CN111171096A - 一种多杀菌素的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多杀菌素的提取方法，包括以下步骤：1)将发酵液的pH调节至8.5‑9.5，得到预处理的发酵液；2)将得到的预处理后的发酵液过滤并收集滤饼；3)将得到的滤饼使用甲醇‑水溶液搅拌浸提，过滤得到浸提液；4)将得到的浸提液过强碱性阴离子树脂脱色并浓缩至无甲醇流出，得到脱色浓缩液；5)在得到的脱色浓缩液中加入非水溶性有机溶剂萃取，收集负载有机相；6)向得到的负载有机相中加入酸水反萃取，收集反萃取相；7)搅拌状态下，调节得到的反萃取相至pH为9.0‑10.0，使多杀菌素以结晶形式沉淀出来，过滤，烘干，得到多杀菌素粉末。使用本发明的方法最终获得的产品纯度≥99.5％，远远高于现有技术的方法能达到的水平。

Description

一种多杀菌素的提取方法

技术领域

本发明属于制药技术领域，涉及一种多杀菌素的提取方法，更具体地涉及从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法，本发明还进一步地提供了将得到的多杀菌素粗品精制的方法。

背景技术

多杀菌素(Spinosad)是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的一种大环内酯类化合物，其主要活性成份为Spinosyn A(约占80-90％)和Spinosyn D(约占10-20％)。

Spinosyn A：R＝H；Spinosyn D：R＝CH₃

多杀菌素结构式

多杀菌素是一种新型的具有触杀及摄食毒性的广谱生物杀虫剂，为微生物源生物农药，高效、快速、低毒。目前有报道的多杀菌素提取分离的文献主要有吸附法和溶媒萃取法。

吸附法是利用一种适当的吸附剂，把发酵滤液中的多杀菌素吸附，然后用有机溶剂把多杀菌素从吸附剂上洗脱出来，再经浓缩后即可得到多杀菌素的初制品。吸附法的基本步骤是向发酵液中加入一定体积的丙酮等极性溶剂并充分浸取，过滤后，将滤液调至碱性，然后上吸附剂，再用有机溶剂洗脱多杀菌素A和多杀菌素D组分，其关键技术是吸附剂及吸附、解吸附条件的选择。例如(1)陶氏益农的Baker P J等[US5227295，1993-07-13]以HP-20ss吸附树脂为吸附剂，以0％～95％甲醇:乙腈＝1:1(含0.1％乙酸钠)溶液梯度洗脱多杀菌素A和多杀菌素D组分，利用HPLC进行跟踪检测，并分段收集洗脱液，将多杀菌素洗脱液浓缩后将其用石油醚稀释，稀释液上硅胶层析柱，用石油醚和甲醇梯度洗脱，利用HPLC跟踪检测，分段收集洗脱液，分别得到多杀菌素A和多杀菌素D的洗脱液；(2)王琨等[离子交换与吸附，2005，21(5)：444～451]用DM11树脂为吸附剂，最佳吸附pH9.5，上柱流速6BV/h，丙酮解吸流速1.5BV/h，回收率较高，达到85.8％；(3)胡西洲等[华中农业大学学报，2006，25(4):397～399]采用XAD-4大孔树脂为吸附材料，pH＝11，流速为1/6(L/min)，加入2％氯化钠条件下，采用丙酮梯度解吸，得出XAD-4大孔树脂吸附容量为1.09×104μg/mL(湿树脂)，吸附率为74.6％，解吸率为86.7％，收率达到64.7％；(4)李继安等[CN101560231B，2012-09-26]用大孔吸附树脂柱YPR-II为吸附剂，五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质，然后分别用20、10、1倍柱体积的浓度为40％、60％、80％，pH分别为7.0、9.0、7.0的丙酮水溶液洗脱吸附柱，最后用100％丙酮进行洗脱，合并洗脱效价较高的收集单元，进一步精制得到了多杀菌素粗制品，提取总收率达到70.1％，产品纯度为97％。

溶媒萃取法的原理是利用多杀菌素与杂质在溶媒中的溶解度不同，将多杀菌素有选择性地从一种溶剂转移到另一种溶剂中，从而达到浓缩去杂的目的，例如夏立秋等[CN101906124B，2013-03-27]公开的溶媒法提取多杀菌素，具体工艺为：①发酵液预处理；②加入高介电常数极性有机溶剂浸泡提取多杀菌素，进行固液分离，收集浸提清液；③通过真空浓缩，挥发除去高介电常数极性溶剂，得到多杀菌素浓缩液；④加入低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，得到负载有机相；⑤负载有机相中加入酸水进行反萃取，收集反萃取相；⑥挥发除去反萃取相中残留的萃取溶媒，用NaOH溶液调节pH＝8.5～11.5，使多杀菌素沉淀，过滤，用稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤1～3次，真空干燥，即得到多杀菌素粉剂。该发明总收率可达80％以上，但该专利未给出产品纯度的数据。

中国专利文献CN 101906124 A公开了一种从刺糖多孢发酵液中提取多杀菌素的工艺：它是将发酵液经过预处理后，加入高介电常数极性有机溶剂浸泡提取多杀菌素，进行固液分离，收集浸提清液，然后通过真空浓缩，挥发除去高介电常数极性溶剂，得到多杀菌素浓缩液；然后加入低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，得到负载有机相；加入酸水进行反萃取，收集反萃取相；用NaOH溶液调节pH值＝8.5～11.5，使多杀菌素沉淀，过滤，用稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤1～3次，真空干燥，得到多杀菌素粉剂。该工艺采用萃取与反萃取相结合的技术路线，所需设备发展相对成熟，较容易实现工业化生产。但由于该工艺采用的是发酵液直接溶剂萃取法，需要较大溶媒浸提(1.5倍发酵液体积)才能保证多杀菌素的浸提收率，且浸提完成后还需要进一步将浓缩除去高介电常数极性溶剂，该过程存在溶媒使用量大，除去溶剂需要能耗较大，生产周期长(发酵液需搅拌提取4～20h)等问题；另外多杀菌素沉淀出多杀菌素粉末后该工艺仅采用稀碱液洗涤的方法未能较好的提高多杀菌素的内在质量，粉末的大部分色素以及调碱一同析出的杂质无法根除，且产品晶型较差(因为调碱析出结晶速率较快)。

中国专利文献CN 107474088 A公开了一种从刺糖多孢发酵液中提取多杀菌素，并具体公开了：发酵液预处理，板框过滤，闪蒸烘干；甲醇浸泡菌丝；浓缩浸提液，转相水洗；使用酒石酸反萃取；调节pH离心得到多杀菌素粉末；利用甲醇重结晶得到多杀菌素精品。本发明采用菌丝分离烘干后浸提的方式提取多杀菌素，浸取效率高，溶媒使用量小，仅为发酵液直接溶媒萃取的一半，且能耗相对较低，生产周期缩短；另外，板框过滤、闪蒸烘干、浸提、浓缩、水洗、反萃取、精制所需的设备比较普遍，很容易实现工业化生产；所得产品收率高，达到了85％～90％，采用溶媒重结晶纯化多杀菌素粗结晶后提升了多杀菌素的质量，产品含量达到了95％～98％。

基于以上，当前对制备高纯度的多杀菌素产品的方法以及适合大规模工业化生产的多杀菌素提取方法存在需求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高纯度多杀菌素的提取方法。本发明提供的方法材料简单易得，获得的多杀菌素的产品纯度高，适合大规模工业化生产。

一方面，本发明提供了一种多杀菌素的提取方法，所述方法包括以下步骤：

1)将发酵液的pH调节至8.5-9.5，得到预处理的发酵液；

2)将步骤1)得到的预处理的发酵液过滤并收集滤饼；

3)将步骤2)得到的滤饼使用甲醇-水溶液搅拌浸提，过滤得到浸提液；

4)将步骤3)得到的浸提液过强碱性阴离子树脂柱脱色并浓缩至无甲醇流出，得到脱色浓缩液；

5)在步骤4)得到的脱色浓缩液中加入非水溶性有机溶剂萃取，萃取条件为：有机溶剂与多杀菌素浓缩液的体积比为1:1-3，温度20-40℃，pH为7-10，萃取时间5-15min，萃取完成分层后，收集负载有机相；

6)向步骤5)得到的负载有机相中加入酸水反萃取，反萃取条件为：负载有机相与酸水的体积比为1-2:1，酸水浓度为0.2-0.5mol/L，温度15-35℃，反萃取时间为5-15min，反萃取分层完成后，收集反萃取相；

7)搅拌状态下，调节步骤6)得到的反萃取相至pH为9.0-10.0，使多杀菌素以结晶形式沉淀出来，过滤，烘干，得到多杀菌素粉末。

优选地，在步骤1)中，将预处理的发酵液使用助滤剂过滤；更优选地，所述助滤剂为珍珠岩；进一步优选地，所述珍珠岩的使用量为15-20kg珍珠岩/m³发酵液；

优选地，在步骤1)中，使用1-2M的氢氧化钠溶液调节pH值；

优选地，在步骤2)中，使用板框压滤机过滤；

优选地，在步骤3)中，所述甲醇-水溶液中的甲醇与水的体积比为2-5:1；更优选地为4:1；

优选地，在步骤3)中，所述搅拌浸提的时间不少于3小时；

优选地，在步骤3)中，所述滤饼与甲醇-水溶液的质量/体积(kg/L)为1:6-8；

优选地，在步骤4)中，所述强碱性阴离子树脂为A850强碱阴离子脱色树脂或201x7强碱阴离子树脂；

优选地，在步骤4)中，过柱的浸提液体积为树脂体积的10-20倍；优选地，在步骤5)中，所述非水溶性有机溶剂为乙酸丁酯或者正庚烷；

优选地，在步骤6)中，所述酸水为酒石酸水溶液；

在一个优选的实施方案中，本发明的方法还进一步包括精制的步骤，所述步骤是通过包含以下方法的步骤实现的：

①将多杀菌素粉末用水溶性有机溶剂溶解，升温至50-60℃，溶清后，在搅拌状态下滴加纯化水，在15-20℃下，缓慢降温析晶，过滤，得到多杀菌素精制结晶粉，并且多批收集结晶母液；

②将步骤①得到的结晶粉用低极性非水溶性有机溶剂溶解，得到上柱液；

③将步骤②得到的上柱液和步骤①收集的结晶母液分别上硅胶柱，层析分离，洗脱溶剂为石油醚/乙酸乙酯或石油醚/丙酮，洗脱过程用HPLC监控层析液中多杀菌素A和多杀菌素D的纯度，分段收集多杀菌素A和多杀菌素D的层析液；

④将步骤③得到的多杀菌素A的层析液合并，多杀菌素D层析液合并，分别浓缩至干，分别得到多杀菌素A和多杀菌素D的固体粉末。

优选地，所述方法还包括：

⑤将步骤④得到的多杀菌素A固体粉末用乙醇溶解后，滴加到纯化水中沉淀析出，过滤、烘干，得到高纯度的多杀菌素A产品；

和/或将步骤④得到的多杀菌素D固体粉末用乙醇溶解后，滴加到纯化水中沉淀析出，过滤、烘干，得到高纯度的多杀菌素D产品。

优选地，乙醇-水体系最终的乙醇度(体积浓度)控制在10-30％。

优选地，在步骤①中，所述水溶性有机溶剂选自C₁-C₃的醇、C₃-C₄的酮中的一种或多种；更优选地，所述C₁～C₃的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇或正丙醇中的一种或多种；更优选地，所述C₃～C₄的酮为丙酮。

优选地，在步骤②中，所述低极性非水溶性有机溶剂为石油醚或者正庚烷；

优选地，在步骤③中，硅胶层析的洗脱溶剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1，硅胶上柱量为10-15g/L；

优选地，在步骤③中，使用紫外点板显色的方式判断多杀菌素是否开始洗出，然后分段收集HPLC检测纯度；

优选地，在步骤④中，将多杀菌素A和多杀菌素D层析液合并，浓缩至干，得到多杀菌素A和多杀菌素D的粉末；更优选地，将步骤④得到的多杀菌素粉末用乙醇溶解后，滴加到纯化水中沉淀析出，过滤、烘干，得到高纯度的多杀菌素产品；

优选地，在步骤⑤中，乙醇-水体系最终的乙醇度(体积浓度)控制在10-30％。

通过使用本发明的方法，最终得到的多杀菌素A、多杀菌素D、多杀菌素A+多杀菌素D的纯度均≥99.5％，也就是说，使用本发明的方法得到的多杀菌素产品纯度高，单杂低。此外，本发明提供的提取方法易于操作，适合大规模工业生产。本发明的提取方法中使用的溶剂成本低廉且容易获得，适合大规模工业化生产，制得的多杀菌素产品具有更高的纯度。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为多杀菌素标准品HPLC检测图谱；

图2为多杀菌素发酵液样品HPLC检测图谱；

图3为多杀菌素产品HPLC检测图谱；

图4为多杀菌素A产品HPLC检测图谱；

图5为多杀菌素D产品HPLC检测图谱；

图6为多杀菌素A+D产品HPLC检测图谱。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，现结合附图和实施例进一步阐述本发明，应当理解，本发明的具体实施例仅用于说明目的，而非对本发明的限制。

实施例1

1.1从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素

1)取多杀菌素发酵液20L【批号为A20180820，500L发酵罐罐放罐】，效价为2.0g/L，加入2MNaOH溶液调pH为9.0，搅拌10分钟后，加入400g珍珠岩，继续搅拌30分钟；

图2为多杀菌素发酵液样品HPLC检测图谱；下表1为所述HPLC检测图谱的数据。

表1

2)然后用板框过滤，用水顶洗至颜色较浅，停止过滤，得到滤饼3.9kg；

3)滤饼用25L甲醇-水(甲醇与水体积比为4:1)溶液搅拌浸提5h，过滤得到浸提液26L；

4)浸提液过1.5L强碱性阴离子树脂(A850)脱色，收集流出液，过柱后，用3L同浓度的甲醇-水溶液顶洗脱色柱残留的多杀菌素。脱色液用旋转蒸发仪真空浓缩去除甲醇，直到甲醇不再流出，得到脱色浓缩液，浓缩收率99.0％；

5)浓缩液用等体积的乙酸丁酯萃取，萃取条件为：pH＝9.2，温度20-25℃，萃取时间15min，萃取完成后分层得到负载有机相，萃取收率98.5％；

6)负载有机相用0.5mol/L的酒石酸溶液反萃取，反萃取条件为：两相体积比为1:1，温度25-30℃，反萃取时间15min，反萃取后静置、分层，得到反萃取相，反萃取收率95.1％；

7)在搅拌状态下，将反萃取相用2M的NaOH溶液调节pH至9.5，通过减压过滤的方式得到多杀菌素粉末沉淀，用纯化水顶洗去除多余的灰分，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素粉末31.6g，检测HPLC纯度为90.2％，质量收率为79％。

1.2精制多杀菌素

①将多杀菌素粉末31.6g(质量)用250ml无水乙醇溶解，溶清后升温至60℃，加入200ml纯化水，加毕，开始缓慢降温析晶，温度降至15℃时，保持搅拌30min，过滤，得到多杀菌素结晶精品以及结晶母液；

②将结晶粉用850ml石油醚溶解，得到石油醚上柱液；

③将上柱液和结晶母液分别上1500ml硅胶柱，上柱流速为1BV/h，上柱毕，用1BV石油醚预洗，预洗后用石油醚：乙酸乙酯＝2:1的溶剂洗脱，每1BV收集一次，分别检测HPLC纯度，收集纯度≥99.5％的多杀菌素A洗脱液；

④洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩至干；

⑤干品用150ml无水乙醇溶解后，反滴到1200ml纯化水中沉淀析出，过滤得到多杀菌素湿粉，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素A 10.2g，HPLC检测，多杀菌素A纯度为99.87％，见图4和下表2。

表2

图1为多杀菌素标准品HPLC检测图谱，下表3为多杀菌素标准品HPLC检测图谱的数据表。

表3

图3为多杀菌素产品HPLC检测图谱，下表4为多杀菌素标准品HPLC检测图谱的数据表。

表4

实施例2

2.1从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素

1)取多杀菌素发酵液20L【批号为A20180820，取自500L发酵罐培养液】，效价为2.0g/L，加入2MNaOH溶液调pH为8.5，搅拌10分钟后，加入300g珍珠岩，继续搅拌30分钟；

2)然后用板框过滤，用水顶洗至颜色较浅，停止过滤，得到滤饼3.8kg；

3)滤饼用30.4L甲醇-水(甲醇与水体积比为2:1)溶液搅拌浸提5h，过滤得到浸提液31L；

4)浸提液过1.5L强碱性阴离子树脂(A850)脱色，收集流出液，过柱后，用3L同浓度的甲醇-水溶液顶洗脱色柱残留的多杀菌素。脱色液用旋转蒸发仪真空浓缩去除甲醇，直到甲醇不再流出，得到脱色浓缩液，浓缩收率98.7％；

5)浓缩液用等体积的乙酸丁酯萃取，萃取条件为：pH＝7.0，温度20℃，萃取时间15min，萃取完成后分层得到负载有机相，萃取收率98.5％；

6)负载有机相用0.2mol/L的酒石酸溶液反萃取，反萃取条件为：两相体积比为1:1，温度15℃，反萃取时间15min，反萃取后静置、分层，得到反萃取相，反萃取收率95.5％；

7)在搅拌状态下，将反萃取相用2M的NaOH溶液调节pH至9.0，通过减压过滤的方式得到多杀菌素粉末沉淀，用纯化水顶洗去除多余的灰分，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素粉末32.1g，检测HPLC纯度90.1％，质量收率为78.3％。

2.2精制多杀菌素

①将多杀菌素粉末32.1g，用250ml无水乙醇溶解，溶清后升温至60℃，加入200ml纯化水，加毕，开始缓慢降温析晶，温度降至20℃时，保持搅拌30min，过滤，得到多杀菌素结晶精品以及结晶母液；

②将结晶粉用800ml石油醚溶解，得到石油醚上柱液；

③将上柱液和结晶母液分别上1500ml硅胶柱，上柱流速为1BV/h，上柱毕，用1BV石油醚预洗，预洗后用石油醚：乙酸乙酯＝2:1的溶剂洗脱，每1BV收集一次，分别检测HPLC纯度，混合纯度≥99.5％的多杀菌素A和多杀菌素D的洗脱液；

④洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩至干；

⑤干品用150ml无水乙醇溶解后，反滴到1100ml纯化水中沉淀析出，过滤得到多杀菌素湿粉，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素A和多杀菌素D共计10.9g，HPLC检测，多杀菌素(A+D)纯度为99.70％，见图6和下表5

表5

实施例3

3.1从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素

1)取多杀菌素发酵液20L【批号为A20180820，取自500L发酵罐培养液】，效价为2.0g/L，加入2MNaOH溶液调pH为9.0，搅拌10分钟后，加入400g珍珠岩，继续搅拌30分钟；

2)然后用板框过滤，用水顶洗至颜色较浅，停止过滤，得到滤饼4.2kg；

3)滤饼用25.6L甲醇-水(甲醇与水体积比为5:1)溶液搅拌浸提3h，过滤得到浸提液26.5L；

4)浸提液过2.5L强碱性阴离子树脂(201×7)脱色，收集流出液，过柱后，用3L同浓度的甲醇-水溶液顶洗脱色柱残留的多杀菌素。脱色液用旋转蒸发仪真空浓缩去除甲醇，直到甲醇不再流出，得到脱色浓缩液，浓缩收率98.5％；

5)浓缩液三分之一体积的正庚烷萃取，萃取条件为：pH＝10.0，温度40℃，萃取时间5min，萃取完成后分层得到负载有机相，萃取收率98.2％；

6)负载有机相用0.5mol/L的酒石酸溶液反萃取，反萃取条件为：两相体积比为2:1，温度35℃，反萃取时间15min，反萃取后静置、分层，得到反萃取相，反萃取收率94.6％；

7)在搅拌状态下，将反萃取相用2M的NaOH溶液调节pH至10.0，通过减压过滤的方式得到多杀菌素粉末沉淀，用纯化水顶洗去除多余的灰分，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素粉末35.2g，检测HPLC纯度90.2％，质量收率为80％。

3.2精制多杀菌素

①将多杀菌素粉末35.2g，用280ml甲醇溶解，溶清后升温至50℃，加入200ml纯化水，加毕，开始缓慢降温析晶，温度降至15℃时，保持搅拌30min，过滤，得到多杀菌素结晶精品以及结晶母液；

②将结晶粉用850ml正庚烷溶解，得到正庚烷上柱液；

③将上柱液和结晶母液分别上1500ml硅胶柱，上柱流速为1BV/h，上柱毕，用1BV正庚烷预洗，预洗后用石油醚：丙酮＝5:1的溶剂洗脱，每1BV收集一次，检测HPLC纯度，收集纯度≥99.5％的多杀菌素D的洗脱液；

④洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩至干；

⑤干品用20ml无水乙醇溶解后，反滴到170ml纯化水中沉淀析出，过滤得到多杀菌素湿粉，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素0.8g，HPLC检测，多杀菌素D纯度为99.53％，见图5和下表6。

表6

实施例4

4.1从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素

1)取多杀菌素发酵液15L【批号为A20180820，取自500L发酵罐培养液】，效价为2.0g/L，加入2MNaOH溶液调pH为8.5，搅拌10分钟后，加入300g珍珠岩，继续搅拌30分钟；

2)然后用板框过滤，用水顶洗至颜色较浅，停止过滤，得到滤饼3.3kg；

3)滤饼用20L甲醇-水(甲醇与水体积比为4:1)溶液搅拌浸提6h，过滤得到浸提液20.5L；

4)浸提液过1.5L强碱性阴离子树脂(A850)脱色，收集流出液，过柱后，用3L同浓度的甲醇-水溶液顶洗脱色柱残留的多杀菌素。脱色液用旋转蒸发仪真空浓缩去除甲醇，直到甲醇不再流出，得到脱色浓缩液，浓缩收率99％；

5)浓缩液用等体积的正庚烷萃取，萃取条件为：pH＝8.9，温度20℃，萃取时间15min，萃取完成后分层得到负载有机相，萃取收率98.8％；

6)负载有机相用0.5mol/L的酒石酸溶液反萃取，反萃取条件为：两相体积比为1:1，温度25℃，反萃取时间15min，反萃取后静置、分层，得到反萃取相，反萃取收率95.3％；

7)在搅拌状态下，将反萃取相用2M的NaOH溶液调节pH至9.4，通过减压过滤的方式得到多杀菌素粉末沉淀，用纯化水顶洗去除多余的灰分，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素粉末23.9g，检测HPLC纯度90.3％，质量收率为79.7％。

4.2精制多杀菌素

①将多杀菌素粉末23.9g，用200ml丙酮溶解，溶清后升温至60℃，加入90ml纯化水，加毕，开始缓慢降温析晶，温度降至15℃时，保持搅拌30min，过滤，得到多杀菌素结晶精品以及结晶母液；

②将结晶粉用600ml石油醚溶解，得到石油醚上柱液；

③将上柱液和结晶母液分别上1200ml硅胶柱，上柱流速为1BV/h，上柱毕，用1BV石油醚预洗，预洗后用石油醚：丙酮＝5:1的溶剂洗脱，每1BV收集一次，分别检测HPLC纯度，混合纯度≥99.5％的多杀菌素A和多杀菌素D的洗脱液；

④洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩至干；

⑤干品用100ml无水乙醇溶解后，反滴到850ml纯化水中沉淀析出，过滤得到多杀菌素湿粉，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素A和多杀菌素D共计8.6g，HPLC检测，多杀菌素(A+D)纯度为99.63％。

实施例5

5.1从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素

1)取多杀菌素发酵液15L【批号为A20180820，取自500L发酵罐培养液】，效价为2.0g/L，加入2MNaOH溶液调pH为9.5，搅拌10分钟后，加入300g珍珠岩，继续搅拌30分钟；

2)然后用板框过滤，用水顶洗至颜色较浅，停止过滤，得到滤饼3.4kg；

3)滤饼用20L甲醇-水(甲醇与水体积比为4:1)溶液搅拌浸提5h，过滤得到浸提液21.0L；

4)浸提液过1.5L强碱性阴离子树脂(A850)脱色，收集流出液，过柱后，用3L同浓度的甲醇-水溶液顶洗脱色柱残留的多杀菌素。脱色液用旋转蒸发仪真空浓缩去除甲醇，直到甲醇不再流出，得到脱色浓缩液，浓缩收率97.9％；

5)浓缩液用等体积的正庚烷萃取，萃取条件为：pH＝9.1，温度25℃，萃取时间15min，萃取完成后分层得到负载有机相，萃取收率98.2％；

6)负载有机相用0.5mol/L的酒石酸溶液反萃取，反萃取条件为：两相体积比为1:1，温度30℃，反萃取时间15min，反萃取后静置、分层，得到反萃取相，反萃取收率95.0％；

7)在搅拌状态下，将反萃取相用2M的NaOH溶液调节pH至9.47，通过减压过滤的方式得到多杀菌素粉末沉淀，用纯化水顶洗去除多余的灰分，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素粉末23.5g，检测HPLC纯度90.2％，质量收率为78.3％。

5.2精制多杀菌素

①将多杀菌素粉末23.5g，用200ml甲醇溶解，溶清后升温至60℃，加入85ml纯化水，加毕，开始缓慢降温析晶，温度降至10℃时，保持搅拌30min，过滤，得到多杀菌素结晶精品(作为兽药级产品)以及结晶母液；

②将结晶粉用600ml石油醚溶解，得到石油醚上柱液；

③将上柱液和结晶母液分别上1200ml硅胶柱，上柱流速为1BV/h，上柱毕，用1BV石油醚预洗，预洗后用石油醚：乙酸乙酯＝2:1的溶剂洗脱，每1BV收集一次，分别检测HPLC纯度，混合纯度≥99.5％的多杀菌素A和多杀菌素D的洗脱液；

④洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩至干；

⑤干品用100ml无水乙醇溶解后，反滴到850ml纯化水中沉淀析出，过滤得到多杀菌素湿粉，在50℃的温度下，真空干燥，得到多杀菌素A和多杀菌素D共计8.1g，HPLC检测，多杀菌素(A+D)纯度为99.76％。

搅拌浸提尽管已经对本发明的具体实施方式进行了详细说明和描述，但应当认识到，本发明不受所述具体实施方式的限制。在不脱离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改进、修饰和变化，而这些改进、修饰和变化均在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种多杀菌素的提取方法，所述方法包括以下步骤：

1)将发酵液的pH调节至8.5-9.5，得到预处理的发酵液；

2)将步骤1)得到的预处理的发酵液过滤并收集滤饼；

3)将步骤2)得到的滤饼使用甲醇-水溶液搅拌浸提，过滤得到浸提液；

4)将步骤3)得到的浸提液过强碱性阴离子树脂柱脱色并浓缩至无甲醇流出，得到脱色浓缩液；

5)在步骤4)得到的脱色浓缩液中加入非水溶性有机溶剂萃取，萃取条件为：有机溶剂与多杀菌素浓缩液的体积比为1:1-3，温度20-40℃，pH为7-10，萃取时间5-15min，萃取完成分层后，收集负载有机相；

6)向步骤5)得到的负载有机相中加入酸水反萃取，反萃取条件为：负载有机相与酸水的体积比为1-2:1，酸水浓度为0.2-0.5mol/L，温度15-35℃，反萃取时间为5-15min，反萃取分层完成后，收集反萃取相；

7)搅拌状态下，调节步骤6)得到的反萃取相至pH为9.0-10.0，使多杀菌素以结晶形式沉淀出来，过滤，烘干，得到多杀菌素粉末。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，使用1-2M的氢氧化钠溶液调节pH值；

优选地，在步骤1)中，将预处理的发酵液使用助滤剂过滤；更优选地，所述助滤剂为珍珠岩；进一步优选地，所述珍珠岩的使用量为15-20kg珍珠岩/m³发酵液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤2)中，使用板框压滤机过滤。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在步骤3)中，所述甲醇-水溶液中的甲醇与水的体积比为2-5:1；更优选地为4:1；

优选地，在步骤3)中，所述搅拌浸提的时间不少于3小时；

优选地，在步骤3)中，所述滤饼与甲醇-水溶液的质量/体积(kg/L)为1:6-8。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在步骤4)中，所述强碱性阴离子树脂为A850强碱阴离子脱色树脂或201×7强碱阴离子树脂；

优选地，在步骤4)中，所述过柱的浸提液体积为树脂体积的10-20倍。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在步骤5)中，所述非水溶性有机溶剂为乙酸丁酯或者正庚烷；

优选地，在步骤6)中，所述酸水为酒石酸水溶液。

7.一种多杀菌素的精制方法，所述方法包括以下步骤：

①将权利要求1-6中任一项所述的方法得到的多杀菌素粉末用水溶性有机溶剂溶解，升温至50-60℃，溶清后，在搅拌状态下滴加纯化水，在15-20℃下，缓慢降温析晶，过滤，得到多杀菌素精制结晶粉，并且多批收集结晶母液；

②将步骤①得到的结晶粉用低极性非水溶性有机溶剂溶解，得到上柱液；

③将步骤②得到的上柱液和步骤①收集的结晶母液分别上硅胶柱，层析分离，洗脱溶剂为石油醚/乙酸乙酯或石油醚/丙酮，洗脱过程用HPLC监控层析液中多杀菌素A和多杀菌素D的纯度，分段收集多杀菌素A和多杀菌素D的层析液；

④将步骤③得到的多杀菌素A的层析液合并，多杀菌素D层析液合并，分别浓缩至干，分别得到多杀菌素A和多杀菌素D的固体粉末；

优选地，所述方法还包括：

⑤将步骤④得到的多杀菌素A固体粉末用乙醇溶解后，滴加到纯化水中沉淀析出，过滤、烘干，得到高纯度的多杀菌素A产品；

和/或将步骤④得到的多杀菌素D固体粉末用乙醇溶解后，滴加到纯化水中沉淀析出，过滤、烘干，得到高纯度的多杀菌素D产品。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤①中，所述水溶性有机溶剂选自C₁-C₃的醇、C₃-C₄的酮中的一种或多种；优选地，所述C₁～C₃的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇或正丙醇中的一种或多种；更优选地，所述C₃～C₄的酮为丙酮。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，在步骤②中，所述低极性非水溶性有机溶剂为石油醚或正庚烷；

优选地，在步骤③中，硅胶层析的洗脱溶剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1，硅胶上柱量为10-15g/L；

优选地，在步骤③中，使用紫外点板显色的方式判断多杀菌素是否开始洗出，然后分段收集HPLC检测纯度。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，在步骤④中，将多杀菌素A和多杀菌素D层析液合并，浓缩至干，得到多杀菌素A和多杀菌素D的粉末；优选地，将步骤④得到的多杀菌素粉末用乙醇溶解后，滴加到纯化水中沉淀析出，过滤、烘干，得到高纯度的多杀菌素产品；

优选地，在步骤⑤中，乙醇-水体系最终的乙醇度(体积浓度)控制在10-30％。

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