CN103087117B - 一种高纯度阿扎霉素b的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？melanosporus</i>)发酵菌丝体制备阿扎霉素B的方法。该方法包括将阿扎霉素B浸提液通过大孔脱色树脂脱色后，再用大孔吸附树脂吸附、解吸，浓缩后得到含有阿扎霉素B粗提物，粗提物用溶剂溶解后结晶，得到高纯度的阿扎霉素B产品。本发明的优点在于采用大孔树脂对该产品进行分离，工艺简单易行，适宜于工业化生产，可以制备高纯度的阿扎霉素B产品。

Description

一种高纯度阿扎霉素B的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，涉及药品原料的制备方法，具体涉及到一种从发酵菌丝体中分离纯化阿扎霉素B的制备方法。

背景技术

阿扎霉素B是一种从链霉菌（Streptomycesmelanosporus）培养液中分离出的具有对称性的十六元环大环双内酯抗生素,分子式C₅₄H₈₈O₁₈，相对分子质量1025，结构式如下：

阿扎霉素B为白色针状或雪花状结晶,在空气中较易失去溶剂而呈无定形粉末。熔点178℃~183℃,[α]²⁵ _D=-48°(C=1,甲醇)(MamoruA.JAntibiotics,1960,13:46~51),比旋[α]²⁵ _D=-46.90°(C=0.83,CHCl₃)(FiedlerHP,WvrnerW,NerHZ.JAntibiotics,1981,34:1107~1118)。在纯溶剂中,溶解度小,可溶于甲醇、氯仿、乙醇、乙酸乙酯,微溶于丙酮,不溶于苯、醚、水,较易溶于混合溶剂:含水甲醇、甲醇-乙酸乙酯、甲醇-苯等。

阿扎霉素B具有典型大环内酯类抗生素的抗菌典型特征，对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、白喉棒状杆菌、破伤风芽孢杆菌有抑制作用；具有良好的治疗线虫感染等的作用，是抗寄生虫药研究热点之一；能有效提高瘤胃中丙酸产量，是一种有发展前景的牛类生长促进剂（Chao-MiayL,WestleyJ.Elaiophylinasarumenfermentationefficiencyenhancer.JAntibiotics,1993,46(2):350～352）；具有免疫抑制作用，阿扎霉素B可能成为强免疫抑制剂（LeeSY,KimHS,KimYH,etal.ProductionofelaiophylinbythestrainMCY-846inasubmergedculture.MicrobiolBiotechnol,1997,7(4)：272~277）。

目前,国内外对于阿扎霉素B的研究还处于较初级的阶段,该抗生素尚未形成工业化产品。就抗菌作用而言,由于溶解性差,只能抑制G+细菌,母体化合物有待于进一步改造,才可望进入临床应用。阿扎霉素B抗菌作用以外的生物活性已经引起了广泛的注意,其新颖的化学结构也吸引着众多化学工作者将其作为合成、半合成研究的原料。对于阿扎霉素B的进一步研究,正适应了现代研究人员对非典型大环内酯类抗生素及抗生素抗菌功能以外治疗作用的研究,在畜牧业、农业、医学科研上有着广阔的发展前景。

国内外关于阿扎霉素B分离纯化的报道较少。KAAlvi等（KAAlvi,JPeterson,BHofmann.RapididentificationofelaiophylinandgeldanamycininStreptomycesfermentationbrothsusingCPCcoupledwithaphotodiodearraydetectorandLC-MSmethodologies,1995,15,80-84）报道了将发酵培养液用等体积乙酸乙酯萃取后浓缩，得到粗提物后再用高速逆流色谱分离。该方法的缺点是高速逆流色谱分离提取，批处理量小，不适于规模化生产。Lee等（LeeSY,etal.ProductionofelaiophylinbythestrainMCY-846inasubmergedculture.JMicrobinl.Bintechnol.1997,7,278-281）报道了阿扎霉素B发酵液用二氯甲烷萃取，浓缩萃取液后用乙酸乙酯结晶。该方法的缺点是二氯甲烷不但毒性大，而且沸点低，溶剂回收率低，造成生产成本较高。Arai（ARAIM.:AzalomycinBandF,twonewantibiotics.J.Antibint.Ser.A1959,13,46-56）描述了一种阿扎霉素B的制备方法，用丙酮萃取发酵液后浓缩得到粗晶体，然后用甲醇结晶。该方法的缺点是阿扎霉素B在甲醇溶液中非常容易生成11、11’-二甲氧基阿扎霉素B，造成结晶收率低。江曙、黄为一(江曙、黄为一，阿扎霉素B提取纯化工艺的优化[J],生物技术，2008，18（4）：74-76)将阿扎霉素B的发酵液进行加热处理后,采用乙醇-乙酸乙酯的浸提系统，进行结晶、重结晶和柱层析制备，得到的阿扎霉素B纯度达到98.1%,收率达到91.2%。该方法存在以下缺点：（1）滤液未经脱色除杂，直接得到粗提物，含杂质较多，对下游纯化介质造成的损伤大；（2）采用乙醇-乙酸乙酯混合溶剂浸提系统，由于乙醇和乙酸乙酯的沸点非常相近，蒸馏时两种溶剂无法完全分开。混合溶剂回收重复使用时会造成混合溶剂的比例变化，从而导致浸提收率不稳定。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，研究设计一种制备高纯度、低成本的阿扎霉素B的制备工艺。本发明采用大孔脱色树脂及吸附树脂提取分离阿扎霉素B，得到高含量的阿扎霉素产品，含量大于98.5%，总收率大于70%。工艺简单易行，适于工业化规模生产高纯度阿扎霉素B产品。

下面对本发明进行具体描述：

本发明的目的是这样实现的:在阿扎霉素B发酵液中加入助滤剂，搅拌均匀，过滤，浸提，浸提液通过大孔脱色树脂脱色，除去大部分色素，降低浸提液色素比值；脱色液采用大孔吸附树脂吸附，通过梯度解吸，有效地去除了发酵代谢过程中产生的杂质；解吸液浓缩、萃取得到粗提物；粗提物用溶剂溶解后结晶，过滤，干燥，得到阿扎霉素B产品。

本发明所得阿扎霉素B可供药品使用，最重要的是作为合成、半合成非抗菌化合物的重要中间体使用。阿扎霉素B含量可达98.5%以上，单杂小于1%，样品回收率大于70%。

具体地，本发明涉及一种高纯度阿扎霉素B的制备方法，包括下述步骤：

1）常温下，在发酵液中加入助滤剂搅拌30分钟-90分钟至助滤剂分散均匀，固液分离，得到阿扎霉素B菌丝体；

2）常温条件下，在阿扎霉素B菌丝体中加入70-95%的乙醇浸泡，固液分离，得到阿扎霉素B浸提液；

3）将阿扎霉素B浸提液通过大孔脱色树脂脱色，得到脱色液；

4）将阿扎霉素B脱色液用水稀释至乙醇浓度30%-40%后导入大孔吸附树脂吸附；

5）吸附完毕，使用极性溶剂与水的混合液进行梯度解吸，HPLC在线监测，收集HPLC含量大于95%的阿扎霉素B解吸液，浓缩，得解吸浓缩液；

6）解吸浓缩液萃取后，浓缩，得阿扎霉素B粗提物；

7）粗提物加入溶剂结晶，固液分离得到阿扎霉素B精粉。

其中，步骤1）中调节发酵液中加入的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为珍珠岩，助滤剂的用量为每升发酵液加入助滤剂0.01-0.1千克，优选为0.02-0.04千克；搅拌时间为30分钟-90分钟。

步骤2）中70-90%乙醇的加入量为每千克菌丝中加入2-6升。

步骤3）中的大孔脱色树脂为S-8、LX-700、D290、XDA-7或D301树脂，优选为D301或LX-700树脂。树脂的用量为每升阿扎霉素B浸提液使用树脂0.01-0.1升，优选为0.02-0.03升。

步骤4）中的大孔吸附树脂为XAD-1600、HZ816、AB-8、X-5和D312树脂，优选为D312树脂和HZ816树脂，解吸剂为甲醇、乙醇或异丙醇的水溶液，优选为乙醇的水溶液。树脂的用量为每升阿扎霉素B浸提液使用树脂0.01-0.1升，优选为0.02-0.04升。

步骤5）中梯度解吸，是指吸附完毕后，先用20-50%的溶剂洗饱和树脂，优选为30-40%。然后用70-90%的溶剂进行解吸，优选为80-85%。

步骤6）解吸浓缩液用乙酸乙酯萃取，去离子水洗涤。乙酸乙酯萃取液在20℃-50℃条件下真空浓缩,得到阿扎霉素B粗提物。

步骤7）的结晶，要求每千克阿扎霉素B粗提物中加入3-10升的乙酸乙酯、异丙醇或乙醇，优选为5-7升。结晶液过滤后真空干燥，得到白色的阿扎霉素B精粉。

本发明所得阿扎霉素B可供药品使用，最重要的是作为合成、半合成非抗菌化合物的重要中间体使用。阿扎霉素B含量可达98.5%以上，单杂小于1%，样品回收率大于70%。

本发明有如下优点：

1.固液分离过程中加入了助滤剂，提高了过滤速度，缩短了工艺周期。同时经过固液分离舍弃了含色素、蛋白质及其他大极性杂质的发酵液，提高了浸提液的质量。2.大孔脱色树脂的应用，去除了提取液中大部分色素，有效降低了色素比值，提高了脱色液的澄清度和质量。3.采用大孔吸附树脂对目的产物进行富集和纯化，进一步摒弃了发酵次级代谢产物的干扰，提高了目的产物的质量。4.解吸过程采用非连续梯度解吸法，低浓度的溶剂冲洗树脂柱可除去树脂吸附上的大部分色素和强极性杂质，之后采用高浓度的溶剂解吸，解吸液质量大幅提高。5.工艺简单，样品回收率高，全程总收率达到70%以上，提取成本低，适用于工业化生产。6.质量可控，为生产药用级原料提供了更加安全的技术保障。

附图说明

图1：阿扎霉素B精粉的液相色谱图。

图2：阿扎霉素B精粉的液质图。

图3：阿扎霉素B精粉的¹³C-NMR图谱。

图4：阿扎霉素B精粉的¹H-NMR图谱。

具体实施例

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。除非特别言明，本发明中所有百分比均为体积百分比。

本发明所使用的阿扎霉素B发酵液为华北制药集团新药研究开发有限责任公司用微生物培养手段，得到的阿扎霉素B发酵液。大孔树脂HZ816、D290、D312，上海华震公司生产；大孔树脂S-8、D301，安徽三星公司生产；大孔树脂XDA-7，西安电力树脂厂；LX-700、AB-8，西安蓝晓公司生产；XAD-1600、X-5，罗门哈斯公司生产；乙醇、甲醇等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵（Waters公司）。

实施例1

取阿扎霉素B发酵液10L，发酵单位2510μg/mL。在发酵液中加入1kg珍珠岩，搅拌30分钟后真空抽滤，得到3.2kg菌丝体。常温下，在菌丝体中加入6.4L70%的乙醇，机械搅拌1小时后真空抽滤，洗涤菌丝体得到7.0升浸提液。将浸提液通过径高比为1：3的D301树脂柱进行脱色，树脂装量为70mL，流速为70mL/h。收集脱色液，调乙醇浓度至30%，导入径高比为1：3的HZ816树脂柱吸附，树脂装量为70mL，流速为70mL/h。饱和树脂用20%的乙醇净化洗涤，然后用70%的乙醇解吸，解吸流速为35mL/h。解吸液浓缩，用乙酸乙酯萃取，去离子水洗涤，乙酸乙酯相在20度下真空浓缩后得到阿扎霉素B粗提物26.4g。阿扎霉素B粗提物用79.2mL乙酸乙酯溶解，缓慢降温到2℃-8℃，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，最后得到18.3g白色阿扎霉素B产品（见图1-4），收率为72.0%。HPLC含量为98.6%，其中最大单杂<1.0%。

实施例2

取阿扎霉素B发酵液100L，发酵单位2729μg/mL。在发酵液中加入5kg珍珠岩，搅拌60分钟后板框压滤，得到35.5kg菌丝体。常温下，在菌丝体中加入142L80%的乙醇，机械搅拌1小时后板框压滤，洗涤菌丝体得到150升浸提液。将浸提液通过径高比为1：4的LX-700树脂柱进行脱色，树脂装量为7.5L，流速为15L/h。收集脱色液，调酒精度至35%，导入径高比为1：4的D312树脂柱吸附，树脂装量为7.5L，流速为11.2L/h。饱和树脂用30%的甲醇净化洗涤，然后用80%的甲醇解吸，解吸流速为6.0L/h。解吸液浓缩，用乙酸乙酯萃取，去离子水洗涤，乙酸乙酯相在35度下真空浓缩后得到阿扎霉素B粗提物262.3g。阿扎霉素B粗提物用1600mL异丙醇溶解，缓慢降温到2℃-8℃，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，最后得到201.7g白色阿扎霉素B产品，收率为73.2%。HPLC含量为98.8%，其中最大单杂<1.0%。

实施例3

取阿扎霉素B发酵液1000L，发酵单位2630μg/mL。在发酵液中加入10kg珍珠岩，搅拌90分钟后板框压滤，得到410kg菌丝体。常温下，在菌丝体中加入2460L95%的乙醇，机械搅拌1小时后板框压滤，洗涤菌丝体得到2500升浸提液。将浸提液通过径高比为1：5的D301树脂柱进行脱色，树脂装量为250L，流速为750L/h。收集脱色液，调酒精度至40%，导入径高比为1：6的HZ816树脂柱吸附，树脂装量为250L，流速为500L/h。饱和树脂用50%的异丙醇净化洗涤，然后用90%的异丙醇解吸，解吸流速为250L/h。解吸液浓缩，用乙酸乙酯萃取，去离子水洗涤，乙酸乙酯相在50℃下真空浓缩后得到阿扎霉素B粗提物2535g。阿扎霉素B粗提物用25.35L乙醇溶解，缓慢降温到2℃-8℃，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，最后得到1935.9g白色阿扎霉素B产品，收率为72.8%。HPLC含量为98.9%，其中最大单杂<1.0%。

Claims (6)

1.一种阿扎霉素B的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

1）常温下，在发酵液中加入助滤剂搅拌30分钟-90分钟至助滤剂分散均匀，固液分离，得到阿扎霉素B菌丝体；所述助滤剂为珍珠岩，助滤剂的用量为每升发酵液加入助滤剂0.02-0.04千克；

2）常温条件下，在阿扎霉素B菌丝体中加入70-95%的乙醇浸泡，固液分离，得到阿扎霉素B浸提液；所述乙醇的加入量为每千克菌丝中加入2-6升；

3）将阿扎霉素B浸提液通过大孔脱色树脂脱色，得到脱色液，所述大孔脱色树脂为D301或LX-700树脂；

4）将阿扎霉素B脱色液用水稀释至乙醇浓度30%-40%后导入大孔吸附树脂吸附，所述大孔吸附树脂为D312或XAD-1600树脂；

5）吸附完毕，使用极性溶剂与水的混合液进行梯度解吸，HPLC在线监测，收集HPLC含量大于95%的阿扎霉素B解吸液，浓缩，得解吸浓缩液；所述极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种，所述梯度解吸，是指吸附完毕后，先用30-40%的溶剂洗饱和树脂，然后用80-85%的溶剂进行解吸；

6）解吸浓缩液用乙酸乙酯萃取，去离子水洗涤，浓缩，得阿扎霉素B粗提物；

7）粗提物加入溶剂结晶，固液分离得到阿扎霉素B精粉；所述结晶要求每千克阿扎霉素B粗提物中加入5-7升的乙酸乙酯、异丙醇或乙醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3）中树脂的用量为每升阿扎霉素B浸提液使用树脂0.01-0.1升，树脂柱径高比为1：3-1：5，流速为1-3倍柱体积/小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4）中的树脂的用量为每升阿扎霉素B浸提液使用树脂0.01-0.1升，树脂柱径高比为1：3-1：6，流速为1-2倍柱体积/小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤5）中梯度解吸的流速为0.5-1倍柱体积/小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤6）中乙酸乙酯萃取液在20℃-50℃条件下真空浓缩,得到阿扎霉素B粗提物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤7）中结晶液过滤后真空干燥，得到白色的阿扎霉素B精粉。