CN107033114B - 一种二氢杨梅素的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然植物有效成分分离提纯领域，具体涉及一种二氢杨梅素的分离纯化方法。本发明提供了一种二氢杨梅素的分离纯化方法，包括以下步骤：(1)溶解和脱色除杂步骤：将二氢杨梅素粗品与水混合，加热至97‑100℃，加入吸附剂进行脱色除杂得到滤液；(2)冷却重结晶步骤：滤液冷冻至0‑4℃，析出晶体，再过滤，得到一次纯化晶体滤饼；(3)二次纯化步骤：将所述一次纯化晶体滤饼与水混合，加热至97‑100℃，冷却至15‑25℃，过滤，烘干得到二氢杨梅素晶体。本发明经溶解脱色除杂，重结晶，然后进行二次纯化就可以得到含量98％以上的产品，不使用任何有机溶剂，工艺绿色环保，收率高，并且所需设备简单，投入小，操作方便，易于扩大化生产。

Description

一种二氢杨梅素的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及天然植物有效成分分离提纯领域，具体涉及一种二氢杨梅素的分离纯化方法。

背景技术

二氢杨梅素(3,3’,4’,5,5’,7-六羟基-2,3-双氢黄酮醇，二氢杨梅素)是一种多羟基双氢黄酮醇，其广泛存在于葡萄科蛇葡萄属植物中，尤其在显齿蛇葡萄植物的幼嫩茎叶中含量更高。

药理研究表明二氢杨梅素具有消炎、抑菌、止咳、镇痛、消脂及抗脂质、保肝护肝、抗高血压、抗肿瘤、清除自由基、增强人体免疫力等功效。文献报道对二氢杨梅素进行衍生化亦能发现更好的活性化合物。随着二氢杨梅素生物活性研究和衍生化越来越受到重视，高纯度的二氢杨梅素需求增加，而市售分析纯二氢杨梅素价格昂贵。因二氢杨梅素有2个手性碳，其全合成方法较复杂。从天然植物中提取纯化二氢杨梅素是比较简单而经济的方法。国内外有部分研究报道利用有机溶剂提取法和大孔吸附树脂提取法从藤茶提取物中提取得到二氢杨梅素。而关于二氢杨梅素纯化方面的研究则较少。

有报道用重结晶法和层析分离法制备高纯度二氢杨梅素。层析技术分为吸附树脂和高效液相制备技术等。高效液相色谱及高效逆流色谱分离法单次分离的样品量少，而重结晶法存在试剂消耗大且收率低的缺点，因此这两种方法均不合适工业化生产。目前，尚未有大规模工业生产高纯度二氢杨梅素的报道。

发明内容

以往技术中二氢杨梅素提纯方法往往经过6-7次的重结晶，才能得出含量98％以上的产品，损耗高、得率低。

本发明所解决的技术问题旨在提供一种新型的二氢杨梅素的提纯方法，以克服现有技术的缺陷。具体地，本发明提供了以下技术方案：

(1)溶解和脱色除杂步骤：将二氢杨梅素粗品与水混合，加热至97-100℃，加入吸附剂进行脱色除杂得到滤液；

(2)冷却重结晶步骤：滤液冷冻至0-4℃，析出晶体，再过滤，得到一次纯化晶体滤饼；

(3)二次纯化步骤：将所述一次纯化晶体滤饼与水混合，加热至97-100℃，冷却至15-25℃，过滤，烘干得到二氢杨梅素晶体。

优选的，在步骤(1)中，二氢杨梅素粗品与水的质量比为1:(20-30)。

优选的，在步骤(1)中，所述加入吸附剂是在二氢杨梅素粗品与水混合进行溶解后加入，所述吸附剂为活性炭，所述二氢杨梅素粗品与所述活性炭的质量比为1:(0.05-0.1)。

优选的，在步骤(1)中，所述加入吸附剂进行脱色除杂得到滤液操作过程为：加入吸附剂后进行搅拌，然后趁热过滤得到滤液。

优选的，在步骤(2)中，所述滤液在0-4℃下静置8-12h以析出晶体。

优选的，在步骤(3)中，所述滤饼与水的质量比为1:(5-10)。

优选的，在步骤(1)中，加热至100℃。

优选的，在步骤(2)中，冷冻至0℃。

优选的，在步骤(3)中，在加热之后冷却之前进行搅拌；所述加热优选加热至100℃。

优选的，在步骤(3)中，冷却至20℃。

二氢杨梅素易溶于热水，热乙醇及丙酮，溶于乙醇、甲醇，极微溶于醋酸乙酯，在冷水中微溶，不溶于氯仿、石油醚，熔点为245-247℃。本发明采用二氢杨梅素在热水中溶解度较大，在冷水中微溶，根据二氢杨梅素在不同温度的水中的溶解度的差异来纯化二氢杨梅素，用热水溶解、冷水结晶，使之不断提高纯度。在利用重结晶纯化二氢杨梅素时，加入一定量活性炭可除掉大部分色素和杂质。二次纯化时将其部分溶解于较热的纯水中搅拌，二氢杨梅素晶体外面的杂质直接溶解于水中，体系里面晶体一部分溶解，同时另一部分析晶，成为一个晶体溶解—结晶—溶解—结晶的循环过程，在此过程中，一般含有杂质的晶体会优先溶解，因此在二次纯化过程中晶体会越来越纯化。

本发明所采用的提纯方法不用任何有机溶剂，工艺绿色环保，仅仅进行溶解脱色除杂，重结晶，然后进行二次纯化就可以得到含量98％以上的产品，收率高，工艺相对简单，操作比较方便，适应于企业的放大生产。

附图说明

图1是二氢杨梅素的结构式；

图2是二氢杨梅素的生产工艺流程示意图；

图3-1是实施例1中二氢杨梅素一次纯化的HPLC检测分析图；

图3-2是实施例1中二氢杨梅素二次纯化的HPLC检测分析图；

图3-3是实施例2中二氢杨梅素一次纯化的HPLC检测分析图；

图3-4是实施例2中二氢杨梅素二次纯化的HPLC检测分析图；

图3-5是实施例3中二氢杨梅素一次纯化的HPLC检测分析图；

图3-6是实施例3中二氢杨梅素二次纯化的HPLC检测分析图。

具体实施方式

本发明提供的纯化方法包括将二氢杨梅素粗品与水混合溶解，然后加热，使二氢杨梅素粗品充分溶解，接着加入活性炭使其吸附色素和杂质，趁热过滤，滤液在0-4℃下保存，静置8-12h使晶体析出，过滤，滤饼称重，取样用HPLC检测测定一次纯化得到的二氢杨梅素的纯度；然后再用水将所得滤饼溶解，加热，冷却至20℃，过滤、烘干，称重，取样用HPLC检测测定二次纯化后二氢杨梅素的纯度。二氢杨梅素的结构式见图1。

图2是二氢杨梅素提纯的工艺流程图，先将二氢杨梅素粗品与纯水混合进行纯水溶解，然后进行煮沸，充分溶解后加入活性炭脱色除杂，趁热过滤，接着对滤液进行冷却析晶，过滤，得到一次纯化晶体滤饼；然后将所述一次纯化晶体滤饼加入水溶解，加热搅拌，然后冷却、过滤，接着进行烘干，称重得到二次纯化二氢杨梅素晶体。

下面通过实施例来具体说明本发明的二氢杨梅素的分离纯化方法，本发明实施例中所用的仪器与原料如下：

表1实施例所使用的仪器

表2实施例所用的原料和试剂

原料或试剂	纯度	厂家
			二氢杨梅素粗品	50％	西安天丰生物科技有限公司
乙腈	色谱纯	南京化学试剂股份有限公司
			二氢杨梅素标准品	99％	泰安市嘉叶生物科技有限公司
纯水	——	常规方法自制

具体实施例中所用的检测方法为HPLC检测方法，具体操作如下：

1.对照品的制备

准确称取二氢杨梅素标准品5mg，用乙腈配制成浓度梯度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的标准品储备液，经0.45μm微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司)后进样，得到的浓度-峰面积线性回归方程为:Y＝1.002×10⁴X+1.085×10⁴。

2.试样的制备

准确称取自制二氢杨梅素样品5mg，以乙腈为溶剂配成浓度为0.5mg/ml的样品溶液，经0.45μm微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司)后备用。

3.色谱条件

色谱柱为依利特SinoChrom ODS-BP(4.6mm×200mm，5μm)；UV检测波长为293nm；流动相为A纯水，B乙腈，为改善峰形，采用梯度洗脱0～10min 10％～100质量％B，10～15min100～10质量％B；进样量5μL；柱温为室温。

实施例1二氢杨梅素的提纯

(1)溶解和脱色除杂步骤：在三口烧瓶中加入二氢杨梅素粗品50g，水1000ml进行混合，加热至100℃，溶解后加入活性炭2.5g进行脱色除杂，搅拌0.5h，趁热过滤，得到滤液；

(2)冷却重结晶步骤：滤液冷冻至0℃，静置8h析出晶体，再过滤，得一次纯化晶体滤饼，将所述一次纯化晶体滤饼称重，取样进行HPLC分析，如图3-1所示；

(3)二次纯化步骤：在三口烧瓶中加入所述滤饼和250ml水混合，加热至100℃，搅拌1h，冷却至20℃，静置2h，过滤，烘干得到二氢杨梅素晶体，称重，二氢杨梅素的质量为19.0g，取样进行HPLC分析，如图3-2所示。

实施例2二氢杨梅素的提纯

(1)溶解和脱色除杂步骤：在三口烧瓶中加入二氢杨梅素粗品50g，水1500ml进行混合，加热至97℃，溶解后加入活性炭2.5g进行脱色除杂，搅拌0.5h，趁热过滤，得到滤液；

(2)冷却重结晶步骤：滤液冷冻至4℃，静置12h析出晶体，再过滤，得一次纯化晶体滤饼，将所述一次纯化晶体滤饼称重，取样进行HPLC分析，如图3-3所示；

(3)二次纯化步骤：在三口烧瓶中加入所述滤饼和500ml水混合，加热至97℃，搅拌1h，冷却至15℃，静置2h，过滤，烘干得到二氢杨梅素晶体，称重，二氢杨梅素的质量为21.5g，取样进行HPLC分析，如图3-4所示。

实施例3二氢杨梅素的提纯

(1)溶解和脱色除杂步骤：在三口烧瓶中加入二氢杨梅素粗品50g，水1250ml进行混合，加热至100℃，溶解后加入活性炭5g进行脱色除杂，搅拌0.5h，趁热过滤，得到滤液；

(2)冷却重结晶步骤：滤液冷冻至4℃，静置10h析出晶体，再过滤，得一次纯化晶体滤饼，将所述一次纯化晶体滤饼称重，取样进行HPLC分析，如图3-5所示；

(3)二次纯化步骤：在三口烧瓶中加入所述滤饼和500ml水混合，加热至100℃，搅拌1h，冷却至25℃，静置2h，过滤，烘干得到二氢杨梅素晶体，称重，二氢杨梅素的质量为19.5g，取样进行HPLC分析，如图3-6所示。

对比例1二氢杨梅素的提纯

采用与实施例1相同的步骤进行提纯，与实施例1不同之处仅在于在步骤(1)未加入活性炭进行脱色除杂，最后，得到二次纯化二氢杨梅素称重，质量为19.2g，并且对得到的一次纯化二氢杨梅素晶体和二次纯化二氢杨梅素晶体，分别取样按照与实施例1相同的方法进行HPLC分析。

对比例2二氢杨梅素的提纯

采用与实施例2相同的步骤进行提纯，与实施例2不同之处仅在于，未对滤液进行冷冻至0-4℃，而是让滤液冷却至室温，最后，得到二次纯化二氢杨梅素称重，质量为10.2g，并且对得到的一次纯化二氢杨梅素晶体和二次纯化二氢杨梅素晶体，分别取样按照与实施例2相同的方法进行HPLC分析。

表3各实施例和各对比例的一次纯化和二次纯化的二氢杨梅素的纯度及质量

	一次纯化(纯度)	二次纯化(纯度)	二氢杨梅素质量(g)
				实施例1	92.6％	99.6％	19.0
实施例2	88.3％	98.4％	21.5
				实施例3	91.9％	99.6％	19.5
对比例1	83.2％	96.12％	19.2
				对比例2	93％	99.52％	10.2

由表3可以看出，实施例1至实施例3的一次纯化和二次纯化的纯度较高，一次纯化的纯度在88％以上，二次纯化的纯度在98％以上，且得到的二氢杨梅素的质量在19.0g及以上，而在对比例1中，虽然所得到的二氢杨梅素的质量为19.2g，但是在一次纯化中，所得到的二氢杨梅素的纯度仅为83.2％，在二次纯化中，纯度为96.12％，对于对比例2，虽然一次纯化和二次纯化的纯度较高，分别为93％和99.52％，但是所得到的二氢杨梅素的质量仅为10.2g，收率较低，因此，本发明的实施例所给出的分离纯化方法不仅能够得到高纯度的二氢杨梅素，还能得到高收率的二氢杨梅素，工艺简单，操作比较方便，大大提高了经济效益，适应于企业的放大生产。

以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种二氢杨梅素的分离纯化方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)溶解和脱色除杂步骤：将二氢杨梅素粗品与水混合，加热至97-100℃，加入吸附剂后进行搅拌，然后趁热过滤得到滤液，二氢杨梅素粗品与水的质量比为1:(20-30)；

(2)冷却重结晶步骤：滤液冷冻至0-4℃，析出晶体，再过滤，得到一次纯化晶体滤饼，其中，所述滤液在0-4℃下静置8-12h以析出晶体；

(3)二次纯化步骤：将所述一次纯化晶体滤饼与水混合，加热至97-100℃，冷却至15-25℃，过滤，烘干得到二氢杨梅素晶体，所述滤饼与水的质量比为1:(5-10)；

其中，步骤(1)中，所述加入吸附剂是在二氢杨梅素粗品与水混合进行溶解后加入，所述吸附剂为活性炭，所述二氢杨梅素粗品与所述活性炭的质量比为1:(0.05-0.1)。

2.根据权利要求1所述的二氢杨梅素的分离纯化方法，其中，步骤(1)中，加热至100℃。

3.根据权利要求1或2所述的二氢杨梅素的分离纯化方法，其中，步骤(2)中，冷冻至0℃。

4.根据权利要求1或2所述的二氢杨梅素的分离纯化方法，其中，步骤(3)中，在加热之后冷却之前进行搅拌；所述加热为加热至100℃。

5.根据权利要求3所述的二氢杨梅素的分离纯化方法，其中，步骤(3)中，在加热之后冷却之前进行搅拌；所述加热为加热至100℃。

6.根据权利要求1或2所述的二氢杨梅素的分离纯化方法，其中，在步骤(3)中，冷却至20℃。

7.根据权利要求3所述的二氢杨梅素的分离纯化方法，其中，在步骤(3)中，冷却至20℃。

8.根据权利要求4所述的二氢杨梅素的分离纯化方法，其中，在步骤(3)中，冷却至20℃。

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