CN113862325A - 一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液及其制备方法和应用，该方法包括以下步骤：将红豆杉叶片和/或树皮与水混合后，经打浆制成红豆杉浆体；微波处理后，加入复合酶，酶解处理，制得微波‑酶解处理红豆杉浆体；然后加入碳源、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；再加入碳源、氮源、有机酸和复合菌种，经发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再灭菌，取上清液，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液。本发明改良了红豆杉发酵液制品的口感，降低了红豆杉发酵产生的苦味，使其有一定的酸甜味，且有效成分含量高，制备方法简单、易操作，发酵时间短，制得的高紫杉醇含量红豆杉发酵液具有一定的抗肿瘤生长的效果。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液及其制备方法和应用。
背景技术
被誉为“植物大熊猫”的红豆杉中含有多种药用成分，如，紫杉烷二萜类化合物、木脂素类、黄酮类、多糖类、甾体类及许多生物碱类化合物。其中，紫杉醇作为抗肿瘤注射剂开发利用，黄酮、多糖类等多种化合物，具有免疫及抗肿瘤、抗病毒以及抗氧化活性。另外，红豆杉皮、根、茎等可炮制为红豆杉切片作为中药材饮片使用，红豆杉枝叶含有紫杉碱、萜类、糖苷类等化合物，红豆杉树皮部分含有单宁等，具有较浓的苦味，然而，目前红豆杉发酵存在发酵不稳定、风味不好、有效成分含量低和发酵时间长等缺陷。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液及其制备方法和应用，以解决现有红豆杉发酵存在发酵不稳定、有效成分含量低和发酵时间长的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将红豆杉叶片和/或树皮与水混合后，经打浆制成红豆杉浆体；
(2)将红豆杉浆体经微波处理后，加入复合酶，在厌氧条件下，酶解处理6-8天，制得微波-酶解处理红豆杉浆体；
(3)在微波-酶解处理红豆杉浆体中加入碳源、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，于45～60℃条件下，发酵5-10天，当pH为3.8-4时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；
(4)在第一次发酵红豆杉浆体中加入碳源、氮源、有机酸和复合菌种，搅拌均匀，于常温下，发酵7-15天，pH为3-3.3时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经灭菌，取上清液，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液。
本发明的有益效果为：本发明将红豆杉叶片和树皮经制浆、微波-酶解后，通过两次发酵过程发酵，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液。本发明制备方法简单、易操作，且有效成分含量高，发酵时间短，制得的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液具有一定的抑制肿瘤生长的效果。
该方法通过微波-酶解前处理，使红豆杉枝条细胞壁破裂，胞内物质易于溶出，有利于后期发酵，并使发酵速度变快，凝结芽孢杆菌兼有乳酸杆菌和芽孢杆菌的特点，如芽孢杆菌具有耐高温、快速复活和较强分泌酶等特点，在较高温度的发酵过程中，凝结芽孢杆菌生长迅速，在有氧和无氧条件下都能存活，因此，能够在整个发酵体系中能迅速优势占位，使有害菌等杂菌不易生长，发酵体系稳定，发酵过程缩短。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，在步骤(4)之前将第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合为浆体，然后再进行步骤(4)操作。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：将红豆杉不同部位混合发酵，能提高发酵质量、丰富口感。
进一步，第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合的质量比为1：0.2-0.5。
进一步，发酵红豆杉浆果通过将红豆杉果与水打浆制成红豆杉浆果，再加入碳源、果胶酶和复合菌种，发酵15-30天，制得。
进一步，复合菌种是由酵母菌、枯草芽胞杆菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖乳杆菌和唾液乳杆菌中的至少3种混合而成。
进一步，复合菌种质量为红豆杉浆果质量的0.5-2％。
进一步，碳源为葡萄糖、乳糖、白糖、红糖、阿拉伯糖、壳寡糖和海藻糖中至少一种。
进一步，碳源质量为红豆杉浆果质量的10-30％。
进一步，果胶酶质量为红豆杉浆果质量的0.5-2％。
进一步，步骤(1)中红豆杉叶片的质量为红豆杉叶片和树皮总质量的80％-100％。
进一步，步骤(1)中将红豆杉叶片和树皮与水的质量比为1：2-2.5。
进一步，步骤(1)中将红豆杉叶片和树皮打浆前经过清洗、干燥和消毒处理。
进一步，步骤(1)中干燥为使红豆杉叶片和树皮含水率为40-50％。
进一步，步骤(2)中微波处理温度为35-55℃，时间为0.5-2min，次数为1-5次。
进一步，步骤(2)中复合酶是由单宁酶与以下5种酶中至少两种混合而成，这5种酶分别为：纤维素酶、半纤维素酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：单宁酶又称鞣酸酶，能降低酯型儿茶素的含量、水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键，单宁酶的加入，使红豆杉树皮及叶片中的苦涩味降低，改良了红豆杉发酵液制品的口感，降低了红豆杉发酵产生的苦味，使其有一定的酸甜味。
进一步，选用的酶活力单位为：单宁酶500U/g，纤维素酶10万U/g，半纤维素酶5万U/g，菠萝蛋白酶5万U/g，木瓜蛋白酶10万U/g，淀粉酶1000U/g。
进一步，步骤(2)中复合酶在加入前经过无菌水溶解处理。
进一步，步骤(2)中复合酶的质量为红豆杉浆体质量的0.2-1％。
进一步，步骤(3)中凝结芽孢杆菌质量为微波-酶解处理红豆杉浆体质量的0.5-2％。
进一步，步骤(3)中碳源为葡萄糖、乳糖、白糖、红糖、阿拉伯糖、壳寡糖和海藻糖中至少一种。
进一步，步骤(3)中碳源质量为微波-酶解处理红豆杉浆体质量的9-20％。
进一步，步骤(3)中有机酸为柠檬酸、苹果酸、叶酸和抗坏血酸中至少一种。
进一步，步骤(3)中无机盐为钾盐、锰盐、钠盐中至少一种。
进一步，无机盐为硫酸锰。
进一步，步骤(3)中有机酸和无机盐的总质量为微波-酶解处理红豆杉浆体质量的0.2-0.5％。
进一步，步骤(4)中复合菌种是由酵母菌和巴氏乳杆菌与以下7种菌中至少1种混合而组成，这7种菌分别为：枯草芽胞杆菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖乳杆菌和唾液乳杆菌。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：第二次发酵采用上述复合菌种，可使发酵物口感富有层次，且进一步降低pH值，降低了苦味的程度。
进一步，步骤(4)中复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.1-0.6％。
进一步，步骤(4)中碳源为葡萄糖、乳糖、白糖、红糖、阿拉伯糖、壳寡糖和海藻糖中至少一种。
进一步，步骤(4)中碳源质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的8-15％。
进一步，步骤(4)中氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米浆、黄豆粉和多肽中至少一种。
进一步，步骤(4)中氮源质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的3-8％。
进一步，步骤(4)中有机酸为柠檬酸、苹果酸、叶酸和抗坏血酸中至少一种。
进一步，步骤(4)中有机酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.1-0.8％。
本发明还提供高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法制得的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液。
本发明还提供高紫杉醇含量的红豆杉发酵液在制备抑制肿瘤药物方面的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明对红豆杉全株进行发酵，以红豆杉叶片为主，添加或者不添加树皮以及红豆杉果，这种方法使得红豆杉发酵可以不受季节制约，可以仅采摘叶片部分发酵，保护了植物，也可以将红豆杉不同部位混合发酵，能提高发酵质量、丰富口感。本发明的制备方法制备的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液口感略酸甜、微苦，紫杉醇含量可达到1.16mg/L，总黄酮含量可达到1311mg/kg，总多糖含量可达到64.10g/kg，溶菌酶可达到611.08IU/L，总的制备时间仅为26天，且制备的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液具有抑制肿瘤的效果。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例及对比例中采用的酶活力单位为：单宁酶500U/g，纤维素酶10万U/g，半纤维素酶5万U/g，菠萝蛋白酶5万U/g，木瓜蛋白酶10万U/g，淀粉酶1000U/g。以下实施例及对比例中红豆杉浆果发酵均与红豆杉浆体同时发酵。
实施例1：
一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取红豆杉新鲜叶片和红豆杉树皮，分别用清水清洗3次，再使用无菌水进行超声波清洗5min，然后适当沥干水分，保持含水率为45％，再于紫外线波长254mm条件下，照射5min消毒，然后将红豆杉叶片、树皮和无菌水按质量比为1：2.5混合，再在破壁机中以55000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；其中，红豆杉叶片的质量为红豆杉叶片和树皮总质量的80％；
(2)微波-酶解处理红豆杉浆体
将红豆杉浆体放置在微波加热设备中，保持温度为45℃，一次微波处理时间为2min，反复处理3次，然后在由单宁酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶和淀粉酶组成的复合酶中加入适量的无菌水，搅拌均匀后，将其加入至红豆杉浆体中，密封，厌氧酶解7天，制得微波-酶解红豆杉浆体；其中，复合酶的质量为红豆杉浆体质量的0.4％，复合酶中单宁酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶和淀粉酶质量比为1：2：2：1；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在微波-酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、红糖、阿拉伯糖、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，搅拌均匀，于55℃条件下，发酵7天，测得pH值为3.9时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、红糖和阿拉伯糖总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的20％，葡萄糖、红糖和阿拉伯糖质量比为3：2.5：0.5，有机酸和无机盐的总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的0.2％，有机酸和无机盐的质量比为2：1，有机酸为柠檬酸和叶酸，其质量比为1：3，无机盐为硫酸锰和氯化钠，其质量比为1：1，凝结芽孢杆菌质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的0.8％。
(4)发酵红豆杉浆果
将红豆杉果用无菌水清洗后，加入红豆杉果质量50％的无菌水打成浆体，制得红豆杉浆果，再加入葡萄糖、乳糖、白糖、果胶酶和由酵母菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌混合而成的复合菌种，发酵15天，制得发酵红豆杉浆果；其中，葡萄糖、乳糖和白糖总质量为红豆杉浆果浆体质量的20％，葡萄糖、乳糖和白糖质量比为3：1：1，果胶酶质量为红豆杉浆果质量的1.2％，复合菌种质量为红豆杉浆果质量的1.5％，复合菌种中酵母菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌重量比为2：1：1；
(5)第二次发酵红豆杉浆体
将第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合为浆体，加入葡萄糖、红糖、海藻糖、抗坏血酸、叶酸、娃娃鱼多肽和由酵母菌、巴氏乳杆菌、枯草芽胞杆菌和植物乳杆菌植物亚种混合而成的复合菌种，搅拌均匀，发酵时间为14天，pH值为3时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经紫外灭菌后，取上清液，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液；其中，第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合质量比为1：0.5，葡萄糖、红糖和海藻糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的12％，葡萄糖、红糖和海藻糖的质量比为2：1：1，抗坏血酸和叶酸的总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.2％，抗坏血酸和叶酸质量比为1：1，娃娃鱼多肽质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的3％，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.5％，复合菌种中酵母菌、巴氏乳杆菌、枯草芽胞杆菌和植物乳杆菌植物亚种的质量比为1：1：1：2。
实施例2：
一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取红豆杉新鲜叶片和红豆杉树皮，分别用清水清洗3次，再使用无菌水进行超声波清洗5min，然后适当沥干水分，保持含水率为45％，再于紫外线波长254mm条件下，照射5min消毒，然后将红豆杉叶片、树皮和无菌水按质量比为1：2混合，再在破壁机中以50000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；其中，红豆杉叶片的质量为红豆杉叶片和树皮总质量的85％；
(2)微波-酶解处理红豆杉浆体
将红豆杉浆体放置在微波加热设备中，保持温度为35℃，一次微波处理时间为2min，反复处理3次，然后在由单宁酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶混合而成的复合酶中加入适量的无菌水，搅拌均匀后，将其加入至红豆杉浆体中，密封，厌氧酶解7天，制得微波-酶解红豆杉浆体；其中，复合酶的质量为红豆杉浆体质量的1％，复合酶中单宁酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶质量比为2：1：0.5：1.5：1；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在微波-酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、壳寡糖、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，搅拌均匀，于55℃条件下，发酵7天，测得pH值为3.9时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖和壳寡糖总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的9％，葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖和壳寡糖质量比为3：1.5：0.5：1，有机酸和无机盐的总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的0.3％，有机酸和无机盐的质量比为2.5：1，有机酸为柠檬酸和苹果酸，其质量比为1：2，无机盐为硫酸锰和氯化钠，其质量比为1：1，凝结芽孢杆菌质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的2％。
(4)发酵红豆杉浆果
将红豆杉果用无菌水清洗后，加入红豆杉果质量45％的无菌水打成浆体，制得红豆杉浆果，再加入葡萄糖、乳糖、红糖、果胶酶和由酵母菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌植物亚种混合而成的复合菌种，发酵15天，制得发酵红豆杉浆果；其中，葡萄糖、乳糖和红糖总质量为红豆杉浆果质量的10％，葡萄糖、乳糖和红糖质量比为2：1：2，果胶酶质量为红豆杉浆果质量的0.5％，复合菌种质量为红豆杉浆果质量的2％，复合菌种中酵母菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌植物亚种重量比为2：1：2；
(5)第二次发酵红豆杉浆体
将第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合为浆体，加入葡萄糖、乳糖、红糖、阿拉伯糖、海藻糖、抗坏血酸、苹果酸、娃娃鱼多肽和由酵母菌、巴氏乳杆菌、嗜热链球菌、类干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌混合而成的复合菌种，搅拌均匀，发酵时间为15天，pH值为3.3时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经紫外灭菌后，取上清液，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液；其中，第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合质量比为1：0.2，葡萄糖、乳糖、红糖、阿拉伯糖和海藻糖的总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的15％，葡萄糖、乳糖、红糖、阿拉伯糖和海藻糖的质量比为2：1：1：1:1，抗坏血酸和苹果酸的总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.1％，抗坏血酸和苹果酸质量比为1：0.5，娃娃鱼多肽质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的8％，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体量的0.2％，复合菌种中酵母菌、巴氏乳杆菌、嗜热链球菌、类干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的质量比为2：1：1：1：2。
实施例3：
一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取红豆杉新鲜叶片和红豆杉树皮，分别用清水清洗3次，再使用无菌水进行超声波清洗4min，然后适当沥干水分，保持含水率为50％，再于紫外线波长254mm条件下，照射5min消毒，然后将红豆杉叶片、树皮和无菌水按质量比为1：2.3混合，再在破壁机中以55000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；其中，红豆杉叶片的质量为红豆杉叶片和树皮总质量的90％；
(2)微波-酶解处理红豆杉浆体
将红豆杉浆体放置在微波加热设备中，保持温度为40℃，一次微波处理时间为1.5min，反复处理3次，然后在由单宁酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶混合而成的复合酶中加入适量的无菌水，搅拌均匀后，将其加入至红豆杉浆体中，密封，厌氧酶解7天，制得微波-酶解红豆杉浆体；其中，复合酶的质量为红豆杉浆体质量的0.8％，复合酶中单宁酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶质量比为1：2：3；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在微波-酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、红糖、乳糖、阿拉伯糖、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，搅拌均匀，于60℃条件下，发酵5天，测得pH值为3.9时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、红糖、乳糖和阿拉伯糖总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的10％，葡萄糖、红糖、乳糖和阿拉伯糖质量比为2：2：1.5：0.5，有机酸和无机盐的总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的0.5％，有机酸和无机盐的质量比为1：0.5，有机酸为柠檬酸和叶酸，其质量比为1：3，无机盐为硫酸锰，凝结芽孢杆菌质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的0.8％。
(4)发酵红豆杉浆果
将红豆杉果用无菌水清洗后，加入红豆杉果质量55％的无菌水打成浆体，制得红豆杉浆果，再加入葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、果胶酶和由酵母菌、枯草芽胞杆菌和类干酪乳杆菌混合而成的复合菌种，发酵20天，制得发酵红豆杉浆果；其中，葡萄糖、乳糖和阿拉伯糖总质量为红豆杉浆果浆体质量的25％，葡萄糖、乳糖和阿拉伯糖质量比为3：1：1，果胶酶质量为红豆杉浆果质量的2％，复合菌种质量为红豆杉浆果质量的1％，复合菌种中酵母菌、枯草芽胞杆菌和类干酪乳杆菌重量比为2：1：1；
(5)第二次发酵红豆杉浆体
将第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合为浆体，加入葡萄糖、壳寡糖、海藻糖、抗坏血酸、叶酸、娃娃鱼多肽和由酵母菌、巴氏乳杆菌和戊糖乳杆菌混合而成的复合菌种，搅拌均匀，发酵时间为14天，pH值为3.1时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经紫外灭菌后，取上清液，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液；其中，第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合质量比为1：0.3，葡萄糖、壳寡糖和海藻糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的8％，葡萄糖、壳寡糖和海藻糖的质量比为2：1：1，抗坏血酸和叶酸的总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.8％，抗坏血酸和叶酸质量比为1：0.5，娃娃鱼多肽质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的3.5％，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.6％，复合菌种中酵母菌、巴氏乳杆菌和戊糖乳杆菌的质量比为1：1：2。
实施例4：
一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取红豆杉新鲜叶片和红豆杉树皮，分别用清水清洗3次，再使用无菌水进行超声波清洗5min，然后适当沥干水分，保持含水率为40％，再于紫外线波长254mm条件下，照射5min消毒，然后将红豆杉叶片、树皮和无菌水按质量比为1：2.5混合，再在破壁机中以55000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；其中，红豆杉叶片的质量为红豆杉叶片和树皮总质量的80％；
(2)微波-酶解处理红豆杉浆体
将红豆杉浆体放置在微波加热设备中，保持温度为55℃，一次微波处理时间为2min，处理1次，然后在由单宁酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶混合而成的复合酶中加入适量的无菌水，搅拌均匀后，将其加入至红豆杉浆体中，密封，厌氧酶解7天，制得微波-酶解红豆杉浆体；其中，复合酶的质量为红豆杉浆体质量的0.5％，复合酶中单宁酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶质量比为1：2：2：1；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在微波-酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、红糖、乳糖、阿拉伯糖、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，搅拌均匀，于45℃条件下，发酵10天，测得pH值为4时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、红糖、乳糖和阿拉伯糖总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的11％，葡萄糖、红糖、乳糖和阿拉伯糖质量比为2：2：1.2：0.5，有机酸和无机盐的总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的0.4％，有机酸和无机盐的质量比为1：1，有机酸为柠檬酸、抗坏血酸和叶酸，其质量比为1：1：2，无机盐为硫酸锰，凝结芽孢杆菌质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的1％。
(4)第二次发酵红豆杉浆体
在第一次发酵红豆杉浆体中加入葡萄糖、红糖、海藻糖，抗坏血酸、柠檬酸、娃娃鱼多肽和由酵母菌、巴氏乳杆菌、和唾液乳杆菌混合而成的复合菌种，搅拌均匀，发酵时间为14天，pH值为3.2时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经紫外灭菌后，取上清液，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液；其中，葡萄糖、红糖和海藻糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的15％，葡萄糖、红糖和海藻糖的质量比为2：1：1，抗坏血酸和柠檬酸的总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.6％，抗坏血酸和柠檬酸质量比为1：1，娃娃鱼多肽质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的3％，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.1％，复合菌种中酵母菌、巴氏乳杆菌和唾液乳杆菌的质量比为1：1：2。
实施例5：
一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取红豆杉新鲜叶片，用清水清洗3次，再使用无菌水进行超声波清洗5min，然后适当沥干水分，保持含水率为50％，再于紫外线波长254mm条件下，照射5min消毒，然后将红豆杉叶片、树皮和无菌水按质量比为1：2混合，再在破壁机中以50000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；
(2)微波-酶解处理红豆杉浆体
将红豆杉浆体放置在微波加热设备中，保持温度为45℃，一次微波处理时间为0.5min，反复处理4次，然后在由单宁酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶混合而成的复合酶中加入适量的无菌水，搅拌均匀后，将其加入至红豆杉浆体中，密封，厌氧酶解8天，制得微波-酶解红豆杉浆体；其中，复合酶的质量为红豆杉浆体质量的0.2％，复合酶中单宁酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶质量比为0.5：1：2：1；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在微波-酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、红糖、海藻糖、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，搅拌均匀，于55℃条件下，发酵8天，测得pH值为3.9时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、红糖和海藻糖总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的10％，葡萄糖、红糖和海藻糖质量比为3：3：1，有机酸和无机盐的总质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的0.4％，有机酸和无机盐的质量比为1：2，有机酸为柠檬酸和叶酸，其质量比为1：3，无机盐为硫酸锰和氯化钠，其质量比为1：1，凝结芽孢杆菌质量为微波-酶解红豆杉浆体质量的0.5％。
(4)发酵红豆杉浆果
将红豆杉果用无菌水清洗后，加入红豆杉果质量50％的无菌水打成浆体，制得红豆杉浆果，再加入葡萄糖、壳寡糖、海藻糖、果胶酶和由酵母菌、嗜热链球菌和戊糖乳杆菌混合而成的复合菌种，发酵20天，制得发酵红豆杉浆果；其中，葡萄糖、乳糖和白糖总质量为红豆杉浆果浆体质量的15％，葡萄糖、壳寡糖和海藻糖质量比为3：1：1，果胶酶质量为红豆杉浆果质量的1％，复合菌种质量为红豆杉浆果质量的1％，复合菌种中酵母菌、嗜热链球菌和戊糖乳杆菌重量比为2：1：1；
(5)第二次发酵红豆杉浆体
将第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合为浆体，加入葡萄糖、红糖、海藻糖、抗坏血酸、叶酸、娃娃鱼多肽和由酵母菌、巴氏乳杆菌、枯草芽胞杆菌和类干酪乳杆菌混合而成的复合菌种，搅拌均匀，发酵时间为12天，pH值为3.3时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经紫外灭菌后，取上清液，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液；其中，第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合质量比为1：0.2，葡萄糖、红糖和海藻糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的12％，葡萄糖、红糖和海藻糖的质量比为2：1：1，抗坏血酸和叶酸的总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.6％，抗坏血酸和叶酸质量比为1：1，娃娃鱼多肽质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的4％，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.5％，复合菌种中酵母菌、巴氏乳杆菌、枯草芽胞杆菌和类干酪乳杆菌的质量比为1：1：1：2。对比例1：
一种红豆杉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取红豆杉新鲜叶片和红豆杉树皮，分别用清水清洗3次，再使用无菌水进行超声波清洗5min，然后适当沥干水分，保持含水率为45％，再于紫外线波长254mm条件下，照射5min消毒，然后将红豆杉叶片、树皮和无菌水按质量比为1：2.5混合，再在破壁机中以55000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；其中，红豆杉叶片的质量为红豆杉叶片和树皮总质量的80％；
(2)第一次发酵红豆杉浆体
红豆杉浆体中加入葡萄糖、红糖、阿拉伯糖、有机酸和无机盐，搅拌均匀，于55℃条件下，发酵18天，测得pH值为3.9时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、红糖和阿拉伯糖总质量为红豆杉浆体质量的20％，葡萄糖、红糖和阿拉伯糖质量比为3：2.5：0.5，有机酸和无机盐的总质量为红豆杉浆体质量的0.2％，有机酸和无机盐的质量比为2：1，有机酸为柠檬酸和叶酸，其质量比为1：3，无机盐为硫酸锰和氯化钠，其质量比为1：1。
(3)发酵红豆杉浆果
将红豆杉果用无菌水清洗后，加入红豆杉果质量50％的无菌水打成浆体，制得红豆杉浆果，再加入葡萄糖、乳糖、白糖、果胶酶和由酵母菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌混合而成的复合菌种，发酵15天，制得发酵红豆杉浆果；其中，葡萄糖、乳糖和白糖总质量为红豆杉浆果浆体质量的20％，葡萄糖、乳糖和白糖质量比为3：1：1，果胶酶质量为红豆杉浆果质量的1.2％，复合菌种质量为红豆杉浆果质量的1.5％，复合菌种中酵母菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌重量比为2：1：1；
(4)第二次发酵红豆杉浆体
将第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合为浆体，加入葡萄糖、红糖、海藻糖、抗坏血酸、叶酸、娃娃鱼多肽和由酵母菌、巴氏乳杆菌、枯草芽胞杆菌和植物乳杆菌植物亚种混合而成的复合菌种，搅拌均匀，发酵时间为90天，pH值为3时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经紫外灭菌后，取上清液，制得红豆杉发酵液；其中，第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合质量比为1：0.5，葡萄糖、红糖和海藻糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的12％，葡萄糖、红糖和海藻糖的质量比为2：1：1，抗坏血酸和叶酸的总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.2％，抗坏血酸和叶酸质量比为1：1，娃娃鱼多肽质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的3％，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.5％，复合菌种中酵母菌、巴氏乳杆菌、枯草芽胞杆菌和植物乳杆菌植物亚种的质量比为1：1：1：2。对比例2：
一种红豆杉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取红豆杉新鲜叶片和红豆杉树皮，分别用清水清洗3次，再使用无菌水进行超声波清洗5min，然后适当沥干水分，保持含水率为40％，再于紫外线波长254mm条件下，照射5min消毒，然后将红豆杉叶片、树皮和无菌水按质量比为1：2.5混合，再在破壁机中以55000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；其中，红豆杉叶片的质量为红豆杉叶片和树皮总质量的80％；
(2)第一次发酵红豆杉浆体
在红豆杉浆体中加入葡萄糖、红糖、乳糖、阿拉伯糖、有机酸和无机盐，搅拌均匀，于45℃条件下，发酵20天，测得pH值为4时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、红糖、乳糖和阿拉伯糖总质量为红豆杉浆体质量的11％，葡萄糖、红糖、乳糖和阿拉伯糖质量比为2：2：1.2：0.5，有机酸和无机盐的总质量为红豆杉浆体质量的0.4％，有机酸和无机盐的质量比为1：1，有机酸为柠檬酸、抗坏血酸和叶酸，其质量比为1：1：2，无机盐为硫酸锰。
(3)第二次发酵红豆杉浆体
在第一次发酵红豆杉浆体中加入葡萄糖、红糖、海藻糖，抗坏血酸、柠檬酸、娃娃鱼多肽和由酵母菌、巴氏乳杆菌、和唾液乳杆菌混合而成的复合菌种，搅拌均匀，发酵时间为100天，pH值为3.2时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经紫外灭菌后，取上清液，制得红豆杉发酵液；其中，葡萄糖、红糖和海藻糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的15％，葡萄糖、红糖和海藻糖的质量比为2：1：1，抗坏血酸和柠檬酸的总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.6％，抗坏血酸和柠檬酸质量比为1：1，娃娃鱼多肽质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的3％，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.1％，复合菌种中酵母菌、巴氏乳杆菌和植唾液乳杆菌的质量比为1：1：2。
结果检测
一、发酵时间
对实施例1-5和对比例1-2红豆杉发酵液的制备时间进行统计，结果见表1，由表1可知，采用本发明方法制备高紫杉醇含量的红豆杉发酵液，发酵速度得到了很大的提高，节约了发酵时间。
表1红豆杉发酵液的制备时间
二、发酵口感及紫杉醇、总黄酮(以芦丁计)、总多糖和溶菌酶含量测定
对实施例1-5和对比例1-2制备的红豆杉发酵液的口感及紫杉醇、总黄酮(以芦丁计)、总多糖和溶菌酶的含量进行测定，其中，发酵口感中，酸度以“微酸、略酸、酸”代表酸度依次上升，苦度以“微苦、稍苦、苦”代表苦度依次上升，紫杉醇含量采用高效液相色谱仪检测，总黄酮含量和总多糖含量采用分光光度计检测，溶菌酶含量采用酶联免疫分析试剂盒检测。
总多糖按照分光光度法计算，以葡萄糖计，具体检测方法为：配制葡萄糖标准溶液：称取干燥105℃烘干至恒重的葡萄糖0.050g，溶解后定容于500mL容量瓶中，于4℃冰箱储存。配制5％的苯酚溶液：精密称取重蒸馏苯酚25.0g，溶解后，定容于500mL容量瓶，于4℃冰箱储存。精确吸取葡萄糖标准液，分别为0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，分别置于10mL比色管中，加蒸馏水补至2.0mL，依次加入苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5.0mL，混合均匀，在室温放置30min后，使用可见分光光度计，于波长490nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。准确吸取发酵液0.5mL加蒸馏水，定容至250mL，精确吸取稀释液1.0mL，按标准曲线制备的方法测定吸光度值，并根据回归方程，求得其浓度，计算样品中总多糖的含量。
以上检测结果见表2，由表2可知，采用本发明的制备方法制备的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液口感略酸甜、微苦，紫杉醇含量可达到1.16mg/L，总黄酮含量可达到1311mg/kg，总多糖含量可达到64.10g/kg，溶菌酶可达到611.08IU/L。
表2发酵口感及紫杉醇、总黄酮(以芦丁计)、总多糖和溶菌酶含量
三、对肿瘤生长的抑制及对脾脏系数的影响
将实施例1-5和对比例1-2制备的红豆杉发酵液对肿瘤生长的抑制及对脾脏质量分数的影响根据《抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则》进行实验验证，具体实验方法为：对小鼠接种s180肿瘤，培养10d，颈椎脱臼处死，在无菌操作下，取生长良好的肿瘤组织，少许生理盐水浸泡，将肿瘤组织剪成2～3mm3小块，向无菌套管针内塞入一块，接种于昆明种小鼠左后肢。接种后小鼠随机分为9组，每组10只，分别为肿瘤模型组、阳性对照组及实施例1-5组和对比例1-2组，肿瘤模型组按剂量10mL/kg，灌胃给予0.5％CMC，阳性对照组按剂量50mg/kg灌胃给予环磷酰胺，实施例1-5组及对比例1-2组按照剂量1000mg/kg灌胃给予实施例及对比例制得的发酵液，每日一次，连续给药10d，实验过程中小鼠自由进食、饮水，第11天停药，次日颈椎脱臼处死，分离肿瘤块和脾脏组织，分别称取各组小鼠各部分重量，取均值并计算各组肿瘤生长抑制率和脾脏系数，计算公式如下：
发酵液对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用计算结果见表3，由表3可知，本发明制备的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液对肿瘤生长具有一定的抑制作用。
表3发酵液对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用(n＝10)
注：与肿瘤模型组比较，*P<0.05；“-”为无数据。
发酵液对脾脏系数的影响计算结果见表4，由表4可知，阳性对照组与肿瘤模型组相比较，差异有统计学意义，发酵物与肿瘤模型相比较，差异无统计学意义，本发明制备的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液对肿瘤生长起抑制作用的同时，对免疫系统几乎没有影响。
表4发酵物对小鼠脾脏系数的影响结果(
n＝10)
与肿瘤模型组相比较，*P<0.05
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将红豆杉叶片和/或树皮与水混合后，经打浆制成红豆杉浆体；
(2)将红豆杉浆体经微波处理后，加入复合酶，在厌氧条件下，酶解处理6-8天，制得微波-酶解处理红豆杉浆体；
(3)在微波-酶解处理红豆杉浆体中加入碳源、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，于45～60℃条件下，发酵5-10天，当pH为3.8-4时，结束发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；
(4)在第一次发酵红豆杉浆体中加入碳源、氮源、有机酸和复合菌种，搅拌均匀，于常温下，发酵7-15天，pH为3-3.3时，结束发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体，再经灭菌，取上清液，制得高紫杉醇含量的红豆杉发酵液。
2.根据权利要求1所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，其特征在于，在步骤(4)之前将第一次发酵红豆杉浆体和发酵红豆杉浆果混合为浆体，然后再进行步骤(4)操作。
3.根据权利要求2所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，其特征在于，发酵红豆杉浆果通过将红豆杉果与水打浆制成红豆杉浆果，再加入碳源、果胶酶和复合菌种，发酵15-30天，制得。
4.根据权利要求1所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中微波处理温度为35-55℃，时间为0.5-2min，次数为1-5次。
5.根据权利要求1所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中复合酶是由单宁酶与以下5种酶中至少两种混合而成，这5种酶分别为：纤维素酶、半纤维素酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶。
6.根据权利要求1所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，其特征在于，步骤(3)中凝结芽孢杆菌质量为微波-酶解处理红豆杉浆体质量的0.5-2％。
7.根据权利要求1所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，其特征在于，步骤(4)中复合菌种是由酵母菌和巴氏乳杆菌与以下7种菌中至少1种混合而组成，这7种菌分别为：枯草芽胞杆菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖乳杆菌和唾液乳杆菌。
8.根据权利要求1所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法，其特征在于，步骤(4)中复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.1-0.6％。
9.权利要求1-8任一项所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液的制备方法制得的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液。
10.权利要求9所述的高紫杉醇含量的红豆杉发酵液在制备抑制肿瘤药物方面的应用。
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2021
- 2021-11-09 CN CN202111322287.6A patent/CN113862325B/zh active Active
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