CN112022935A - 一种纯化回收葡萄渣多酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纯化回收葡萄渣多酚的方法，属于植物天然产物有效成分分离纯化领域；该方法以乙醇‑硫酸铵双水相体系为萃取剂，采用超声波辅助双水相体系萃取葡萄渣中的多酚，分离上相，通过减压蒸馏得到初步纯化的多酚萃取液，然后采用超声波强化辅助大孔树脂吸附纯化多酚萃取液中的多酚，通过解吸附、减压蒸馏和干燥后得到高纯度的多酚成品。本发明工艺简单、成本较低、周期短、易于放大，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物天然产物分离提纯领域，涉及一种纯化回收葡萄渣多酚的方法。
技术背景
酚类物质是广泛存在于植物中的一大类次生代谢产物，其结构上主要由芳香环及一个或多个羟基取代基组成。关于酚类物质的生理功能已有大量文献报道，主要为抗氧化、抗衰老、预防癌症、炎症及心血管疾病等。葡萄是酚类物质的良好来源。葡萄中的酚类物质主要为花色苷类、黄酮醇类、酚酸类、黄烷-3-醇类和芪类。葡萄渣是葡萄加工后产生的主要副产物，主要由果皮、梗及种子组成。然而，目前大部分葡萄渣开发利用率较低，主要作为肥料和饲料的生产原料，相当一部分作为垃圾直接丢弃，因此，加大对葡萄渣的资源化利用十分必要。有文献表明，加工后产生的葡萄渣中存留约70％的酚类物质，这些酚类物质不仅可开发成功能性食品、药品，还可用于化妆品加工等，具有重要的经济价值。
酚类物质提纯回收的方法有很多，其中提取方法主要为常规溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法、超高压辅助提取法、超临界流体萃取法等，纯化方法主要为大孔树脂吸附纯化法、膜分离纯化法等。工业上往往将提取和纯化技术进行耦合联用，以得到高纯度多酚产品。双水相萃取技术是一种通过两种含水溶性溶质的互不相溶体系对物质进行萃取纯化的萃取技术。当物料进入体系后，其中的亲和性物质将逐步在溶剂中溶出，由于物质在体系不同相中溶解特性、受到的分子作用力等不同，不同物质分配于不同相，从而可达到提取和初步纯化的目的。该技术具有操作简单、萃取效率高、经济环保、条件温和、易于放大等优点。
大孔树脂吸附纯化技术是常用的对多酚进行高纯度提纯的技术。该技术与固液提取技术(醇提、水提等)相结合来纯化多酚是非常常见的方法，可见于中国专利CN201910654131.4、CN 201710585096.6、CN 201811371170.5、CN 201910691437.7、CN201911088682.5中，但是固液提取过程中往往会溶入糖类、有机酸、蛋白等杂质，影响后续的分离纯化步骤以及最终产品的质量。中国专利CN201510396370.6公布了一种响应面优化高纯度筒篙总黄酮的提取纯化工艺，其首先采用超声波辅助法对筒篙总黄酮进行粗提，再采用双水相萃取法分离茼蒿总黄酮，最后采用大孔树脂纯化，得到了高纯度的黄酮。CN201610121286.8公布了一种从麻竹叶中提取黄酮的方法，其采用乙醇水溶液浸提后，采用双水相萃取分离、超滤、最后采用大孔树脂吸附纯化黄酮。两篇文件中申请人皆先粗提，再使用双水相萃取法进行分离，然后使用超滤等辅助步骤，最后采用大孔树脂吸附纯化黄酮，工艺流程复杂。
发明内容
针对现有技术中葡萄渣中存有大量酚类物质，目前其利用率低下，因此需要对其进行充分资源化利用，将其中的酚类物质进行提纯，提高产品附加值，而常用的提取纯化手段往往需要经过繁琐的步骤，工艺周期较长的缺陷，本发明的目的是提供一种纯化回收葡萄渣多酚的方法。通过超声波在双水相萃取和大孔树脂吸附纯化方面的强化作用来提高工艺效率。
一种纯化回收葡萄渣多酚的方法，首先通过超声波强化双水相萃取葡萄渣多酚，提高萃取得率，并实现多酚的初步纯化，再通过超声波强化大孔树脂吸附多酚，提高多酚吸附量，并进一步纯化多酚，即可。
作为本申请的优选技术方案，所述方法主要包括如下步骤：
(1)葡萄渣预处理：将无籽葡萄渣于烘干至水分含量约13％左右，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品贮藏备用；
(2)超声波辅助双水相萃取：采用无水乙醇、硫酸铵、水按质量比构建双水相体系，在稳定的温度和超声条件下萃取葡萄渣多酚，然后取上相料液，经抽滤和减压蒸馏后得到初步纯化的葡萄渣多酚萃取液；
(3)超声波辅助大孔树脂吸附纯化多酚：采用大孔树脂在稳定的温度和超声条件下吸附纯化多酚萃取液中的多酚，通过解吸附、减压蒸馏和冷冻干燥后得到高纯度的多酚成品。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中双水相体系是按如下方法构建的：将硫酸铵溶于去离子水中，再加入乙醇，搅拌至溶液澄清，静置后体系分为上下两相，上相为富乙醇相，下相为富盐相。
本申请没有采用现有技术中先粗提再萃取的方法，直接采用超声波辅助双水相萃取，超声波具有的空化、振荡、破碎、混合等综合效应，提高了有效成分的提取效率；研究发现在双水相萃取时同步超声辅助处理，省去了粗提步骤，还保留很好的萃取效率；同时双水相技术具备初步纯化功能，可将目标成分与杂质分配于不同相，与纯化技术耦合后能进一步提高产品纯度。
作为本申请的优选技术方案，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为17～21％，乙醇为24％～32％。
优选的，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为18～20％，乙醇为25～30％。
作为本申请的优选技术方案，步骤(2)所述条件分别为：温度20℃～40℃，声能密度41.1W/L～111.2W/L，超声频率20kHz，萃取时间60min。
作为本申请的优选技术方案，步骤(3)所述条件分别为：温度20℃～30℃，声能密度67.9W/L～199.0W/L，超声频率20kHz，吸附时间240min。超声波具有的空化作用等效应可强化固液传质过程，增加大孔树脂对吸附物质的亲和性，从而使吸附量和吸附速率得到提升。
作为本申请的优选技术方案，步骤(2)中葡萄渣与双水相体系料液比为1:30～1:50g/L。
作为本申请的优选技术方案，步骤(3)中大孔树脂与萃取液料液比为1:40～1:100g/L。
有益效果：
本发明提供的一种纯化回收葡萄渣多酚的方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)葡萄渣得到了有效的资源化利用，可提升其附加值。
(2)通过超声波的作用使多酚萃取效率和吸附纯化效率得到了明显提升，萃取得率在13.97％以上，纯度在60％以上。
(3)操作条件温和，可有效保持多酚的生物活性。
(4)乙醇、硫酸铵、大孔树脂等可实现回收利用，节省成本。
(5)本发明工艺简单、成本较低、周期短、易于放大，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例2与对比例1在多酚萃取得率方面的比较。
图2为实施例2与对比例2在多酚吸附量方面的比较。
图3为实施例2与对比例3在多酚纯度方面的比较。
具体实施方式
实施例1
(1)葡萄渣预处理：将无籽的夏黑葡萄渣于50℃条件下烘12h至水分含量约13％左右，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品置于-20℃贮藏备用。
(2)双水相体系的建立：将18g硫酸铵溶于54mL去离子水中，再加入35.4mL体积无水乙醇(0.79g/mL)，使两相体系总质量达到100g，搅拌至溶液澄清，静置1min后体系分为上下两相；所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为18％，乙醇28％。
(3)超声波辅助双水相萃取：称取葡萄渣，将其按1：50(g/L)的比例加入到双水相体系中，在温度20℃，声能密度41.1W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助萃取60min；萃取结束后采用50mL移液管吸取上相料液，分离含有葡萄渣多酚的上相；抽滤除去上相的固体残渣后进行减压蒸馏，除去乙醇，得到初步纯化的多酚萃取液。
经测定，多酚在上相的萃取得率为13.97mg/g，回收率为93.38％；糖(杂质)在下相的回收率为80.3％。
(4)超声波辅助大孔树脂吸附纯化：称取XAD-7HP大孔树脂，将其按1：100(g/L)的比例加入到多酚萃取液中，在温度30℃，声能密度67.9W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助吸附240min；吸附结束后通过抽滤分离萃取液，保留大孔树脂；采用80％乙醇对吸附饱和的树脂在30℃和100rpm的水浴振荡条件下进行解吸附，解吸次数为2次，每次45min；抽滤分离树脂，对解吸液减压蒸馏除去乙醇，冷冻干燥72h后得到高纯度的多酚成品。
经测定，多酚吸附量为27.82mg/g，纯度为61.32％。
实施例2
(1)葡萄渣预处理：将无籽的夏黑葡萄渣于50℃条件下烘12h至水分含量约13％左右，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品置于-20℃贮藏备用。
(2)双水相体系的建立：将20g硫酸铵溶于50mL去离子水中，再加入38mL体积无水乙醇，使两相体系总质量达到100g，搅拌至溶液澄清，静置1min后体系分为上下两相，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为20％，乙醇30％。
(3)超声波辅助双水相萃取：称取葡萄渣，将其按1：40(g/L)的比例加入到双水相体系中，在温度30℃，声能密度96.1W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助萃取60min；萃取结束后采用50mL移液管吸取上相料液，分离含有葡萄渣多酚的上相；抽滤除去上相的固体残渣后进行减压蒸馏，除去乙醇，得到初步纯化的多酚萃取液。
经测定，多酚在上相的萃取得率为17.25mg/g，回收率为93.7％；糖在下相的回收率为79.86％。
(4)超声波辅助大孔树脂吸附纯化：称取XAD-7HP大孔树脂，将其按1：50(g/L)的比例加入到多酚萃取液中，在温度20℃，声能密度163.02W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助吸附240min；吸附结束后通过抽滤分离萃取液，保留大孔树脂；采用80％乙醇对吸附饱和的树脂在30℃和100rpm的水浴振荡条件下进行解吸附，解吸次数为2次，每次45min；抽滤分离树脂，对解吸液减压蒸馏除去乙醇，冷冻干燥72h后得到高纯度的多酚成品。
经测定，多酚吸附量为34.21mg/g，纯度为61.77％。
实施例3
(1)葡萄渣预处理：将无籽的夏黑葡萄渣于50℃条件下烘12h至水分含量约13％左右，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品置于-20℃贮藏备用。
(2)双水相体系的建立：将20g硫酸铵溶于55mL去离子水中，再加入31.6mL体积无水乙醇，使两相体系总质量达到100g，搅拌至溶液澄清，静置1min后体系分为上下两相，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为20％，乙醇25％。
(3)超声波辅助双水相萃取：称取葡萄渣，将其按1：30(g/L)的比例加入到双水相体系中，在温度40℃，声能密度111.2W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助萃取60min；萃取结束后采用50mL移液管吸取上相料液，分离含有葡萄渣多酚的上相；抽滤除去上相的固体残渣后进行减压蒸馏，除去乙醇，得到初步纯化的多酚萃取液。
经测定，多酚在上相的萃取得率为19.62mg/g，回收率为92.4％；糖在下相的回收率为78.31％。
(4)超声波辅助大孔树脂吸附纯化：称取XAD-7HP大孔树脂，将其按1:50(g/L)的比例加入到多酚萃取液中，在温度20℃，声能密度199.0W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助吸附240min；吸附结束后通过抽滤分离萃取液，保留大孔树脂；采用80％乙醇对吸附饱和的树脂在30℃和100rpm的水浴振荡条件下进行解吸附，解吸次数为2次，每次45min；抽滤分离树脂，对解吸液减压蒸馏除去乙醇，冷冻干燥72h后得到高纯度的多酚成品。
经测定，多酚吸附量为45.87mg/g，纯度为63.19％。
实施例4
(1)葡萄渣预处理：将无籽的夏黑葡萄渣于50℃条件下烘12h至水分含量约13％左右，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品置于-20℃贮藏备用。
(2)双水相体系的建立：将20g硫酸铵溶于50mL去离子水中，再加入38mL体积无水乙醇(0.79g/mL)，使两相体系总质量达到100g，搅拌至溶液澄清，静置1min后体系分为上下两相；所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为20％，乙醇30％。
(3)超声波辅助双水相萃取：称取葡萄渣，将其按1：50(g/L)的比例加入到双水相体系中，在温度20℃，声能密度41.1W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助萃取60min；萃取结束后采用50mL移液管吸取上相料液，分离含有葡萄渣多酚的上相；抽滤除去上相的固体残渣后进行减压蒸馏，除去乙醇，得到初步纯化的多酚萃取液。
经测定，多酚在上相的萃取得率为15.36mg/g，回收率为94.43％；糖(杂质)在下相的回收率为81.85％。相比于实施例1，多酚在上相的萃取得率提升了9.9％，这是因为双水相体系中硫酸铵和乙醇浓度不同，体系的极性不同，这使得体系对多酚的萃取特性发生变化。
(4)超声波辅助大孔树脂吸附纯化：称取XAD-7HP大孔树脂，将其按1：100(g/L)的比例加入到多酚萃取液中，在温度30℃，声能密度67.9W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助吸附240min；吸附结束后通过抽滤分离萃取液，保留大孔树脂；采用80％乙醇对吸附饱和的树脂在30℃和100rpm的水浴振荡条件下进行解吸附，解吸次数为2次，每次45min；抽滤分离树脂，对解吸液减压蒸馏除去乙醇，冷冻干燥72h后得到高纯度的多酚成品。
经测定，多酚吸附量为29.65mg/g，纯度为62.34％。
对比例1
(1)葡萄渣预处理：将无籽的夏黑葡萄渣于50℃条件下烘12h至水分含量约13％左右，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品置于-20℃贮藏备用。
(2)双水相体系的建立：将20g硫酸铵溶于50mL去离子水中，再加入38mL体积无水乙醇，使两相体系总质量达到100g，搅拌至溶液澄清，静置1min后体系分为上下两相，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为20％，乙醇30％。
(3)水浴振荡双水相萃取：称取葡萄渣，将其按1：40(g/L)的比例加入到双水相体系中，然后在水浴摇床内以温度30℃，摇床转速100rpm的条件萃取60min；萃取结束后采用50mL移液管吸取上相料液，分离含有葡萄渣多酚的上相。抽滤除去上相的固体残渣后进行减压蒸馏，除去乙醇，得到初步纯化的多酚萃取液。
(4)超声波辅助大孔树脂吸附纯化：称取XAD-7HP大孔树脂，将其按1：50(g/L)的比例加入到多酚萃取液中，在温度20℃，声能密度163.02W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助吸附240min；吸附结束后通过抽滤分离萃取液，保留大孔树脂；采用80％乙醇对吸附饱和的树脂在30℃和100rpm的水浴振荡条件下进行解吸附，解吸次数为2次，每次45min；抽滤分离树脂，对解吸液减压蒸馏除去乙醇，冷冻干燥72h后得到高纯度的多酚成品。
由图1可知，水浴振荡辅助双水相萃取条件下，多酚的萃取得率为13.74mg/g，在超声波辅助双水相萃取条件下，多酚萃取得率为17.25mg/g，相比于前者，得率提升了25.54％，超声波对于萃取效率的促进效果明显。
对比例2
(1)葡萄渣预处理：将无籽的夏黑葡萄渣于50℃条件下烘12h至水分含量约13％左右，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品置于-20℃贮藏备用。
(2)双水相体系的建立：将20g硫酸铵溶于50mL去离子水中，再加入38mL体积无水乙醇，使两相体系总质量达到100g，搅拌至溶液澄清，静置1min后体系分为上下两相，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为20％，乙醇30％。
(3)超声波辅助双水相萃取：称取葡萄渣，将其按1:40(g/L)的比例加入到双水相体系中，在温度30℃，声能密度96.1W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助萃取60min；萃取结束后采用50mL移液管吸取上相料液，分离含有葡萄渣多酚的上相；抽滤除去上相的固体残渣后进行减压蒸馏，除去乙醇，得到初步纯化的多酚萃取液。
(4)水浴振荡辅助大孔树脂吸附纯化：称取XAD-7HP大孔树脂，将其按1：50(g/L)的比例加入到多酚萃取液中，然后在水浴摇床内以温度20℃，摇床转速100rpm的条件下水浴振荡辅助吸附240min。吸附结束后通过抽滤分离萃取液，保留大孔树脂；采用80％乙醇对吸附饱和的树脂在30℃和100rpm的水浴振荡条件下进行解吸附，解吸次数为2次，每次45min；抽滤分离树脂，对解吸液减压蒸馏除去乙醇，冷冻干燥72h后得到高纯度的多酚成品。
由图2可知，在超声波辅助双水相萃取耦合水浴振荡辅助吸附纯化的方式下，多酚吸附量为24.98mg/g，而超声波辅助双水相萃取耦合超声辅助大孔树脂纯化的方式下，多酚吸附量为34.21mg/g，相比于前者，吸附量提升了36.97％，超声波可强化固液传质过程，增加大孔树脂对吸附物质的亲和性，从而使吸附效率得到提升。
对比例3
(1)葡萄渣预处理：将无籽的夏黑葡萄渣于50℃条件下烘12h至水分含量约13％左右，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品置于-20℃贮藏备用。
(2)双水相体系的建立：将20g硫酸铵溶于50mL去离子水中，再加入38mL体积无水乙醇，使两相体系总质量达到100g，搅拌至溶液澄清，静置1min后体系分为上下两相，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为20％，乙醇30％。
(3)超声波辅助50％乙醇水溶液粗提：称取葡萄渣，将其按1：40(g/L)的比例加入到50％乙醇水溶液中，然后在温度30℃，声能密度96.1W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助提取60min，抽滤除去葡萄渣后进行减压蒸馏，除去乙醇，得到多酚粗提液。
(4)超声波辅助大孔树脂吸附纯化：称取XAD-7HP大孔树脂，将其按1：50(g/L)的比例加入到多酚粗提液中，在温度20℃，声能密度163.02W/L，超声频率20kHz，超声模式5s开5s关的条件下超声波辅助吸附240min；吸附结束后通过抽滤分离萃取液，保留大孔树脂；采用80％乙醇对吸附饱和的树脂在30℃和100rpm的水浴振荡条件下进行解吸附，解吸次数为2次，每次45min；抽滤分离树脂，对解吸液减压蒸馏除去乙醇，冷冻干燥72h后得到高纯度的多酚成品。
由图3可知，以50％乙醇水溶液为提取溶剂进行粗提后再进行大孔树脂吸附纯化的纯化方式下，多酚纯度为52.87％，超声波辅助双水相萃取耦合超声辅助大孔树脂纯化的纯化方式下，多酚纯度为61.77％，相比于前者，纯度提高了16.83％；双水相萃取可使多酚与其他杂质(如：糖类)得到分离，实现初步纯化，因而可使葡萄渣多酚在经过双水相萃取和大孔树脂吸附纯化后能达到更高的纯度。
以上所述实施事例仅为本发明实施方式的举例，本发明的保护范围不限于此，在不脱离本发明设计精神的前提下，任何熟悉本领域的技术人员根据本发明公开的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，首先通过超声波强化双水相萃取葡萄渣多酚，提高萃取得率，并实现多酚的初步纯化，再通过超声波强化大孔树脂吸附多酚，提高多酚吸附量，并进一步纯化多酚，即可。
2.根据权利要求1所述的纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：
（1）葡萄渣预处理：将无籽葡萄渣于烘干至水分含量13%，然后粉碎过40目和60目筛，使颗粒大小均匀，处理后的样品贮藏备用；
（2）超声波辅助双水相萃取：采用无水乙醇、硫酸铵、水按质量比构建双水相体系，在稳定的温度和超声条件下萃取葡萄渣多酚，然后取上相料液，经抽滤和减压蒸馏后得到初步纯化的葡萄渣多酚萃取液；
（3）超声波辅助大孔树脂吸附纯化多酚：采用大孔树脂在稳定的温度和超声条件下吸附纯化多酚萃取液中的多酚，通过解吸附、减压蒸馏和干燥后得到高纯度的多酚成品。
3.根据权利要求2所述的纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，所述步骤（2）中双水相体系是按如下方法构建的：将硫酸铵溶于去离子水中，再加入乙醇，搅拌至溶液澄清，静置后体系分为上下两相，上相为富乙醇相，下相为富盐相。
4.根据权利要求3所述的纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为17~21%，乙醇为24%~32%。
5.根据权利要求4所述的纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，所构建的双水相体系中，硫酸铵在体系中占比为18~20%，乙醇为25%~30%。
6.根据权利要求2所述的纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，步骤（2）所述条件分别为：温度20 ℃~40 ℃，声能密度41.1 W/L~111.2 W/L，超声频率20 kHz，萃取时间60min。
7.根据权利要求2所述的纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，步骤（3）所述条件分别为：温度20℃~30℃，声能密度67.9 W/L~199.0 W/L，超声频率20 kHz，吸附时间240min。
8.根据权利要求2所述的纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，步骤（2）中葡萄渣与双水相体系料液比为1:30~1:50 g/L。
9.根据权利要求2所述的纯化回收葡萄渣多酚的方法，其特征在于，步骤（3）中大孔树脂与萃取液料液比为1:40~1:100 g/L。
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