CN108606983A - 一种红豆杉活性提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红豆杉活性提取物的制备方法，其具体步骤为：将红豆杉枝叶干燥粉碎过筛后，加水混合，用纤维素酶酶解，灭酶；将酶解液溶于乙醇进行超声浸提，过滤取滤液；将滤液抽滤所得浸膏溶于石油醚振荡混合，减压抽滤；加入乙酸乙酯和水进行萃取，将有机相减压抽滤所得浸膏干燥可得固体活性提取物。本发明制备方法简单可行、成本低廉、绿色环保、重复性好，活性提取物提取效率、得率高，且活性稳定。

Description

一种红豆杉活性提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种红豆杉活性提取物的制备方法。
背景技术
红豆杉是国家重点保护的野生植物，是第四纪冰川后遗留下的珍稀濒危植物，是全球唯一自然药用植物，被誉为“植物黄金”。现主要分布于北半球温带至中亚热带地区，全世界约有11种，我国有其中的4种1个变种，即东北红豆杉、云南红豆杉、红豆杉、西藏红豆杉及南方红豆杉，这5种在我国西南、华南、华中、华东、西北、东北、台湾均有分布。
红豆杉属植物含有的化学成分类型多样，主要包括紫杉烷类、黄酮类、木脂素类、甾体类、酚酸类、倍半萜及糖苷类化合物等，此外，红豆杉属植物中还富含K、Ca、Mg、Cu、Zn、Mn、Fe、Na、Cr等无机元素。紫杉烷类化合物中包含紫杉醇、三尖杉宁碱、10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)、10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)等药用成分，其中含量为0.12mg/g的紫杉醇是著名的天然抗癌药物。
现有技术如授权公告号为CN 103211844 B的中国发明专利，公开了红豆杉活性提取物的提取方法，该提取方法通过将红豆杉枝叶粉碎，去除杂质后加入不同浓度甲醇进行低温浸提，再进行有机质萃取可得到红豆杉活性提取物，该方法工艺简单，可操作性强，但是只能提取红豆杉中的部分活性物质，目标提取物提取率、得率较低，尤其是紫杉醇得率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红豆杉活性提取物的制备方法，该制备方法简单可行、成本低廉、绿色环保、重复性好，活性提取物提取效率、得率高，且活性稳定。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括酶解、超声浸提、除杂、有机萃取，其具体步骤如下：
酶解：将红豆杉枝叶清洗干净，在50-60℃下低温干燥，保持含水量在10-15%，粉碎至100-120目筛，然后按固液比为1:15-25（g/mL）向红豆杉粉中加入蒸馏水，再加入占红豆杉粉重量0.2-0.4%的纤维素酶，混合均匀后在25-40℃的条件下酶解1-2h，然后置于沸水中灭酶8-15min，即得红豆杉酶解液，红豆杉枝叶粉碎时，部分植物细胞被破坏，其中的有效成分可直接溶解，但大部分细胞粉碎后仍保持原有状态，该步骤可通过酶解改变红豆杉枝叶细胞的空间结构，使枝叶中的成分能快速溶解进酶解液中，可以提高后续浸提速率和提取物得率；
超声浸提：按照酶解液与乙醇的重量比为1:25-35，将红豆杉酶解液溶于体积浓度为90-95%的乙醇溶液中，在温度为10-20℃、功率为300-500W的条件下超声浸提100-120min，过滤得滤液，将滤渣重复浸提1-2次，混合浸提所得滤液，备用，上述乙醇溶液中含有重量占比0.08-0.1%的乳酸乙酯和0.03-0.07%的异戊丁醇，加入乳酸乙酯和异戊丁醇使得乙醇与酶解液之间界面张力急剧减小，增加乙醇与酶解液的互溶性，使酶解液中不同组分在乙醇中以不同的溶解度互溶，提高乙醇对目标提取物的吸附空间，减少乙醇对杂质的浸提，以此来将目标提取物与其他杂质分离，从而进一步提高乙醇对目标提取物的提取速率，增加目标提取物的得率，同时还可以使目标提取物保持活性，使用乙醇超声浸提，可以使目标提取物溶于乙醇中，利用渗透压和浓度差，将目标提取物浸出，同时超声波一方面可有效破碎红豆杉细胞壁，使有效成分呈游离状态并溶入乙醇中，另一方面可加速乙醇的分子运动，使得乙醇和活性提取物快速接触，相互溶合，提高效率；
除杂：将浸提所得滤液减压抽滤得到浸膏后，将浸膏溶于10-15倍体积的石油醚中充分搅拌，再在振荡速度300-800r/min、功率35-55W的振荡混合器中萃取30-50min，减压抽滤，滤液减压蒸馏回收，固体浸膏待用，石油醚能够使浸膏中含有的低极性的脂类物质充分溶解其中，再经过抽滤后，可以将石油醚及溶于其中的杂质充分去除，通过去除与目标产物无关的物质，进而提高浸膏中提取物的纯度；
有机萃取：将除杂后浸膏与乙酸乙酯以重量比1:1-2的比例混合，充分溶解，再加入与乙酸乙酯等量的水，搅拌混合后静置分层，分液回收有机相，弃去水相，有机相再加水萃取，重复2-3次，将有机相中的乙酸乙酯减压蒸馏回收，固相浸膏于20-30℃条件下烘干，得到红豆杉活性提取物。
本发明所制红豆杉活性提取物中成分主要为紫杉醇、三尖杉宁碱、10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)、10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)、黄酮类化合物，具有抗癌抗肿瘤、消炎保肝的药理作用，该制备方法在提取过程中，对目标提取物有针对性，有效保护目标提取物的活性，提高活性提取物得率，具有良好的应用价值。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明制备过程中在原料粉碎后，加入了酶解处理步骤，可以有效减少后续乙醇浸提时间，从而加快提取速率；2）本发明制备过程中采用乙醇低温浸提，极大地保护了紫杉醇，使其在分离过程中不容易发生降解或异构，能够充分提取红豆杉的抗癌抗肿瘤有效成分，所制活性提取物得率高、活性稳定性好；3）本发明制备方法工艺条件温和，操作简便，同时考虑了环保及安全生产的可操作性，使用的溶剂系统不仅费用低廉，而且容易回收再利用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种红豆杉活性提取物的制备方法，其具体步骤如下：
酶解：将红豆杉枝叶1000g清洗干净，在50℃下低温干燥，保持含水量在10%，粉碎至100目筛，然后按固液比为1:15（g/mL）向红豆杉粉中加入蒸馏水，再加入占红豆杉粉重量0.2%的纤维素酶，混合均匀后在25℃的条件下酶解1h，然后置于沸水中灭酶8min，即得红豆杉酶解液；
超声浸提：按照酶解液与乙醇的重量比为1:25，将红豆杉酶解液溶于体积浓度为90%的乙醇溶液中，在温度为10℃、功率为300W的条件下超声浸提100min，过滤得滤液，将滤渣重复浸提1次，混合浸提所得滤液，备用，上述乙醇溶液中含有重量占比0.08%的乳酸乙酯和0.03%的异戊丁醇；
除杂：将浸提所得滤液减压抽滤得到浸膏后，将浸膏溶于10倍体积的石油醚中充分搅拌，再在振荡速度300r/min、功率35W的振荡混合器中萃取30min，减压抽滤，滤液减压蒸馏回收，固体浸膏待用；
有机萃取：将除杂后浸膏与乙酸乙酯以重量比1:1的比例混合，充分溶解，再加入与乙酸乙酯等量的水，搅拌混合后静置分层，分液回收有机相，弃去水相，有机相再加水萃取，重复2次，将有机相中的乙酸乙酯减压蒸馏回收，固相浸膏于20℃条件下烘干，得到红豆杉活性提取物2.02g，其中含有4.95%的紫杉醇、5.13%的三尖杉宁碱、15.65%的10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)、16.58%的10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)和19.18%的黄酮类化合物。
实施例2：
一种红豆杉活性提取物的制备方法，其具体步骤如下：
酶解：将红豆杉枝1000g叶清洗干净，在55℃下低温干燥，保持含水量在12.5%，粉碎至110目筛，然后按固液比为1:20（g/mL）向红豆杉粉中加入蒸馏水，再加入占红豆杉粉重量0.3%的纤维素酶，混合均匀后在33℃的条件下酶解1.5h，然后置于沸水中灭酶11min，即得红豆杉酶解液；
超声浸提：按照酶解液与乙醇的重量比为1:30，将红豆杉酶解液溶于体积浓度为92.5%的乙醇溶液中，在温度为15℃、功率为400W的条件下超声浸提110min，过滤得滤液，将滤渣重复浸提2次，混合浸提所得滤液，备用，上述乙醇溶液中含有重量占比0.09%的乳酸乙酯和0.05%的异戊丁醇；
除杂：将浸提所得滤液减压抽滤得到浸膏后，将浸膏溶于13倍体积的石油醚中充分搅拌，再在振荡速度500r/min、功率45W的振荡混合器中萃取40min，减压抽滤，滤液减压蒸馏回收，固体浸膏待用；
有机萃取：将除杂后浸膏与乙酸乙酯以重量比1:2的比例混合，充分溶解，再加入与乙酸乙酯等量的水，搅拌混合后静置分层，分液回收有机相，弃去水相，有机相再加水萃取，重复3次，将有机相中的乙酸乙酯减压蒸馏回收，固相浸膏于25℃条件下烘干，得到红豆杉活性提取物2.11g，其中含有5.12%的紫杉醇、5.23%的三尖杉宁碱、15.89%的10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)、16.76%的10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)和19.34%的黄酮类化合物。
实施例3：
一种红豆杉活性提取物的制备方法，进一步优化步骤如下：
酶解：将红豆杉枝1000g叶清洗干净，在55℃下低温干燥，保持含水量在12.5%，粉碎至110目筛，然后按固液比为1:20（g/mL）向红豆杉粉中加入蒸馏水，再加入占红豆杉粉重量0.3%的纤维素酶，混合均匀后在33℃的条件下酶解1.5h，然后置于沸水中灭酶11min，即得红豆杉酶解液，上述蒸馏水中含有重量占比0.07%的脯氨酸，脯氨酸中含有0.55%的右旋脯氨酸，加入脯氨酸能协助酶快速解离相邻细胞中间层粘结物，使植物组织细胞之间黏结系数降低，进而加速酶解进程，同时可避免酶解产物积累而对酶产生竞争性抑制性，使得酶解过程中能够一直保持较高的酶解速率进行酶解，同时提高酶解效率；
超声浸提：按照酶解液与乙醇的重量比为1:30，将红豆杉酶解液溶于体积浓度为92.5%的乙醇溶液中，在温度为15℃、功率为400W的条件下超声浸提110min，过滤得滤液，将滤渣重复浸提2次，混合浸提所得滤液，备用，上述乙醇溶液中含有重量占比0.09%的乳酸乙酯和0.05%的异戊丁醇；
除杂：将浸提所得滤液减压抽滤得到浸膏后，将浸膏溶于13倍体积的石油醚中充分搅拌，再在振荡速度500r/min、功率45W的振荡混合器中萃取40min，减压抽滤，滤液减压蒸馏回收，固体浸膏待用；
有机萃取：将除杂后浸膏与乙酸乙酯以重量比1:2的比例混合，充分溶解，再加入与乙酸乙酯等量的水，搅拌混合后静置分层，分液回收有机相，弃去水相，有机相再加水萃取，重复3次，将有机相中的乙酸乙酯减压蒸馏回收，固相浸膏于25℃条件下烘干，得到红豆杉活性提取物2.20g，其中含有5.23%的紫杉醇、5.36%的三尖杉宁碱、16.01%的10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)、16.83%的10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)和19.63%的黄酮类化合物。
实施例4：
一种红豆杉活性提取物的制备方法，其具体步骤如下：
酶解：将红豆杉枝叶1000g清洗干净，在60℃下低温干燥，保持含水量在15%，粉碎至120目筛，然后按固液比为1:25（g/mL）向红豆杉粉中加入蒸馏水，再加入占红豆杉粉重量0.4%的纤维素酶，混合均匀后在40℃的条件下酶解2h，然后置于沸水中灭酶15min，即得红豆杉酶解液；
超声浸提：按照酶解液与乙醇的重量比为1:35，将红豆杉酶解液溶于体积浓度为95%的乙醇溶液中，在温度为20℃、功率为500W的条件下超声浸提120min，过滤得滤液，将滤渣重复浸提2次，混合浸提所得滤液，备用，上述乙醇溶液中含有重量占比0.1%的乳酸乙酯和0.07%的异戊丁醇；
除杂：将浸提所得滤液减压抽滤得到浸膏后，将浸膏溶于15倍体积的石油醚中充分搅拌，再在振荡速度800r/min、功率55W的振荡混合器中萃取50min，减压抽滤，滤液减压蒸馏回收，固体浸膏待用；
有机萃取：将除杂后浸膏与乙酸乙酯以重量比1:2的比例混合，充分溶解，再加入与乙酸乙酯等量的水，搅拌混合后静置分层，分液回收有机相，弃去水相，有机相再加水萃取，重复2次，将有机相中的乙酸乙酯减压蒸馏回收，固相浸膏于30℃条件下烘干，得到红豆杉活性提取物2.14g，其中含有5.18%的紫杉醇、5.29%的三尖杉宁碱、15.96%的10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)、16.77%的10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)和19.56%的黄酮类化合物。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种红豆杉活性提取物的制备方法，包括酶解、超声浸提、除杂、有机萃取，其特征在于：所述超声浸提是将红豆杉酶解液溶于乙醇溶液中，超声浸提，过滤，滤渣重复浸提1-2次，混合浸提所得滤液，备用，所述乙醇溶液中含有乳酸乙酯和异戊丁醇。
2.根据权利要求1所述的一种红豆杉活性提取物的制备方法，其特征在于：所述乙醇溶液中含有重量占比为0.08-0.1%的乳酸乙酯和0.03-0.07%的异戊丁醇。
3.根据权利要求1所述的一种红豆杉活性提取物的制备方法，其特征在于：所述酶解液与乙醇重量比为1:25-35，所述乙醇溶液的体积浓度为90-95%。
4.根据权利要求1所述的一种红豆杉活性提取物的制备方法，其特征在于：所述浸提温度为10-20℃，超声功率为300-500W，时间为100-120min。
5.根据权利要求1所述的一种红豆杉活性提取物的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤为：将红豆杉枝叶清洗干净，低温干燥，粉碎过筛，然后按固液比为1:15-25（g/mL）向红豆杉粉中加入蒸馏水，再加入占红豆杉粉重量0.2-0.4%的纤维素酶，混合均匀，酶解，灭酶，即得红豆杉酶解液。
6.根据权利要求1所述的一种红豆杉活性提取物的制备方法，其特征在于：所述除杂步骤为：将浸提所得滤液减压抽滤得到浸膏后，将浸膏溶于10-15倍体积的石油醚中充分搅拌，振荡，萃取，减压抽滤，得到固体浸膏。
7.根据权利要求1所述的一种红豆杉活性提取物的制备方法，其特征在于：所述有机萃取步骤为：将除杂后浸膏与乙酸乙酯以重量比1:1-2混合，充分溶解后，加入与乙酸乙酯等量的水，搅拌混合后静置分层，分液回收有机相，有机相再加水萃取，重复2-3次，减压蒸馏，将所得固相浸膏烘干，得到红豆杉活性提取物。
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