolimus），是1975年由加拿大Ayerst研究所从吸水链霉菌（Strepomyces hygroscopicus）中分离出来的三烯大环内酯类抗生素。雷帕霉素的分子式为C₅₁H₇₉NO₁₃,分子量914，为白色固体结晶，熔点为183-185℃，亲脂性，溶解于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，极微溶于水，几乎不溶于乙醚。其结构式为：

西罗莫司具有异构体B和异构体C，其中异构体B为主要活性成分，上述结构式为异构体B，异构体C结构式如下：

1977年发现其具有重要的免疫抑制作用，1989年开始把其作为用于抗器官移植排斥反应的新型高效免疫抑制剂进行研究，1999年9月美国FDA批准其适用于在临床上的肾移植病人。在中国，西罗莫司口服液作为二类新药2002年获准进入国内临床。2005年6月福建省微生物研究所研制研发的国产西罗莫司经SFDA批准投放市场。现在西罗莫瓦器已成功开发为新型强效的免疫抵制剂，用于器官移植搞排斥反应，用于治疗自身免疫性疾病；用于涂层支架，防止心脏血管再狭窄；作为mTOR靶向抗肿瘤药物，抑制肿瘤的生长等。

CN102433364B提供了一种微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺，其中，包括以下步骤：先在斜面培养基中培养吸水链霉菌，然后转接于新鲜种子培养基中进行培养；将经所述种子培养基培养的菌株按照2％的接种量接种至新鲜的发酵培养基中进行发酵培养，得到含雷帕霉素的发酵液；将雷帕霉素发酵液加入硅藻土过滤，得到湿菌丝体，萃取、浓缩、结晶，得到雷帕霉素粗品；然后再讲雷帕霉素粗品经硅胶柱层析纯化，最后重结晶得到雷帕霉素终产品，纯度在95%以上。

专利CN101133065A公开了一种通过化学方法来纯化雷帕霉素的方法。该方法纯化方法包括用三甲基氯硅烷处理雷帕霉素得到31,42-双-三甲基甲硅基醚，庚烷萃取，并使31，42-双-三甲基甲硅烷醚脱保护从而产生纯化的雷帕霉素产物。该方法操做复杂，成本较高，回收率低只能获得98.7%纯度的雷帕霉素。

专利CN 102464668 A公开了一种通过制备色谱纯化得到高纯度雷帕霉素的方法。该方法用到了制备色谱，其设备、填料价格昂贵，生产成本高。

专利CN 102070652 B公开了一种从发酵液中快速分离提取西罗莫司的方法，包括将西罗莫司从发酵液中提取得到菌丝体，然后将菌丝体进行萃取、脱色得到粗提物，粗提物通过高速逆流色谱分离，收集西罗莫司分离样品溶液，浓缩干燥，得到成品，该方法具有提取步骤简单、节省溶剂等优点，但其采用高速逆流色谱分离，设备投入成本大，色谱上样量小（目前到克级），不适合工业规模生产，并且经过该方法只能得到纯度为90%的雷帕霉素产品。

专利CN102372726A公开了一种通过将西罗莫司菌丝体的浸提液进行吸附、萃取、洗涤浓缩、洗涤、结晶、洗晶干燥等步骤，即可得到西罗莫司粗晶，该方法只能得到纯度为95%的雷帕霉素。

雷帕霉素的发酵产量低，从发酵液中分离提取雷帕霉素的难度大，现有工艺均存在分离效率低，能耗高，随着雷帕霉素越来越多的进入临床的使用，急需找到一种成本低、操作简单、高纯度的制备方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种产品纯度高，生产成本低的从发酵液中分离纯化雷帕霉素的方法，包括：从雷帕霉素发酵液中分离得到菌丝体，然后将菌丝体用丙酮浸提，固液分离得到浸提液；将雷帕霉素浸提液采用下述步骤进行操作：

（1）、萃取、脱色：将浸提液浓缩后，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相；向乙酸乙酯相加入活性炭脱色，无水硫酸钠干燥；

（2）、硅胶柱层析：向步骤（1）干燥后的乙酸乙酯相中加入空白硅胶，浓缩成干粉，作为上样硅胶；石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，得到粗品I；

（3）大孔吸附树脂吸附：将步骤（2）得到的粗品I用乙腈水溶液溶解，通过大孔吸附树脂吸附，乙腈水溶液作为解吸液，收集含雷帕霉素纯度高的解吸液；将解吸液真空浓缩，然后加入二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷相，浓缩至干，得到粗品II；

（4）结晶：将粗品II用乙醚溶解，4℃~8℃搅拌结晶，过滤收集晶体，在常温下真空干燥得到纯化的雷帕霉素。

其中，从雷帕霉素发酵液中分离得到菌丝体所用方法可以为压滤、抽滤或离心中的一种或多种方式结合；浸提菌丝体所用丙酮的量约为菌丝体重量的3~4倍（v/w）。

进一步的，所述步骤（1）萃取、脱色，优选将浸提液在50℃下真空浓缩至几乎不含有丙酮，然后将浓缩液用3~4倍（V_乙酸乙酯/W_{浓缩浸提液}）乙酸乙脂萃取，分离得到乙酸乙酯相；将乙酸乙酯相用0.5~5倍（V_弱碱/V_乙酸乙酯）弱碱性溶液洗涤3~5次，直到下层水溶液无明显颜色，所述所碱性溶液为质量浓度1%~10%碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钠的水溶液；所述向乙酸乙酯相加入活性炭脱色，无水硫酸钠干燥，优选向乙酸乙酯相加入活性炭后，加热到40℃，脱色约30分钟，过滤，乙酸乙酯层加入无水硫酸钠干燥，过滤，收集乙酸乙酯溶液；其中，活性炭的用量优选为0.5%~10%（W_活性炭/V_乙酸乙酯），优选活性炭用量为1%-3%（W_活性炭/V_乙酸乙酯）。

进一步的，所述步骤（2）硅胶柱层析，优先将乙酸乙酯相中加入空白硅胶，然后在小于50℃下真空浓缩成干粉，作为上样硅胶，所述空白硅胶为球形非键合硅胶，粒径为50~300目，用量为乙酸乙酯相中所含雷帕霉素质量的2~20倍，优选5~10倍；装柱完成后，优选采用干法上样；洗脱之前，优选先用石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂对硅胶柱进行梯度预洗，所述预洗液石油醚与乙酸乙酯体积比为2:8~5:5；该比例不是2:8~1:1范围中的某一个比例，而是梯度洗脱的溶剂比例在此范围。所述预洗方法，例如可以是，在预洗过程中先用2:8的石油醚与乙酸乙酯预洗两倍柱体积；然后用3:7的石油醚与乙酸乙酯预洗两倍柱体积；再用4:6的石油醚与乙酸乙酯预洗两倍柱体积；再用5:5的石油醚与乙酸乙酯预洗两倍柱体积，完成预洗。

预洗完毕后，用石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂作为洗脱液对硅胶柱进行洗脱，，其中，石油醚与乙酸乙酯体积比为5:5~3:7，最优选7:13洗脱完毕后收集洗脱液，将洗脱液在温度小于50℃真空浓缩至干粉，得到雷帕霉素粗品I，纯度为85%以上的雷帕霉素。

进一步的，所述步骤（3）大孔吸附树脂吸附，优选将粗品I用乙腈水溶液溶解，然后通过大孔树脂吸附，其中，所述的乙腈水溶液的浓度为40%~60%，优选50%，每克粗品I约用40ml~60ml，优选50ml所述的乙腈水溶液。例如，2g粗品I先加入50ml乙腈，溶解后搅拌下加入等量的纯化水，搅拌均匀得到上柱液。所述大孔吸附树脂为一种聚苯乙烯二乙烯基苯形成的大孔树脂，选自DIAION HZ20SS、UniPS40、HZ20SS和UniPS50组成的组，用量为粗品II重量的100~500倍（W/V）；更进一步的，优选大孔树脂为UniPS40。

吸附完毕后，用乙腈水溶液作为洗脱液进行洗脱，优先洗脱液优选浓度为40%~70%的乙腈水溶液，更优选，洗脱液浓度为63%的乙腈水溶液。收集纯度较高组份，将纯度较高组份在低于40℃下真空浓缩至乙腈浓度低于10%后迅速降温至4℃~8℃。然后向浓缩液中加入与浓缩液等体积的预先冷至4℃-8℃的二氯甲烷。搅拌30分钟，分层收集二氯甲烷层。

向二氯甲烷层中加入无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液在温度低于45℃下真空浓缩至干。得到雷帕霉素粗品II。

进一步的，所述步骤（4）结晶，优先将粗品II用乙醚溶解，搅拌下缓慢降温至4℃-8℃搅拌结晶。过滤收集晶体，在25℃下真空干燥得到纯化的雷帕霉素，其中优选所用乙醚体积为粗品II重量的5~15倍(V_乙醚/W_粗品II)，更优选为8-10倍(V_乙醚/W_粗品II)；所述纯化的雷帕霉素HPLC纯度高于99%。

所述HPLC检测条件为：色谱柱：Kromasil C18 柱；色谱柱规格：5μm，4.6mm×250mm；流动相：体积比为甲醇:乙腈:水=70:15:30 的甲醇、乙腈和水的混合溶液；检测波长：277nm；柱温：40℃；流速：1ml/min 。

本发明所用到的硅胶柱层析方法中，所用空白硅胶为一球形的非键和硅胶，其料径为50~300目，优选200~300目；硅胶柱的规格为：径高比为1:5~1:15。优选1:8~1:10。用量为雷帕霉素质量的50~150倍，最优选100~120倍。

本发明提供的高纯度的雷帕霉素制备方法是一种具有工业化生产价值的新工艺，主要具有如下优点和积极效果：

第一，在制备的过程中，两次柱层析都采用普通的常压柱而没有采用中压制备色谱，从而大大减少了生产的前期设备投入，有效的降低了生产成本；

第二，本发明采用采用柱层析结合大孔吸附树脂的方法纯化雷帕霉素原理简单，操作方便，对设备要求低，适合应用于工业化生产，柱层析采用石油醚与乙酸乙酯的混合液做洗脱液，相对现有技术中使用丙酮/己烷做洗脱液，分离效果好；

第三，本发明纯化效率高，纯化后得到的雷帕霉素HPLC纯度在99%以上；

第四，与现有技术相比，本发明不仅得到的产品的纯度高，而且收率高。

附图说明

图1显示实施例1中所用发酵液的HPLC图谱，雷帕霉素的保留时间约为4.98min。

图2显示实施例1中乙酸乙酯经洗涤后的HPLC图谱，雷帕霉素的保留时间约为6.38min。

图3显示按实施例2所制得的粗品I的HPLC图谱，雷帕霉素的保留时间约为5.37min。

图4显示按实施例3所制的粗品II的HPLC图谱，雷帕霉素的保留时间约为9.30min。

图5显示按实施例4所制得的高纯度雷帕霉素的图谱，雷帕霉素的保留时间约为5.68min。

具体实施方法

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。发明所用非达霉素发酵液均为重庆乾泰生物医药有限公司发酵部门用微生物培育手段获得；非键和硅胶是由青岛海洋化工厂分厂生产；UniPS40是由苏州纳微生物科技有限公司生产；丙酮、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷等溶剂均为市售。

实施例1

30L发酵液（HPLC色谱图如图1所示，图1对应的保留时间及峰面积如表1）压滤得到2.5kg菌丝体。向菌丝体中加入10L丙酮，搅拌4小时，过滤得到10.3L滤液，经HPLC检测滤液内含雷帕霉素31.5g。用旋转蒸发器在50℃下真空度-0.09MPa下浓缩至无丙酮流出，得到浓缩液1.8L。向浓缩液中加入7.2L乙酸乙酯，搅拌30分钟，分液漏斗中静置分层，收集乙酸乙酯层，得到7.1L乙酸乙酯层。加入7.1L3%NaHCO₃溶液搅拌洗涤，分液后弃去水层，重复洗涤三次。最终得到7L乙酸乙酯层。乙酸乙酯层中加入140g活性碳，40℃下搅拌脱色30分钟，抽滤收集滤液。乙酸乙酯中加入210g无水硫酸钠搅拌5小时，抽滤得到黄色澄清液体。经HPLC检测乙酸乙酯中含雷帕霉素31g，HPLC纯度：34.5%（HPLC色谱图如图2，图2对应的保留时间及峰面积如表2）。向乙酸乙酯中加入300g空白硅胶，在50℃，真空度约-0.09MPa条件下，浓缩至干粉，此为上样硅胶。

表1：

；

表2：

。

实施例2

取3L空白硅胶，用石醚装柱，径高比为1:9。将实施例1中得到的上样硅胶以干法上样的方式装入硅胶柱中。用6L石油醚:乙酸乙酯为2:8的预洗液预洗；然后用6L石油醚:乙酸乙酯为3:7的预洗液预洗；再用6L石油醚:乙酸乙酯为4:6的预洗液预洗；最后用6L石油醚:乙酸乙酯为5:5的预洗液预洗。预洗结束后用石油醚:乙酸乙酯为7:13的解吸液解吸。收集纯度较高组份。解吸混合液在50℃下，真空度-0.09MPa下浓缩至干粉。得到29.3g类白色的粗品I，HPLC纯度：88.5%。（HPLC色谱图如图3，图3对应的保留时间及峰面积如表3）。

表3：

。

实施例3

将粗品I用1500ml乙腈溶解，搅拌下加入1500ml纯化水。经9L UniPS40大孔树脂吸附，吸附完毕后用50%乙腈解吸，收集纯度较高组份，得到27L解吸混合液。解吸混合液在40℃下，真空度-0.095MPa下浓缩。浓缩液降温至4℃~8℃，向其中加入浓缩液等体积的温度为4℃~8℃的二氯甲烷，搅拌30min后，分液漏斗中静置分层，收集二氯甲烷层。向二氯甲烷中加入无水硫酸钠，4℃~8℃搅拌脱水5小时后，抽滤得二氯甲烷层，真空减压浓缩至干，得24.9g粗品II，HPLC纯度：99.6%。（粗品II的HPLC色谱图如图4，图4对应的保留时间及峰面积如表4）。

表4：

。

实施例4

粗品II用200ml乙醚快速搅拌溶解，然后降温至4℃~8℃，搅拌1小时。过滤收集晶体。真空干燥得到高纯度的雷帕霉素23.6g，HPLC：99.8%。（HPLC色谱图如图5，图5对应的保留时间及峰面积如表5）。总收率为74.9%。

表5：

。

实施例5

35L发酵液压滤得到2.8kg菌丝体。向菌丝体中加入11L丙酮，搅拌4小时，过滤得到12L滤液，经HPLC检测滤液内含雷帕霉素38.5g。用旋转蒸发器在50℃下真空度-0.09MPa下浓缩至无丙酮流出，得到浓缩液2.2L。向浓缩液中加入7.7L乙酸乙酯，搅拌30分钟，分液漏斗中静置分层，收集乙酸乙酯层，得到7.5L乙酸乙酯层。加入22.5L 1%Na₂CO₃溶液搅拌洗涤，分液后弃去水层，重复洗涤三次。最终得到7.6L乙酸乙酯层。乙酸乙酯层中加入380g活性碳，40℃下搅拌脱色30分钟，抽滤收集滤液。乙酸乙酯中加入300g无水硫酸钠搅拌5小时，抽滤得到黄色澄清液体。经HPLC检测乙酸乙酯中含雷帕霉素37.3g。向乙酸乙酯中加入423.5g空白硅胶，旋转蒸发器中50℃、真空度-0.09MPa，浓缩至干粉，此为上样硅胶。

实施例6

取1.5L空白硅胶，用石醚装柱，径高比为1:10。将实施例5中得到的上样硅胶的1/2以干法上样的方式装入硅胶柱中。用石油醚:乙酸乙酯为2:8的预洗液预洗6L；然后用石油醚:乙酸乙酯为3:7的预洗液预洗6L；再用石油醚：乙酸乙酯为4:6的预洗液预洗6L；最后用石油醚:乙酸乙酯为5:5的预洗液预洗6L。预洗结束后用石油醚：乙酸乙酯为4:6的解吸液解吸。收集纯度较高组份。解吸混合液在50℃下，真空度-0.09MPa下浓缩至干粉。得到19.3g类白色的粗品I，HPLC纯度：90%。

实施例7

将粗品I用900ml乙腈溶解，搅拌下加入1000ml纯化水。经9.6L UniPS40大孔树脂吸附，吸附完毕后用60%乙腈解吸，收集纯度较高组份，得到14.7L解吸混合液。解吸混合液在40℃下，真空度-0.095MPa下浓缩至6%乙腈。浓缩液降温至4℃~8℃，向其中加入浓缩液等体积的温度为4℃~8℃的二氯甲烷，搅拌30min后，分液漏斗中静置分层，收集二氯甲烷层。向二氯甲烷中加入3%的无水硫酸钠，搅拌脱水5小时，过程温度控制4℃~8℃。抽滤得二氯甲烷层，用旋转蒸发器45℃下，真空度-0.09MPa下浓缩至干，得14.4g粗品II。粗品II用216ml乙醚快速搅拌溶解，然后降温至4℃~8℃，搅拌1小时。过滤收集晶体。真空干燥得到高纯度的雷帕霉素12.9g。总收率为66.8%，HPLC纯度为99.1%。

实施例8

将施例5中得到的上样硅胶的1/2用实施例2中同样的方法处理，16.5g得到粗品I。粗品I用590ml乙腈溶解，搅拌下加入400ml纯化水。经3L DIAION HZ20SS大孔树脂吸附，吸附完毕后用70%乙腈解吸，收集纯度较高组份。解吸混合液真空浓缩至无乙腈流出，加入等体积的4℃~8℃的二氯甲烷。分离得到二氯甲烷层，脱水后真空浓缩至干，得12.5g粗品 II。加入187.5ml乙醚结晶得到雷帕霉素11.6g。总收率为60.1%。HPLC纯度为99.2%。

Claims (6)

1.一种从发酵液中分离纯化雷帕霉素的方法，包括，从雷帕霉素发酵液中分离得到菌丝体，然后将菌丝体用丙酮浸提，固液分离得到浸提液；将雷帕霉素浸提液采用下述步骤进行操作：(1)、萃取、脱色：将浸提液浓缩后，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相；向乙酸乙酯相加入活性炭脱色，无水硫酸钠干燥；其中，活性炭的用量为乙酸乙酯体积的0.5％～10％(W_活性炭/V_乙酸乙酯)；

(2)、硅胶柱层析：向步骤(1)干燥后的乙酸乙酯相中加入空白硅胶，浓缩成干粉，作为上样硅胶；洗脱剂为体积比为5:5～3:7的石油醚/乙酸乙酯，收集洗脱液，浓缩，得到雷帕霉素粗品I；

(3)大孔吸附树脂吸附：将步骤(2)得到的粗品I用乙腈水溶液溶解，通过大孔吸附树脂吸附，乙腈水溶液作为解吸液，收集解吸液；将解吸液真空浓缩，然后加入二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷相，浓缩至干，得到雷帕霉素粗品II，所述大孔吸附树脂选自DIAION HZ20SS、UniPS40、HZ20SS和UniPS50组成的组，用量为粗品I重量的100～500倍(W/V)；所述的解吸液乙腈水溶液的浓度为40％～70％；

(4)结晶：将粗品2用5～15倍(V_乙醚/W_粗品II)的乙醚溶解，4～8℃搅拌结晶，过滤收集晶体，在常温下真空干燥得到纯化的雷帕霉素。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中乙酸乙酯用量为浓缩后浸提液的3～5倍(V_乙酸乙酯/W_{浓缩浸提液})。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)向乙酸乙酯相中加入活性炭脱色之前，先用0.5～5倍(V_弱碱/V_乙酸乙酯)的弱碱性溶液将乙酸乙酯相洗涤3～5次；所述弱碱性溶液为质量浓度1％～10％碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钠的水溶液。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述空白硅胶为球形非键合硅胶，粒径为50～300目，用量为乙酸乙酯相中所含雷帕霉素质量的2～20倍。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述粗品I用乙腈水溶液溶解，其中乙腈水溶液的浓度为40％～60％，用量为每克粗品I用40ml～60ml的所述的乙腈水溶液。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述纯化的雷帕霉素，其HPLC纯度在99.5％以上；其中，所述HPLC检测条件为：色谱柱：Kromasil C18柱；色谱柱规格：5μm，4.6mm×250mm；流动相：体积比为甲醇:乙腈:水＝70:15:30的甲醇、乙腈和水的混合溶液；检测波长：277nm；柱温：40℃；流速：1ml/min。