CN115960066A - 一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提取工艺技术领域，尤其涉及一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法。本发明提供了一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：将藤茶和第一甲醇混合，进行提取后，旋蒸，得到提取物浸膏；将所述提取物浸膏和硅胶混合后，依次进行硅胶纯化和第一梯度洗脱，得到第二组分浸膏；将所述第二组分浸膏和第二甲醇混合后，依次进行反相硅胶纯化和第二梯度洗脱，得到所述二氢杨梅素。所述方法高效、经济，可以降低二氢杨梅素的成本。
Description
技术领域
本发明涉及提取工艺技术领域，尤其涉及一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法。
背景技术
藤茶(Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang)是重要的经济作物，具有清热解毒、利咽消肿、平肝降压、活血通络的功效，已被民间广泛应用于降血压等疾病的预防和治疗。藤茶中含有丰富的黄酮类物质，其中最主要的成分为二氢杨梅素。科学研究发现，藤茶及其主要活性成分具有抗癌、抗氧化、降脂、抗炎、抑菌和抗疲劳等作用。基于二氢杨梅素的市场需求和高成本的制备工艺，98％以上高纯度的二氢杨梅素卖到180元/20mg以上，高昂的市场价格限制了二氢杨梅素在功能食品和医药等领域的运用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法，所述方法高效、经济，可以降低二氢杨梅素的成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：
将藤茶和第一甲醇混合，进行提取后，旋蒸，得到提取物浸膏；
将所述提取物浸膏和硅胶混合后，依次进行硅胶纯化和第一梯度洗脱，得到第二组分浸膏；
将所述第二组分浸膏和第二甲醇混合后，依次进行反相硅胶纯化和第二梯度洗脱，得到所述二氢杨梅素。
优选的，所述藤茶的粒径≤75μm；
所述藤茶的质量和第一甲醇的体积比为1kg：40～50L；
所述提取在超声的条件下进行，所述超声的功率为180～200W，温度为55～60℃，时间为30～40min；所述提取的次数为2～3次。
优选的，所述提取后还包括依次进行的离心和过滤；
所述离心的转速为2000～3000r/min，时间为15～20min；所述过滤采用1000目的滤袋；
所述旋蒸的真空度为-25～-30Hg，温度为40～45℃，转速为180～200r/min，时间为30～40min。
优选的，所述硅胶的粒径为100～200目；
所述提取物浸膏与硅胶的质量比为1：(1.0～1.2)。
优选的，所述硅胶纯化采用的分离硅胶的粒径为300～400目；
所述提取物浸膏与分离硅胶的质量比为1：(4.5～5.0)。
优选的，所述第一梯度洗脱的洗脱剂包括依次设置的第一组分和第二组分；
所述第一组分为体积比为(100～99.5)：(0～0.5)的二氯甲烷和甲醇的混合液；所述第一组分的体积为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；
所述第二组分为体积比为(90～89)：(10～11)的二氯甲烷和甲醇的混合液；所述第二组分的体积为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；
所述第一梯度洗脱的过程中每分钟的流量与洗脱剂的体积比为1：(20～25)。
优选的，所述第一梯度洗脱后，还包括将得到的洗脱液进行旋蒸；
所述旋蒸的真空度为-25～-30Hg，温度为40～45℃，转速为180～200r/min，时间为30～40min。
优选的，所述第二组分浸膏和第二甲醇的体积比为1g：5～6mL；
进行所述反相硅胶纯化时，反相硅胶的装柱体积与所述第二组分浸膏的体积比为(10～12)：1。
优选的，所述第二梯度洗脱的洗脱剂包括依次设置的第一组分、第二组分和第三组分；
所述第一组分为体积比为(100～99.5)：(0～0.5)的水和甲醇的混合液；所述第一组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；
所述第二组分为体积比为(90～89)：(10～11)的水和甲醇的混合液；所述第二组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；
所述第三组分为体积比为(80～79)：(20～21)的水和甲醇的混合液；所述第三组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍
所述第二梯度洗脱的过程中每分钟的流量与洗脱剂的体积比为1：(30～35)。
优选的，所述第二梯度洗脱后，还包括将得到的洗脱液进行旋蒸；
所述旋蒸的真空度为-25～-30Hg，温度为50～55℃，转速为180～200r/min，时间为30～40min。
本发明提供了一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：将藤茶和第一甲醇混合，进行提取后，旋蒸，得到提取物浸膏；将所述提取物浸膏和硅胶混合后，依次进行硅胶纯化和第一梯度洗脱，得到第二组分浸膏；将所述第二组分浸膏和第二甲醇混合后，依次进行反相硅胶纯化和第二梯度洗脱，得到所述二氢杨梅素。本发明所述方法简单、同时能够高效、经济地从藤茶中工业化提取二氢杨梅素。同时，本发明所述方法以藤茶为提取原料，实现了藤茶的综合利用，变废为宝；同时藤茶中含有极高的二氢杨梅素，纯度高达80％以上，极少的杂质含量可以有效的降低制备成本。
附图说明
图1为实施例2所述优质藤茶的实物图；
图2为实施例1所述藤茶的实物图；
图3为实施例1制备得到的二氢杨梅素的HPLC谱图；
图4为实施例1制备得到的二氢杨梅素的紫外吸收光谱。
具体实施方式
本发明提供了一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：
将藤茶和第一甲醇混合，进行提取后，旋蒸，得到提取物浸膏；
将所述提取物浸膏和硅胶混合后，依次进行硅胶纯化和第一梯度洗脱，得到第二组分浸膏；
将所述第二组分浸膏和第二甲醇混合后，依次进行反相硅胶纯化和第二梯度洗脱，得到所述二氢杨梅素。
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明将藤茶和第一甲醇混合，进行提取后，旋蒸，得到提取物浸膏。
在本发明中，所述藤茶的粒径优选≤75μm。在本发明中，当所述藤茶的粒径不满足上述要求时，优选对所述藤茶进行粉碎；本发明对所述粉碎的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。
在本发明中，所述藤茶的质量和第一甲醇的体积比优选为1kg：40～50L，更优选为1kg：42～48L，最优选为1kg：44～46L。
在本发明中，所述提取优选在超声的条件下进行，所述超声的功率优选为180～200W，更优选为185～195W，最优选为188～192W；温度优选为55～60℃，更优选为56～58℃；时间优选为30～40min，更优选为32～38min，最优选为34～36min；所述提取的次数优选为2～3次。
所述提取完成后，本发明还优选包括依次进行的离心和过滤；所述离心的转速优选为2000～3000r/min，更优选为2200～2800r/min，最优选为2400～2600r/min；时间优选为15～20min，更优选为15～18min，最优选为15～16min。在本发明中，所述过滤优选采用1000目的滤袋。
在本发明中，所述旋蒸的真空度优选为-25～-30Hg，更优选为-26～-29Hg，最优选为-27～-28Hg；温度优选为40～45℃，更优选为41～44℃，最优选为42～43℃；转速优选为180～200r/min，更优选为185～195r/min，最优选为188～192r/min；时间优选为30～40min，更优选为32～38min，最优选为34～36min。
在本发明中，所述离心和过滤后得到的滤液以及所述旋蒸后得到的溶剂优选通过添加无水氯化钙去除水分后进行回收再利用。在本发明中，所述滤液和/或溶剂的体积与所述无水氯化钙的质量比优选为(40～50)mL：1g，更优选为(42～48)mL：1g，最优选为(44～46)mL：1g。所述去除水分的过程优选为静置1～2天。
得到提取物浸膏后，本发明将所述提取物浸膏和硅胶混合后，依次进行硅胶纯化和第一梯度洗脱，得到第二组分浸膏。
在本发明中，所述硅胶的粒径优选为100～200目，更优选为120～180目，最优选为130～160目。
在本发明中，所述提取物浸膏与硅胶的质量比优选为1：(1.0～1.2)，更优选为1：(1.05～1.15)。
在本发明中，所述硅胶的作用是色谱分离，可以依据极性不同去除强极性、弱极性杂质。
在本发明中，所述硅胶纯化采用的分离硅胶的粒径优选为300～400目，更优选为320～380目，最优选为340～360目。
在本发明中，所述提取物浸膏与分离硅胶的质量比优选为1：(4.5～5.0)，更优选为1：(4.6～4.9)，最优选为1：(4.7～4.8)。
在本发明中，所述硅胶纯化优选在硅胶纯化柱中进行。
在本发明中，所述第一梯度洗脱的洗脱剂优选包括依次设置的第一组分和第二组分；所述第一组分优选为体积比为(100～99.5)：(0～0.5)的二氯甲烷和甲醇的混合液；所述第一组分的体积优选为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；所述第二组分优选为体积比为(90～89)：(10～11)的二氯甲烷和甲醇的混合液；所述第二组分的体积优选为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；所述第一梯度洗脱的过程中每分钟的流量与洗脱剂的体积比优选为1：(20～25)。
所述第一梯度洗脱后，本发明还优选包括将得到的洗脱液进行旋蒸；所述旋蒸的真空度优选为-25～-30Hg，温度优选为40～45℃，转速优选为180～200r/min，时间优选为30～40min。
所述第一梯度洗脱完成后回收的流动相优选通过添加无水氯化钙去除水分后进行回收再利用。在本发明中，所述流动相的体积与所述无水氯化钙的质量比优选为(25～50)mL：1g，更优选为(30～45)mL：1g，最优选为(35～40)mL：1g。所述去除水分的过程优选为静置1～2天。
得到第二组分浸膏后，本发明将所述第二组分浸膏和第二甲醇混合后，依次进行反相硅胶纯化和第二梯度洗脱，得到所述二氢杨梅素。
在本发明中，所述第二组分浸膏和第二甲醇的体积比优选为1g：5～6mL，更优选为1g：5～5.5mL。
本发明对所述混合的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。
在本发明中，所述反相硅胶纯化时，反相硅胶的装柱体积与所述第二组分浸膏的体积比优选为(10～12)：1，更优选为(10.5～11.5)：1，最优选为(10.8～11.2)：1。
在本发明中，所述第二梯度洗脱的洗脱剂优选包括依次设置的第一组分、第二组分和第三组分；所述第一组分优选为体积比为(100～99.5)：(0～0.5)的水和甲醇的混合液；所述第一组分的体积优选为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；所述第二组分优选为体积比为(90～89)：(10～11)的水和甲醇的混合液；所述第二组分的体积优选为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；所述第三组分优选为体积比为(80～79)：(20～21)的水和甲醇的混合液；所述第三组分的体积优选为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；所述第二梯度洗脱的过程中每分钟的流量与洗脱剂的体积比为1：(30～35)。
所述第二梯度洗脱后，本发明还优选包括将得到的洗脱液进行旋蒸；所述旋蒸的真空度优选为-25～-30Hg，温度优选为50～55℃，转速优选为180～200r/min，时间优选为30～40min。
所述第二梯度洗脱完成后，本发明还优选包括将所述第二梯度洗脱得到的流动相进行回收再利用。
下面结合实施例对本发明提供的从藤茶中提取二氢杨梅素的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1中涉及到的原料和设备如下：
藤茶：咸丰县筒车坝藤茶专业合作社；
甲醇和二氯甲烷：国药集团化学试剂有限公司；
粉碎机(ZGP-2320Q)：广东中科华恒科技有限公司；
分离筛：安平县腾德金属丝网制品有限公司；
超声仪(kq5200e型超声波仪)：昆山舒美超声仪器有限公司；
旋转蒸发仪(型号RE-2003)：上海贝凯生物化工设备有限公司；
高效液相色谱仪：AgiantTechnologies；
C18色谱柱：阿克苏·诺贝尔公司；
二氢杨梅素标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
离心机(型号200)：张家港市乐余电机设备厂；
滤袋：佛山市精柯纺织印染设备有限公司；
实施例1
采用粉碎机将10t藤茶废料进行粉碎，过200目筛，得到粒度≤75μm的藤茶废料粉末(实物图如图2所示)；
按照1kg:45L的料液比，将1kg所述藤茶和45L甲醇混合，在kq5200e型超声波仪中进行超声提取3次，所述超声提取的功率为190W，温度为57.5℃，时间为35min，得到提取液；
利用离心机对所述提取液进行离心(所述离心的转速为2500r/min，时间为20min)后，用1000目滤袋进行过滤后，利用旋转蒸发仪进行旋蒸(真空度为-27.5Hg，温度为42.5℃，转速为190r/min，时间为35min)，得到提取物浸膏；得到浸提液通过添加无水氯化钙(所述浸提液的体积与无水氯化钙的质量比为45mL:1g)静置1.5天去除水分后进行回收再利用；
按照1:1.1的质量比，将所述提取物浸膏和100～200目的硅胶混合后，将300～400目的硅胶(所述硅胶与提取物浸膏的质量比为4.75:1)作为分离硅胶，装硅胶纯化柱进行硅胶纯化，然后进行第一梯度洗脱(洗脱剂包括依次设置的第一组分和第二组分；所述第一组分为体积比为100:0的二氯甲烷和甲醇的混合液；所述第一组分的体积为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.75倍；所述第二组分为体积比为90:10的二氯甲烷和甲醇的混合液；所述第二组分的体积为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.75倍；所述第一梯度洗脱的过程中每分钟的流量与洗脱剂的体积比为1：25)后，进行旋蒸(旋蒸的真空度为-27.5Hg，温度为42.5℃，转速为2500r/min，时间为16min)，得到第二组分浸膏；得到的流动相通过添加无水氯化钙(所述浸提液的体积与无水氯化钙的质量比为45mL:1g)静置1.5天去除水分后进行回收再利用；
按照1：5的质量体积比，将所述第二组分浸膏和甲醇混合后，进行反相硅胶纯化(反相硅胶的装柱体积为样品体积的11倍)，然后进行梯度洗脱(洗脱剂包括依次设置的第一组分、第二组分和第三组份；所述第一组分为体积比为100:0的甲醇和水的混合液；所述第一组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.75倍；所述第二组分为体积比为90:10的甲醇和水的混合液；所述第二组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.75倍；所述第三组分为体积比为80:20的甲醇和水的混合液；所述第三组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.75倍，所述第二梯度洗脱的过程中每分钟的流量与洗脱剂的体积比为1：30)后，进行旋蒸(旋蒸的真空度为-27.5Hg，温度为52.5℃，转速为190r/min，时间为35min)，得到二氢杨梅素；回收流动相(水和甲醇的混合物)进行重复使用。
实施例2
参考实施例1，区别在于：将藤茶废料替换为优质藤茶(实物图如图1所示)。
实施例3
参考实施例1，区别在于：将藤茶废料替换为藤茶老叶和残次叶。
实施例4
参考实施例1，区别在于，将甲醇替换为回收的浸提液。
实施例5
参考实施例1，区别在于，所述第一梯度洗脱的过程中第一组分和第二组分的体积为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的6倍。
实施例6
参考实施例1，区别在于，所述第一梯度洗脱的过程中第一组分和第二组分的体积为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的3倍。
实施例7
参考实施例1，区别在于，所述第一梯度洗脱的过程中回收的流动相进行梯度洗脱。
实施例8
参考实施例1，区别在于，所述第二梯度洗脱的过程中第一组分、第二组分和第三组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的6倍。
实施例9
参考实施例1，区别在于，所述第二梯度洗脱的过程中第一组分、第二组分和第三组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的3倍。
实施例10
参考实施例1，区别在于，所述第一梯度洗脱的过程中回收的流动相进行梯度洗脱。
测试例
使用HPLC(型号为1260InfinityⅡ)检测实施例1～10制备得到的二氢杨梅素的纯度和含量；色谱条件为：Kromasil色谱柱C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A相水溶液(包含1vol％的乙酸)，B相乙腈(包含1vol％的乙酸)；柱温25℃；检测波长270nm；流速1mL/min；进样量20μL；梯度洗脱条件：时间0→20min，A相100％→20％；时间20.1→25min，A相0％→0％；时间25.1→30min，A相100％→100％。调取数据，和二氢杨梅素标准品对比保留时间、紫外光谱吸收特征，判断制备化合物是否为二氢杨梅素；通过外标法检测制备化合物纯度；
HPLC外标法检测制备化合物纯度：1)运用乙醇配制二氢杨梅素(180～200μg/mL)标准品溶液，稀释成180～160μg/mL、140～120μg/mL、100～80μg/mL、60～40μg/mL、30～20μg/mL系列标准品溶液。2)运用乙醇配制制备的化合物，配制浓度为60～80μg/mL；3)通过HPLC外标法检测、定量，选择PDA二极管阵列检测器，检测波长265～285nm，同时全波长扫描检测化合物的吸收光谱；流动相A相水溶液(1～1.1vol％乙酸，5～6vol％乙腈)，B相乙腈(1～1.1％乙酸)，流速1～1.1mL/min。梯度洗脱条件：时间0→20.0min，A相100％→20％；时间20→24.0min，A相20％→0％；时间24.0→27.0min，A相0％→0％；时间27.0→30.0min，A相100％→100％；
图3为实施例1制备得到的二氢杨梅素的HPLC谱图，由图3可知，制备所获得二氢杨梅素和标准品的保留时间没有差异，纯度一致，没有杂质干扰；
图4为实施例1制备得到的二氢杨梅素的紫外吸收光谱，由图4可知，获得二氢杨梅素和标准品的紫外吸收光谱一致，没有杂质污染；
测试结果如表1所示：
表1实施例1～10所述二氢杨梅素的得率、纯度和成本指标
注：同一列不同小写字母a，b，c代表具有统计学显著性差异
由表1可知，实施例1二氢杨梅素的得率显著提升，其纯度也达到98％以上，同时实施例1的生产成本也显著降低。实施例4、7、10选择回收提取溶剂，二次循环使用，制备二氢杨梅素，其得率和纯度较实施例1无显著性差异。因此，回收处理的溶剂不影响制备二氢杨梅素的得率和纯度，却能显著降低生产成本。本发明提供的方法操作简便，成本低，重复性好，可用于工业化生产。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将藤茶和第一甲醇混合，进行提取后，旋蒸，得到提取物浸膏；
将所述提取物浸膏和硅胶混合后，依次进行硅胶纯化和第一梯度洗脱，得到第二组分浸膏；
将所述第二组分浸膏和第二甲醇混合后，依次进行反相硅胶纯化和第二梯度洗脱，得到所述二氢杨梅素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藤茶的粒径≤75μm；
所述藤茶的质量和第一甲醇的体积比为1kg：40～50L；
所述提取在超声的条件下进行，所述超声的功率为180～200W，温度为55～60℃，时间为30～40min；所述提取的次数为2～3次。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取后还包括依次进行的离心和过滤；
所述离心的转速为2000～3000r/min，时间为15～20min；所述过滤采用1000目的滤袋；
所述旋蒸的真空度为-25～-30Hg，温度为40～45℃，转速为180～200r/min，时间为30～40min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硅胶的粒径为100～200目；
所述提取物浸膏与硅胶的质量比为1：(1.0～1.2)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硅胶纯化采用的分离硅胶的粒径为300～400目；
所述提取物浸膏与分离硅胶的质量比为1：(4.5～5.0)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一梯度洗脱的洗脱剂包括依次设置的第一组分和第二组分；
所述第一组分为体积比为(100～99.5)：(0～0.5)的二氯甲烷和甲醇的混合液；所述第一组分的体积为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；
所述第二组分为体积比为(90～89)：(10～11)的二氯甲烷和甲醇的混合液；所述第二组分的体积为所述硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；
所述第一梯度洗脱的过程中每分钟的流量与洗脱剂的体积比为1：(20～25)。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一梯度洗脱后，还包括将得到的洗脱液进行旋蒸；
所述旋蒸的真空度为-25～-30Hg，温度为40～45℃，转速为180～200r/min，时间为30～40min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二组分浸膏和第二甲醇的体积比为1g：5～6mL；
进行所述反相硅胶纯化时，反相硅胶的装柱体积与所述第二组分浸膏的体积比为(10～12)：1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二梯度洗脱的洗脱剂包括依次设置的第一组分、第二组分和第三组分；
所述第一组分为体积比为(100～99.5)：(0～0.5)的水和甲醇的混合液；所述第一组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；
所述第二组分为体积比为(90～89)：(10～11)的水和甲醇的混合液；所述第二组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍；
所述第三组分为体积比为(80～79)：(20～21)的水和甲醇的混合液；所述第三组分的体积为所述反相硅胶纯化采用的纯化柱的体积的4.5～5.0倍
所述第二梯度洗脱的过程中每分钟的流量与洗脱剂的体积比为1：(30～35)。
10.如权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述第二梯度洗脱后，还包括将得到的洗脱液进行旋蒸；
所述旋蒸的真空度为-25～-30Hg，温度为50～55℃，转速为180～200r/min，时间为30～40min。
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