CN109810088A - 藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法及应用，方法包括步骤：(1)选取藤茶原料，干燥后、粉碎，得到藤茶粗粉；(2)将螯合离子溶液与藤茶粗粉添加至提取罐中，同时在提取罐中加入足量去离子水混合均匀，得到粗提取液；(3)将粗提取液于85°以上搅拌80－140分钟，过滤，得到滤渣提取物；(4)将滤渣提取物添加至解螯合剂溶液中，获得纯提取液；(5)在纯提取液中添加硫酸盐，析出螯合沉淀物；(6)将螯合沉淀物加入至EDTA溶液中溶解，于5°以下静置15小时以上，析出白色针状晶体，收集，干燥后获得二氢杨梅素纯品。本发明中二氢杨梅素的提取率显著提高，提取的二氢杨梅素更稳定，不易被空气中氧气氧化，耗时短、品质更好。

Description

藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法及应用

技术领域

本发明属于中药活性成分提取方法技术领域，更具体地，涉及到提取二氢杨梅素的方法及应用，尤其是藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法及应用。

背景技术

藤茶学名显齿蛇葡萄，主要分布在我国长江流域以南。藤茶幼嫩茎叶中含有丰富的黄酮，质量分数可达20－28％(占干重)，其主要成分为二氢杨梅素(Dihydromyricetin，(2R，3R)－3，5，7－三羟基－2－(3，4，5－三羟基苯基)苯并二氢吡喃－4－酮)。二氢杨梅素除具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、降血脂、抗肿瘤、消炎等多种功效外，还可以缓解酒精中毒、预防酒精肝和脂肪肝、抑制肝细胞恶化、降低肝癌发病率等作用。因此，从藤茶提取二氢杨梅素，并应用于食品、化妆品和饲料等行业，如食品和化妆品行业可起到抗氧化剂和抗菌剂的作用，添加到饲料中可提高猪、鸡和鱼等的料重比。

目前二氢杨梅素的提取主要采用水热提取法，即对藤茶幼嫩干叶加水煎煮，浓缩过滤，然后低温沉析，得到浅黄色颗粒状结晶，抽滤干燥得到粗品二氢杨梅素。粗品二氢杨梅素的纯化通常采用重结晶法，即利用二氢杨梅素在热水中溶解，在冷水中溶解度低的特点来进行。通常重结晶五次即可得到纯净的二氢杨梅素。

例如中国专利申请CN201010284838.X公开了一种从藤茶中提取二氢杨梅素、藤茶多糖和藤茶多酚的方法，加工步骤中包含有：a.原料粉碎：将新鲜藤茶茎叶干燥、粉碎；b.浸提：热水提取、离心收集上清液；c.浓缩：将上清液I减压浓缩后，冷却静置，离心收集沉淀和上清液II；d.提取二氢杨梅素：将沉淀经重结晶真空干燥，得二氢杨梅素；e.加醇：将上清液II减压浓缩，醇沉，离心收集沉淀和上清液III；f.提取粗多糖：将沉淀经纯化、真空干燥或喷雾干燥，得藤茶多糖；g.提取藤茶多酚：将上清液III减压浓缩，以乙酸乙酯萃取、浓缩、干燥得藤茶多酚，或以AB－8树脂吸附、蒸馏水洗脱后，以乙醇洗脱收集洗脱液，浓缩、真空干燥得藤茶多酚。

水热法从藤茶中提取二氢杨梅素工艺操作简单，但产品损失大，且二氢杨梅素在提取和纯化的过程中很容易发生不可逆的氧化。因此，提高藤茶中二氢杨梅素的提取率，避免二氢杨梅素在提取和纯化发生氧化变质具有重要意义。

基于此，本申请提出了藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法及应用，在提高藤茶中二氢杨梅素提取率的同时，有效地避免了二氢杨梅素的氧化。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法及应用，采用螯合作用相比传统水热法的提取率显著提高，提取的二氢杨梅素更稳定，不易被空气中氧气氧化，产品品质更好。

本发明的一种具体技术方案是：

藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，包括以下步骤：

(1)选取藤茶原料，干燥后、粉碎，得到藤茶粗粉；

(2)将螯合离子溶液与藤茶粗粉添加至提取罐中，同时在提取罐中加入足量去离子水混合均匀，得到粗提取液，并调节粗提取液的PH值至1.5－4.0；

(3)将粗提取液于85°以上搅拌80－140分钟后，过滤，得到滤渣提取物；

(4)将滤渣提取物添加至解螯合剂溶液中，于80°以上搅拌4－15分钟，获得纯提取液；

(5)在纯提取液中添加硫酸盐，析出螯合沉淀物；

(6)将螯合沉淀物加入至EDTA溶液中溶解，于5°以下静置15小时以上，析出白色针状晶体，收集，干燥后获得二氢杨梅素纯品。

在本发明的上述技术方案中，选取的藤茶原料优选为藤茶干叶，藤茶原料的粉碎过程采用中药粉碎机进行粉碎，优选的，粉碎后的藤茶原料过15－45目筛得到藤茶粗粉，再例如粉碎后的藤茶原料过20目筛得到藤茶粗粉。

进一步的，步骤(2)中的藤茶粗粉与螯合离子溶液添加至提取罐中的过程是连续的，其中，螯合离子溶液也可以是通过固态状的晶体和提取罐中的去离子水形成的，例如，先在提取罐中加入足量的去离子水，然后连续添加藤茶粗粉和能够溶于去离子水并形成螯合离子溶液的晶体，从而形成粗提取液。

优选的，形成的螯合离子溶液包括锌离子溶液、铜离子溶液、铁离子溶液、锰离子溶液、镍离子溶液。其中，螯合离子溶液是固态状含有前述离子的晶体溶解形成的，例如在步骤(2)中添加的是晶体状硫酸锌。

具体的，在酸性环境下，二氢杨梅素的溶解度更高；将提取液于85°以上搅拌80－140分钟后，例如搅拌120分钟，过滤，得到滤渣提取物，此时的滤渣提取物中主要成分是二氢杨梅素螯合物，也含有少量其他成分沉淀物，这种状态下的滤渣提取物为粗提取物，需要进行纯化。

本发明的纯化过程为：

(4)将滤渣提取物添加至解螯合剂溶液中，于80°以上搅拌4－15分钟，获得纯提取液；

(5)在纯提取液中添加硫酸盐，析出螯合沉淀物；

其中，滤渣提取物中的二氢杨梅素螯合物会溶解于解螯合剂溶液中，优选的，本发明中的解螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠溶液、柠檬酸溶液等可以解除二氢杨梅素与螯合离子之间的连接；此时，还可以设置再次过滤的过程，以获得成分为二氢杨梅素的纯提取液；通过在纯提取液中添加硫酸盐，析出螯合沉淀物，例如添加硫酸锌(或硫酸锌溶液)、硫酸亚铁(或硫酸亚铁溶液)等，优选的，步骤(2)中添加的螯合离子溶液与步骤(5)中添加的硫酸盐中的螯合离子相同，例如均为硫酸锌(或硫酸锌溶液)。

步骤(5)中获得的螯合沉淀物为仅含有二氢杨梅素的纯化沉淀物，通过将步骤(5)中的螯合沉淀物添加至EDTA溶液中溶解，在低于5°的环境下静置15小时以上，例如静置24小时，二氢杨梅素会析出并呈白色针状晶体，收集后干燥处理，即可获得二氢杨梅素纯品。

根据本发明的另一种具体实施方式，在执行步骤(6)之前，多次重复执行步骤(4)、(5)，并收集螯合沉淀物。

具体的，重复步骤(4)(5)4次以上后，执行步骤(6)，例如重复提纯5次，再例如重复提纯6次。

根据本发明的另一种具体实施方式，步骤(2)中的螯合离子溶液与藤茶粗粉的体积量比为1：3－5，例如螯合离子溶液与藤茶粗粉的体积量比为1：4，具体例如同时添加5g硫酸锌和20g藤茶粗粉。

根据本发明的另一种具体实施方式，步骤(2)提取罐中添加的去离子水是藤茶原料体积量的15倍以上，例如提取罐中的去离子水与藤茶原料的比为20ml：1g。

根据本发明的另一种具体实施方式，步骤(2)中添加盐酸至粗提取液并调节PH值为1.5－2.0。

根据本发明的另一种具体实施方式，步骤(2)中的螯合离子溶液包括锌离子溶液、铜离子溶液、铁离子溶液、锰离子溶液、镍离子溶液。

根据本发明的另一种具体实施方式，步骤(3)、步骤(4)中的搅拌过程是连续的、阶段性保持搅拌速度恒定的、在搅拌中可以切换搅拌方向的搅拌过程。

用藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法提取的二氢杨梅素在食品、化妆品或饲料制备中的应用。

本发明具备以下有益效果：

螯合提取方法可以显著提高二氢杨梅素的提取率，提取的二氢杨梅素的纯度高，在提取和纯化过程中不易被空气中氧气氧化，提取的二氢杨梅素色泽更白；

在二氢杨梅素的纯化过程中，采用硫酸盐(例如硫酸锌)和EDTA反复沉淀溶解，不会造成二氢杨梅素在水中的残留损失，进一步提高二氢杨梅素的提取率；

螯合提取方法耗时较少，相较于传统的水热法，可以大大降低二氢杨梅素的提取和纯化时间，适用于工业化的生产过程。

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

附图说明

图1是分子结构示意图，其中，图1(a)是二氢杨梅素的分子结构，图1(b)是二氢杨梅素锌螯合物分子结构；

图2是二氢杨梅素及锌配合物的紫外光谱图；

图3是红外光谱图，其中，图3a是二氢杨梅素的红外光谱图，图3b是二氢杨梅素锌螯合物的红外光谱图；

图4是二氢杨梅素的HPLC图，其中图4(a)示出了纯品二氢杨梅素的HPLC图，图4(b)示出了自制二氢杨梅素的纯品的HPLC图。

具体实施方式

实施例1

一种藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法包括以下步骤：

称取20g藤茶干叶，用重要粉碎机粉碎后，过20目筛，得到藤茶粗粉，将藤茶粗粉、5g硫酸锌、400ml升去离子水加入提取罐中，充分混合后得到粗提取液，用HCL溶液调节粗提取液的PH值至2.0，并于90°下连续搅拌120分钟。

接着，过滤前述粗提取液，得到主要成分为二氢杨梅素的滤渣提取物，收集滤渣提取物后，进行纯化过程：将滤渣提取物添加至300ml乙二胺四乙酸二钠溶液(0.1mol/L)中，于90°下连续搅拌5分钟，获得纯提取液，添加硫酸锌后，析出二氢杨梅素螯合沉淀物；

具体的，重复上述滤渣提取物的纯化过程5次，得到成分唯一或接近唯一、呈红棕色粉末状的螯合沉淀物，将螯合沉淀物添加至EDTA溶液中溶解，于4°静置24小时，析出白色针状晶体，收集，干燥后获得二氢杨梅素纯品。

实施例2

一种藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法包括以下步骤：

称取20g藤茶干叶，用重要粉碎机粉碎后，过25目筛，得到藤茶粗粉，将藤茶粗粉、5g硫酸锌、500ml升去离子水加入提取罐中，充分混合后得到粗提取液，用HCL溶液调节粗提取液的PH值至2.2，并于95°下连续搅拌100分钟。

接着，过滤前述粗提取液，得到主要成分为二氢杨梅素的滤渣提取物，收集滤渣提取物后，进行纯化过程：将滤渣提取物添加至350ml柠檬酸溶液(0.1mol/L)中，于95°下连续搅拌7分钟，获得纯提取液，添加硫酸锌后，析出二氢杨梅素螯合沉淀物；

具体的，重复上述滤渣提取物的纯化过程6次，得到成分唯一、呈红棕色粉末状的螯合沉淀物，将螯合沉淀物添加至EDTA溶液中溶解，于2°静置20小时，析出白色针状晶体，收集，干燥后获得二氢杨梅素纯品。

在本发明的上述优选实施例中，二氢杨梅素和锌、镍、锰等离子溶液形成螯合物后化学稳定性大大提高，不容易被空气中的氧气氧化。因此，本发明的螯合提取方法在二氢杨梅素提取和纯化的过程中，利用螯合作用保护二氢杨梅素不被氧化，可提高二氢杨梅素的提取率和稳定性。

本发明从藤茶提取的二氢杨梅素，可以应用于食品、化妆品和饲料等行业，具体例如在食品和化妆品行业可起到抗氧化剂和抗菌剂的作用，添加到饲料中可提高猪、鸡和鱼等的料重比。

本发明在二氢杨梅素的提取以及纯化过程中，通过控制提取时间、提取pH值、提取温度、控制加入的螯合离子溶液量、料液比等因素，通过单因素以及紫外光谱分析，并采用HPLC检测获得产物的纯度，确定了前述从藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法的最佳条件范围。

本发明还涉及水热法与螯合提取方法的试验对比分析：

一种水热法的提取过程：

取20g藤茶干叶，用中药粉碎机粉碎，过20目筛。将藤茶粉末、400mL去离子水加入500mL圆底烧瓶，用HCl溶液调节pH值至2，于90℃下搅拌提取2小时。将提取物过滤，收集滤液。将收集的滤液减压浓缩至100mL，在4℃下中冷却静置24小时，二氢杨梅素粗品沉淀下来。过滤，收集沉淀，重新用热水溶解，冷却结晶，收集沉淀晶体，重复此纯化步骤5次，获取白色针状晶体。

螯合提取方法选择前述实施例1的提取过程。

其中，二氢杨梅素的分子结构如图1(a)所示，二氢杨梅素锌螯合物分子结构如图1(b)所示。

测试分析：

HPLC色谱流动相为甲醇－水(体积比1：3)，流速1.0mL/min，进样量10μL；柱温25℃；检测器为二极管阵列紫外可见光检测器，检测波长288nm。红外光谱检测采用KBr压片法检测，扫描范围400cm－1－4000cm－1。紫外可见光谱检测：用DMSO溶解二氢杨梅素和二氢杨梅素锌螯合物，用水稀释100倍，在200nm－500nm范围内扫描配合物的紫外吸收光谱。

二氢杨梅素及其螯合物的检测分析：

将提取过程中获得的二氢杨梅素和二氢杨梅素锌螯合物进行紫外光谱、红外光谱检测。二氢杨梅素及锌配合物的紫外光谱图如图2所示，二氢杨梅素纯化品的吸收峰有两个，分别为207nm和289nm，而二氢杨梅素螯合物的两个吸收峰分别为220nm和323nm。红移的原因是是配体3－OH的O原子向中心离子Zn提供孤对电子成键，共轭体系电子离域度增加，跃迁能量降低，吸收峰因此发生红移。

在二氢杨梅素和二氢杨梅素锌螯合物的红外光谱图中，如图3所示，3275cm－1(DMY)和3296cm－1(DMY－Zn)为酚羟基O－H的伸缩振动，峰宽且强；1646cm－1(DMY)为二氢杨梅素4－C＝O的羰基特征吸收峰，1631cm－1(DMY－Zn)为二氢杨梅素锌螯合物的特征吸收峰，由于4－C＝O及5－O－H与Zn发生络合作用导致4－C＝O的成键电子密度降低，C＝O双键键能降低，吸收峰发生红移；1474cm－1(DMY)和1477cm－1(DMY－Zn)为苯环的特征吸收峰；1335cm－1(DMY)和1358cm－1(DMY－Zn)为2－O－H的面类变形吸收峰，由于3－C＝O发生配合作用，2－O－H电子密度增大，发生蓝移；1171cm－1(DMY)和1168cm－1(DMY－Zn)为C－O的特征吸收峰。从IR谱图整体来看，二氢杨梅素和二氢杨梅素锌螯合物的峰形和位置相似，但二氢杨梅素相对二氢杨梅素锌螯合物峰更尖锐。

从二氢杨梅素及锌配合物的IR谱和UV谱可发现，在螯合提取过程中，锌离子和二氢杨梅素形成了络合物，并在解络合纯化后实现了分离。

采用HPLC检测获得产物的纯度，图4(a)示出了纯品二氢杨梅素的HPLC图，保留时间5.71min，图4(b)示出了自制二氢杨梅素的纯品的HPLC图，出现两个峰，保留时间分别为5.70min和8.25min。以峰面积计算，获得样品的纯度为92.3％。林[11]等认为样品中二氢杨梅素存在平面型和夹角型，平面型排斥能较夹角型低得多，因此自然界主要以平面型存在。图4中5.70min处峰应为平面型，8.25min处峰应为夹角型。

传统水热法和本发明螯合提取方法的比较：

采用单因素法，在相同实验条件下分别研究传统水热提取法与螯合提取法，比较其提取率和纯度，研究提取参数包括提取时间，提取pH值，提取温度，螯合提取法硫酸锌和藤茶质量比保持1：4，料液比保持1：20。

表1提取时间对提取率和纯度的影响

Table1 the extraction ration&purification in different extractiontime

备注：藤茶对水料液比为1：20，提取温度90℃，pH为2。

表2 pH对提取率和纯度的影响

Table2 the extraction ration&purification in different pH

备注：藤茶对水料液比为1：20，提取温度90℃，提取时长2hours。

表3提取温度对提取率和纯度的影响

Table3 theextraction ration&purification indifferent temperature

备注：藤茶对水料液比为1：20，提取pH为2，提取时长2hours。

从表1可以看出，随着提取时间的增加，藤茶中二氢杨梅素的提取率都增加，2.5小时和2小时相差不大；从表2，提高酸度可以明显提高藤茶中二氢杨梅素的提取率；从表3，提高提取温度可以增加藤茶中二氢杨梅素的提取率。

比较两种提取工艺，螯合提取法比传统水热法提取率约增加28％。经过5次重结晶，两种纯化工艺获取的产品纯度接近。尽管纯度相差不多，但采用螯合提取法获取的二氢杨梅素比传统水热法获取的更白，原因在于传统水热法缺少对二氢杨梅素被空气氧化的保护，导致二氢杨梅素在提取和纯化过程中氧化成醌类物质而显色。螯合提取法比传统水热法提取率高，原因二氢杨梅素在水中也有一定溶解度，传统水热法经过5次重结晶导致每次沉淀都会有部分二氢杨梅素在母液中残留，因此导致损失；而螯合提取法纯化工艺采用ZnSO4和EDTA反复沉淀溶解，不会造成二氢杨梅素在水中的残留损失。此外，由于传统纯化工艺中，二氢杨梅素在4℃下静置24小时，5次重结晶，整个周期需要约6天，而采用螯合提取及纯化法仅需要在4℃下静置24小时一次，整个周期约2天。

相较于传统的水热法，采用螯合提取方法提取二氢杨梅素的提取率提高了约28％。由于螯合作用，二氢杨梅素更稳定，二氢杨梅素在提取和纯化过程中不易被空气中氧气氧化，产品品质更好。此外对二氢杨梅素的纯化，螯合纯化相比传统的重结晶大大节省时间。

虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。

Claims (10)

1.藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取藤茶原料，干燥后、粉碎，得到藤茶粗粉；

(2)将螯合离子溶液与藤茶粗粉添加至提取罐中，同时在提取罐中加入足量去离子水混合均匀，得到粗提取液，并调节粗提取液的PH值至1.5－4.0；

(3)将粗提取液于85°以上搅拌80－140分钟后，过滤，得到滤渣提取物；

(4)将滤渣提取物添加至解螯合剂溶液中，于80°以上搅拌4－15分钟，获得纯提取液；

(5)在纯提取液中添加硫酸盐，析出螯合沉淀物；

(6)将螯合沉淀物加入至EDTA溶液中溶解，于5°以下静置15小时以上，析出白色针状晶体，收集，干燥后获得二氢杨梅素纯品。

2.如权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，步骤(1)中的藤茶原料粉碎后过15-45目筛得到藤茶粗粉。

3.如权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，在执行步骤(6)之前，多次重复执行步骤(4)、(5)，并收集螯合沉淀物。

4.如权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，步骤(2)中的螯合离子溶液与藤茶粗粉的体积量比为1：3－5。

5.如权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，步骤(2)提取罐中添加的去离子水是藤茶原料体积量的15倍以上。

6.如权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，步骤(2)中添加盐酸至粗提取液并调节PH值为1.5－2.0。

7.如权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，步骤(2)中的螯合离子溶液包括锌离子溶液、铜离子溶液、铁离子溶液、锰离子溶液、镍离子溶液。

8.如权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，步骤(3)、步骤(4)中的搅拌过程是连续的、阶段性保持搅拌速度恒定的、在搅拌中可以切换搅拌方向的搅拌过程。

9.如权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法，其特征在于，所述解螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸。

10.用权利要求1－9之一所述的藤茶中二氢杨梅素的螯合提取方法提取的二氢杨梅素在食品、化妆品或饲料制备中的应用。