CN112370487A - 一种树莓及灰树花发酵产品及其发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种树莓及灰树花发酵产品及其发酵方法。将树莓匀浆制成培养基，发酵获得树莓灰树花发酵液，经过复合酶的可控酶解工艺及浓缩工艺，获得树莓灰树花浓缩液，该浓缩液可以进一步制成口服液、片剂等产品。本发明所得树莓灰树花发酵液中灰树花多糖比普通培养基提高了16.33%、浓缩液制成的产品经过动物实验证明具有极佳的增强免疫力效果，提升了树莓的营养价值和附加值、拓宽了树莓的加工渠道，填补了本领域树莓和灰树花协同发酵深加工的空白。

Description

一种树莓及灰树花发酵产品及其发酵方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种树莓及灰树花发酵产品及其发酵方法。
背景技术
树莓是蔷薇科悬钩子属的浆果类经济果树植物，果实是一种聚合果、味道酸甜，有红色，金色和黑色。研究显示，树莓鲜果含有各种易被吸收的营养成份：蛋白质0.2%、脂肪0.5%、碳水化合物13.6%、纤维3%、钾1.68‰、钙0.22‰、磷0.22‰、镁0.2‰，富含维生素如：每100克鲜果含VP 240mg、VC 25mg、VPP0.9mg、VB9 0.25mg、VB20.09mg、VA 0.039mg、VB10.03mg，还含有丰富的树莓酮、鞣化酸、花青素、SOD(超氧化物歧化酶)等各种功能性成分，为各国消费者广泛认可，在国际市场上被誉为“ 黄金水果”，具有改善人体新陈代谢、抗衰老，抗氧化、防癌、保护肝脏功能、提高机体免疫力等多种功效。
由于树莓的浆果皮薄多汁且营养丰富采摘下来的鲜果难以保藏，易腐败变质，树莓鲜果常温保存一般达不到24小时，因此，在大面积种植树莓的地区，必须建有加工厂，保证当天采摘的鲜果能加工处理。
我国的很多企业对树莓的深加工都进行了研究，专利CN109198497 A一种树莓干粉及其制备方法，将树莓打碎后添加载体冻干制成干品后可以作为食品或保健食品的原料；专利CN 108285849 A一种树莓果酒的酿造方法，将树莓打碎后接种酵母发酵酒精、经澄清工艺制得果酒；专利CN 107712888 A一种红树莓口服液，向树莓果汁中添加营养成分后制成口服液。这些专利都对树莓的营养尽大可能的保存。
综上所述，树莓具有丰富的营养成分，但难以保鲜，现有技术中对其深加工大多是发酵制成果酒，但这种方式更多的是满足了风味上的需求，有些重要营养成分会被分解代谢掉，失去了原本的保健价值，而其他的保健功效的加工方法，一般仅仅是提取树莓中某种成分，或者直接榨汁复配，也是难以将树莓营养最大化利用。
灰树花（Grifolafrondosa）属担子菌亚门层菌纲非褶菌目多孔菌科树花菌属真菌，液体深层发酵灰树花菌丝体香味浓郁、味道鲜美、营养丰富，含有多糖、多肽、糖蛋白、多酚等多种生理活性物质，具有抗癌、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、治疗肝炎、降血脂以及降血糖等医疗保健作用和药用价值，风行北美、日本和东南亚各国。
针对树莓和灰树花这两种营养丰富、保健价值极高的产品，将两者共同进行深加工，协同发挥功效的产品和方法目前本领域尚未发现。
发明内容
针对现有技术一种树莓及灰树花发酵产品及其发酵方法，以树莓果浆作为培养基，接种灰树花种子发酵获得树莓灰树花发酵液，经过复合酶的可控酶解工艺及浓缩工艺，获得树莓灰树花浓缩液，该浓缩液可以进一步制成口服液、片剂等产品。本发明所得树莓灰树花发酵液中灰树花多糖比普通培养基提高了16%左右、浓缩液制成的产品经过动物实验证明具有极佳的增强免疫力效果，提升了树莓的营养价值和附加值、拓宽了树莓的加工渠道，填补了本领域树莓和灰树花协同发酵深加工的空白。
本发明的技术方案如下：
一种树莓及灰树花发酵产品，其以树莓果浆作为培养基，接种灰树花种子进行发酵，具体包括如下步骤：
（1）树莓培养基的制备：
将熟透、色泽鲜艳、无腐烂的树莓，搅碎成果浆，加水高速匀浆成树莓果浆糊，补充白砂糖搅拌均匀后，80℃30min灭菌，制备成树莓培养基。
（2）树莓灰树花发酵液的制备：
将活化的灰树花菌种接种PD培养基，制备灰树花种子液，将其接种于灭菌的树莓培养基中，发酵96～120h，制备树莓灰树花发酵液。
（3）树莓灰树花发酵液酶解浓缩：
向树莓灰树花发酵液中加入复合酶酶解并匀浆、过筛处理，获得树莓灰树花发酵酶解液，进一步将酶解液真空浓缩，获得树莓灰树花发酵酶解浓缩液。
优选的，步骤（1）中树莓与水的质量比为1: 3～5；白砂糖用量为树莓果浆糊的2.0～3.5%（w/w）。
优选的，步骤（1）中树莓培养基中颗粒粒径均小于200目。
优选的，步骤（2）中灰树花种子液的制备方法具体为：将活化的灰树花试管斜面菌种用接种铲铲取0.5*0.5cm2的菌丝培养基到PD培养基100mL中，培养温度28℃，摇床转速180rpm，培养时间为72～96h，培养基中有均匀的颗粒菌球时停止培养，得到灰树花种子液。
优选的，步骤（2）中树莓培养基中灰树花种子液的接种量为5～10%（v/w）。
优选的，步骤（2）中发酵培养温度为28～30℃，转速180～220rpm，待发酵液干物质含量达到3.0～3.4%停止发酵。
优选的，步骤（3）酶解液的制备：按照灰树花发酵液0.3～0.5‰（w/w）添加复合酶，控制温度为20～40℃，搅拌反应4～6h，获得含有灰树花多糖、多肽、糖蛋白、多酚等多种生理活性物质的酶解液；
所述的复合酶选自酸性脂肪酶、纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶、β-1，4-葡聚糖内切酶、单宁酶中的至少3种；
优选的，按重量份计，复合酶组成为：酸性脂肪酶5～10份、纤维素酶5～15份、果胶酶5～20份、酸性蛋白酶20～50份、β-1，4-葡聚糖内切酶10～30份、单宁酶10～20份。
优选的，步骤（3）中匀浆后过200目筛。
优选的，步骤（3）中真空浓缩条件为：-0.08～-0.1MPa，80～90℃；浓缩至干物质含量15.0～16.0%。
本发明中上述方法获得的树莓灰树花发酵酶解浓缩液可以配合相应辅料进一步制备成增强免疫力产品，例如口服液和片剂等，制备方法可采用现有常规技术。
取树莓灰树花发酵酶解浓缩液，添加的甜味剂和稳定剂，搅拌均匀，按照常规方法高温瞬时灭菌并灌装10mL/支，即得增强免疫力口服液，口服液推荐量为1支/天；
取树莓灰树花发酵酶解浓缩液，喷雾干燥得干粉；取干粉、粘合剂、填充剂和成型剂压片制成0.6g/粒增强免疫力片剂成品，片剂推荐量为3粒/天。
树莓果浆营养丰富，含有适宜微生物生长的碳源碳水化合物13.6%、氮源蛋白质0.2%、能源脂肪0.5%、还含有种类丰富的微量元素和维生素，为微生物生长提供了必要的无机盐及生长因子。树莓果浆培养灰树花菌丝体中含蛋白质21.3%，粗脂肪2.49%，粗纤维10.65%，总糖57.26%，灰树花多糖7.73%，多酚类物质0.93%； 发酵液中含灰树花多糖1.78%、总糖2.18%，比灰树花普通培养基发酵液中灰树花多糖和总糖含量分别提高16.33%、14.14%。
灰树花UDP- 葡萄糖焦磷酸化酶(UDP glucose pyrophosphorylase, UGP)是灰树花糖代谢合成途径中的一个关键酶。UGP 以葡萄糖 -1- 磷酸和尿苷三磷酸为底物，催化反应生成尿苷二磷酸葡萄糖和焦磷酸，直接参与了糖代谢的生物合成。在酸性条件下，葡萄糖与树莓酮的羟基缩合生成的树莓酮葡糖苷（4-丁酮基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）结合了灰树花UDP- 葡萄糖焦磷酸化酶的巯基，显著的激活了灰树花UDP- 葡萄糖焦磷酸化酶的活性，促进了灰树花菌丝体胞外多糖的生产。综上所述，树莓果浆非常适宜作为灰树花的发酵培养基。
另外，树莓灰树花发酵液中灰树花菌丝体与树莓果浆中没有被利用的脂肪、纤维、果胶等错综复杂的交缠在一起，本发明采用酸性脂肪酶、纤维素酶、果胶酶能在酸性条件下水解未被利用的树莓培养基和灰树花菌丝体细胞壁，将灰树花细胞内部的多糖、蛋白质等物质释放出来，酸性蛋白酶非特异性的水解灰树花蛋白、糖蛋白成多肽，β-1，4-葡聚糖内切酶特异性水解灰树花多糖成寡糖，单宁酶能对带有两个苯酚基的酸产生水解作用成多酚，酶解反应树莓果浆中的大分子和灰树花的功能成分暴露、水解成多肽、寡糖、多酚等更易吸收的小分子物质。
综上所述，本发明具有以下优点：
1）以树莓为培养基发酵灰树花制备的增强免疫力产品，只添加了食品碳源葡萄糖，发酵液中灰树花多糖比普通培养基提高了16.33%，营养价值高，质量容易掌握。
2）树莓灰树花发酵液经过复合酶的酶解，生理活性强的小分子物质较多的溶于水解液中，人体更易吸收。
3）制备的树莓灰树花增强免疫力产品，经动物实验增强免疫力效果明显，提高了树莓的营养价值和附加值，拓宽了树莓的加工渠道。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。下面实施例中所用的操作技术及原料药品除特殊说明外都是常规的并被本领域所熟知的。
实施例1
一种树莓发酵灰树花制备增强免疫力口服液的方法，具体步骤包括：
（1）树莓培养基的制备：
挑选熟透、色泽鲜艳、无腐烂的树莓500g，清洗干净后，用组织捣碎机将树莓鲜果搅碎成果浆，添加饮用水500g混合后进行高速匀浆过200目筛后，将未过筛的树莓145g与饮用水290g混合后再进行高速匀浆，得到均匀树莓果浆糊，将两次所得树莓果浆糊混合后添加饮用水至树莓与水的质量比为1: 5得到最终树莓果浆糊、添加白砂糖90g搅拌均匀，80℃，30min灭菌。
（2）树莓灰树花发酵液的制备：
在无菌操作台上，将活化的灰树花试管斜面菌种用接种铲铲取0.5*0.5cm2的菌丝培养基到PD培养基100mL中，培养温度28℃，摇床转速180rpm，培养时间为96h，培养基中有均匀的颗粒菌球时停止培养，获得灰树花种子液，按照8%（v/w）的接种量接种240mL种子液于灭菌的树莓培养基中，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间为100h，检测发酵液干物质含量达到3.4%停止发酵，获得灰树花发酵液。
（3）树莓灰树花浓缩液的制备：
按照树莓灰树花发酵液0.3‰（w/w）添加混合酶于树莓灰树花发酵液中，混合酶按重量份，组成为：酸性脂肪酶8份、果胶酶20份、β-1，4-葡聚糖内切酶10份，控制温度为25℃，搅拌反应6h，获得树莓灰树花酶解液，将酶解液进行高速匀浆处理，过200目筛、真空-0.08MPa，82℃浓缩至干物质含量达到15.8%停止浓缩，获得树莓灰树花浓缩液632mL。
（4）增强免疫力口服液的制备：
取树莓灰树花发酵酶解浓缩液，添加的甜味剂和稳定剂，搅拌均匀，高温瞬时灭菌并灌装10mL/支，即得增强免疫力口服液。
实施例2
一种树莓发酵灰树花制备增强免疫力口服液的方法，具体步骤包括：
（1）树莓培养基的制备：
挑选熟透、色泽鲜艳、无腐烂的树莓200kg，清洗干净后，用组织捣碎机将树莓鲜果搅碎成果浆，添加饮用水200kg混合后进行高速匀浆过200目筛后，将未过筛的树莓54kg与饮用水108kg混合后再进行高速匀浆，得到均匀树莓果浆糊，将两次所得树莓果浆糊混合后添加饮用水至水的质量比为1: 3.5，添加白砂糖18kg搅拌均匀，80℃，30min灭菌。
（2）树莓灰树花发酵液的制备：
在无菌操作台上，将活化的灰树花试管斜面菌种用接种铲铲取0.5*0.5cm2的菌丝培养基到100mLPD培养基中，培养温度28℃，摇床转速180rpm，培养时间为80h，培养基中有均匀的颗粒小球时停止培养，得到一级种子液，按照10%（v/w）的接种量接种4.5L于二级种子液中，培养温度28℃，发酵罐转速180rpm，培养时间为72h，培养基中有均匀的颗粒菌球时停止培养，得到二级种子液；按照5%（v/w）的接种量接种45L种子液于灭菌的树莓培养基中，培养温度28.5℃，发酵罐转速180rpm，培养时间为96h，检测发酵液干物质含量达到3.1%停止发酵，获得灰树花发酵液。
（3）树莓灰树花浓缩液的制备：
按照灰树花发酵液0.4‰（w/w）添加混合酶于树莓灰树花发酵液中，混合酶组成为：酸性脂肪酶10份、纤维素酶7份、果胶酶5份、酸性蛋白酶50份、β-1，4-葡聚糖内切酶20份、单宁酶20份，控制温度为40℃，搅拌反应5h，获得树莓灰树花酶解液，将酶解液进行高速匀浆处理，过200目筛、真空-0.09MPa， 80℃浓缩至干物质含量达到16.0%停止浓缩，获得树莓灰树花浓缩液165kg。
（4）增强免疫力口服液的制备：
取树莓灰树花发酵酶解浓缩液，添加的甜味剂和稳定剂，搅拌均匀，高温瞬时灭菌并灌装10mL/支，即得增强免疫力口服液。
实施例3
一种树莓发酵灰树花制备增强免疫力片剂的方法，具体步骤包括：
（1）树莓培养基的制备：
挑选熟透、色泽鲜艳、无腐烂的树莓1kg，清洗干净后，用组织捣碎机将树莓鲜果搅碎成果浆，添加饮用水1kg混合后进行高速匀浆过200目筛后，将未过筛的树莓294g与饮用水588g混合后再进行高速匀浆，得到均匀树莓果浆糊，将两次所得树莓果浆糊混合后添加饮用水至树莓与水的质量比为1: 4，添加白砂糖110g搅拌均匀，80℃，30min灭菌。
（2）树莓灰树花发酵液的制备：
在无菌操作台上，将活化的灰树花试管斜面菌种用接种铲铲取0.5*0.5cm2的菌丝培养基到PD培养基100mL中，培养温度28℃，摇床转速180rpm，培养时间为72h，培养基中有均匀的颗粒菌球时停止培养，获得灰树花种子液，按照10%（v/w）的接种量接种500mL种子液于灭菌的树莓培养基中，培养温度28℃，摇床转速220rpm，培养时间为110h，检测发酵液干物质含量达到3.0%停止发酵，获得灰树花发酵液。
（3）树莓灰树花浓缩液的制备：
按照树莓灰树花发酵液0.5‰（w/w）添加混合酶于树莓灰树花发酵液中，混合酶按重量份，组成为：纤维素酶5份、酸性蛋白酶30份、单宁酶10份，控制温度为30℃，搅拌反应4.5h，获得树莓灰树花酶解液，将酶解液进行高速匀浆处理，过200目筛、真空-0.1MPa 85℃浓缩至干物质含量达到15.0%停止浓缩，获得树莓灰树花浓缩液980mL。
（4）增强免疫力片剂的制备：
取树莓灰树花发酵酶解浓缩液，喷雾干燥得干粉；取干粉、粘合剂、填充剂和成型剂压片制成0.6g/粒片，即得增强免疫力片剂。
实施例4
一种树莓发酵灰树花制备增强免疫力片剂的方法，具体步骤包括：
（1）树莓培养基的制备：
挑选熟透、色泽鲜艳、无腐烂的树莓100kg，清洗干净后，用组织捣碎机将树莓鲜果搅碎成果浆，添加饮用水100kg混合后进行高速匀浆过200目筛后，将未过筛的树莓28kg与饮用水56kg混合后再进行高速匀浆，得到均匀树莓果浆糊，将两次所得树莓果浆糊混合后添加饮用水至树莓与水的质量比为1: 3，添加白砂糖14kg搅拌均匀，80℃30min灭菌。
（2）树莓灰树花发酵液的制备：
在无菌操作台上，将活化的灰树花试管斜面菌种用接种铲铲取0.5*0.5cm2的菌丝培养基到100mLPD培养基中，培养温度28℃，摇床转速180rpm，培养时间为90h，培养基中有均匀的颗粒小球时停止培养，得到一级种子液，按照5%（v/w）的接种量接种1.8L于二级种子液中，培养温度28℃，发酵罐转速180rpm，培养时间为96h，培养基中有均匀的颗粒菌球时停止培养，得到二级种子液；按照9%（v/w）的接种量接种36L种子液于灭菌的树莓培养基中，培养温度29℃，发酵罐转速210rpm，培养时间为120h，检测发酵液干物质含量达到3.3%停止发酵，获得灰树花发酵液。
（3）树莓灰树花浓缩液的制备：
按照灰树花发酵液0.38‰（w/w）添加混合酶于树莓灰树花发酵液中，混合酶组成为：酸性脂肪酶5份、纤维素酶15份、果胶酶12份、酸性蛋白酶20份、β-1，4-葡聚糖内切酶30份、单宁酶15份，控制温度为20℃，搅拌反应4h，获得树莓灰树花酶解液，将酶解液进行高速匀浆处理，过200目筛、真空-0.085MPa，90℃浓缩至干物质含量达到15.5%停止浓缩，获得树莓灰树花浓缩液81kg。
（4）增强免疫力片剂的制备：
取树莓灰树花发酵酶解浓缩液，喷雾干燥得干粉；取干粉、粘合剂、填充剂和成型剂压片制成0.6g/粒片，即得增强免疫力片剂。
对比例
树莓培养基与普通培养基发酵灰树花营养成分对比
将实施例1中灰树花发酵液与专利CN106316526A一种灰树花液体发酵培养基及其制备方法中灰树花发酵培养基采用实施例1发酵条件所得发酵液进行对比分析，所采用的种子液均为实施例1中方法所制备的种子液，分析结果如表1：
表1
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由表1树莓培养基与普通培养基发酵灰树花营养成分对比可得，在种子液培养条件与发酵液培养条件相同的情况下，两种培养基发酵的菌丝体营养成分相差不大、发酵液中灰树花多糖和总糖含量实施例1的发酵培养基比专利CN106316526A一种灰树花液体发酵培养基及其制备方法中灰树花发酵培养基分别提高16.33%、14.14%，说明树莓培养基促进了灰树花菌丝体胞外多糖的生产、非常适宜作为灰树花的发酵培养基。
实验例：本发明增强免疫力产品对小鼠免疫力功能的影响实验
选用清洁级雄性小鼠共320只，体重为18～22克，将其随机分为4组，每组80只，分别为实验组1、2，对照组以及空白对照组，所有实验动物均食用全价营养配合饲料，动物自由摄食、摄水。
实验组1分别给去离子水（20mL/kgBw）中加入实施例2的增强免疫力口服液，给药剂量为1.67mL/kg（以树莓灰树花浓缩液计，相当于人体每日推荐量的10倍），连续灌胃30天；
实验组2分别给去离子水（20mL/kgBw）中加入实施例4的粉碎增强免疫力片，给药剂量为0.25g/kg（以树莓灰树花干粉计，相当于人体每日推荐量的10倍），连续灌胃30天；
对照组给去离子水（20mL/kgBw）中加入对比例利用专利CN106316526A一种灰树花液体发酵培养基及其制备方法发酵灰树花菌丝干粉0.25g/kg（相当于人体每日推荐量的10倍），连续灌胃30天；
空白对照组给去离子水（20mL/kgBw），连续灌胃30天。
实验方法：
（1）脏/体比值测定
实验结束称量小鼠体重，脱臼处死并取出胸腺和脾脏，称重后计算脏/体比值。
（2）ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
首先进行脾细胞悬液制备，小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下取脾，放在装有适量无菌Hank's 液的平皿内，轻轻将脾磨碎，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank's液洗涤 2次，每次 1000rpm离心10min。然后取沉淀悬浮于 1mL 的完全培养液中，台酚兰染色计数活细胞数( 应在 95% 以上) ，调整细胞浓度为3 × 106个/mL。然后将制备好的每份细胞悬液分 2 孔加入 24 孔培养板中，每孔 1mL，在其中一孔加 75 μLConA液( 相当于 7.5 μL/mL) ，另一孔作为对照，装入5% CO2、37 ℃的二氧化碳孵箱中培养 72 h。培养结束前 4 h，每孔轻轻吸去上清液 0.7mL，加入 0.7mL不含小牛血清的RPMT1640 培养液，同时加入 MTT( 5mg /mL) 50 μL/孔，继续培养 4h，培养结束后，每孔加入 1mL 酸性异丙醇，混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到 96 孔培养板，每孔做 3 个平行孔，用酶标仪，以 570 nm 波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
（3）迟发型变态反应( DTH) ( 足跖增厚法 )
给小鼠腹腔注射2% ( v/v ) SRBC( 0.2 m L/每鼠) 致敏 4 d 后，测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射 20% ( v/v) SRBC ( 20μL/每鼠) ，于注射后 24h 测量左后足跖厚度，同一部位测量三次，取平均值，以攻击前后足跖厚度差值( 足跖肿胀度) 来表示DTH 的程度。
（4）抗体生成细胞检测 ( Jerne改良玻片法)
每只小鼠腹腔注射 0.2mL 将压积SRBC 用生理盐水配成 2% ( v/v) 的细胞悬液，将免疫 5d 后的小鼠颈椎脱臼处死，取脾，放在装有Hank's液的平皿内，轻轻将脾磨碎，制成细胞悬液，经 200 目筛网过滤，1000rpm离心10min、用Hank's液洗涤 2 次，最后将细胞悬浮在 5m LRPM1640 培养液中，台酚兰染色计数( 应在 95% 以上) ，并将细胞浓度调整为5 × 106个/mL，制成脾细胞悬液。将琼脂糖用双蒸水配制成 1% 的水溶液，水浴保温，与等量的pH7.4双倍浓度Hank's液混合，分装小试管，每管 0.5mL，再向管内加用 SA 缓冲液配制的 10% 压积SRBC 50μL，20μL 脾细胞悬液，迅速混匀后，倾倒于琼脂糖薄层的玻片上，做两个平行样，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育 1.5h，然后用 SA 液稀释的补体加入到玻片架凹槽内，继续温育 1.5h，计数溶血空斑数。
（5）血清溶血素测定( 血凝法)
每只小鼠腹腔注射用生理盐水配制的 2% ( v/v) 压积SRBC 0.2 mL 进行免疫，5d后，摘除小鼠的眼球，取血于离心管内，放置 1h，2000rpm离心 10 min，分离，收集血清。用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释 12 孔，将不同稀释度的血清置于微量血凝板中，每孔 100 μL，再加入 100 μL 0.5% ( v/v) 的SRBC悬液，混匀，装入湿盒中 37 ℃孵育 3h后，观察每孔的血球凝集程度，并计算抗体积数。
抗体水平 = ( S1 + 2S2 + 3S3 . . . . . .n Sn)
式中: 1、2、3 . . . . . .n代表对倍稀释的指数，S 代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。
（6）小鼠单核－巨噬细胞碳廓清实验
小鼠尾静脉注射用 5 倍生理盐水稀释的印度墨汁，按每 10g体重注射 0.1 mL，墨汁注入后立即计时，于注入后第 2、10 min，分别从内眦静脉丛取血 20μL，加到 2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，以 0.1% Na2CO3溶液作空白对照，用 723 分光光度计在 600 nm 处测定光密度值(OD) 。取血后将小鼠处死，称取肝、脾质量，按下式计算吞噬指数α。
K =（lgOD1－lgOD2）/（t2－t1）
吞噬指数α=体重×
Figure 169942DEST_PATH_IMAGE003
Figure 643780DEST_PATH_IMAGE004
/（肝重+脾重）
式中：OD1、OD2分别为 2、10 min 时样品的吸光度； t1、t2分别为 2、10 min。
（7）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验( 半体内法)
给小鼠腹腔注射用生理盐水洗涤 3 次后的 20%鸡红细胞 ( 1500rpm，10min) 悬液，每只 1 mL，30 min 后，颈椎脱臼处死。再向小鼠腹腔注入生理盐水 2 mL，转动鼠板 1min，吸取腹腔洗液 1 mL，滴于洁净的载玻片上，置于 37 ℃湿盒内 30 min，孵毕，取出用生理盐水漂洗，晾干后以甲醇/丙酮( 1:1) 固定，4%Giemsa PBS 染色 3 min，再用蒸馏水漂洗后晾干，镜检。按下式计算小鼠腹腔吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率( % ) =吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数× 100/计数的吞噬细胞数
吞噬指数 =被吞噬的鸡红细胞总数/计数的吞噬细胞数
（8）NK 细胞活性测定 ( 乳酸脱氢酶 LDH 测定法)
小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，磨碎，制成脾细胞悬液，过 200 目筛网后，用Hank's液洗 3 次，每次1000rpm离心 10min。弃上清，将细胞浆弹起，加入 0.5 mL 灭菌水裂解红细胞，台酚兰染色计数( 活细胞数应在 95% 以上) ，最后用RPM1640 完全培养液将细胞浓度调整为 2×107个/m L，此为效应细胞。在实验前 24 h 将靶细胞进行传代培养，用Hank's液洗 3 次，用RPM 1640 完全培养液将细胞浓度调整为4 × 105个/m L，此为靶细胞。取靶细胞和效应细胞各100 μL( 效靶比 50:1) ，置于 U 型 96 孔培养板中各 3个平行孔，同时做靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 100 μL及最大释放孔加靶细胞 100 μL和2.5%Triton 100 μL各 3 个平行孔，置 5% CO2、37 ℃二氧化碳孵箱中培养 4h，然后以1500rpm离心5 min，每孔吸取上清液 100 μL置于另一 96 孔培养板中，同时每孔再加入LDH 基质液 100 μL，反应 10 min，每孔加入 1 mol/L 的HCl 30 μL终止反应，在酶标仪490 nm 处测定 OD 值，按下式计算 NK 细胞活性。
NK 细胞活性( % ) = ( 反应孔 OD -自然释放孔OD) × 100 /( 最大释放孔OD-自然释放孔 OD)
实验结果：
（1）本发明增强免疫力产品对脏/体比值测定的影响
由表 2可知，实验1、2组和对照组小鼠的脾脏/体重比值、胸腺/体重比值均高于空白对照组，但差异不显著，表明本发明增强免疫力产品对小鼠的免疫器官重量无明显影响。
表2 本发明增强免疫力产品对小鼠胸腺/体重比值及脾脏/体重比值的影响
实验组别 动物只数（只） 胸腺/体重（mg/g） 脾脏/体重（mg/g）
实验组1 10 0.381±0.024 0.472±0.031
实验组2 10 0.383±0.018 0.474±0.026
对照组 10 0.346±0.035 0.426±0.024
空白对照组 10 0.332±0.020 0.407±0.033
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
（2）本发明增强免疫力产品对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响
由表3可知，实验组1、2相对空白对照组显著提高小鼠的抗体细胞生成数，对照组相对空白对照组无显著差异，表明本发明增强免疫力产品对小鼠的淋巴细胞增殖能力有显著的促进作用。
表3 本发明增强免疫力产品对小鼠淋巴细胞转化实验的影响
实验组别 动物只数（只） 淋巴细胞增值能力（OD差值）
实验组1 10 0.072±0.014*
实验组2 10 0.071±0.020*
对照组 10 0.055±0.013
空白对照组 10 0.048±0.019
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
（3）本发明增强免疫力产品对小鼠迟发型变态反应( DTH) 的影响
由表 4可知，实验组1、2相对空白对照组极显著增高小鼠的足跖肿胀度，对照组相对空白对照组无显著差异，表明本发明增强免疫力产品对小鼠的迟发型变态反应有极显著的促进作用。
表4本发明增强免疫力产品对小鼠迟发型变态反应( DTH) 的影响
实验组别 动物只数（只） 足跖肿胀度( mm)
实验组1 10 0.68±0.016**
实验组2 10 0.67±0.011**
对照组 10 0.54±0.015
空白对照组 10 0.52±0.012
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
（4）本发明增强免疫力产品对小鼠抗体生成细胞的影响
由表 5可知，实验组1、2相对空白对照组显著提高小鼠的溶血空斑数，对照组相对空白对照组无显著差异，表明本发明增强免疫力产品对小鼠的抗体生成细胞增殖有显著的促进作用。
表5本发明增强免疫力产品对小鼠抗体生成细胞的影响
实验组别 动物只数（只） 溶血空斑数（个/10<sup>6</sup>脾细胞）
实验组1 10 230±25*
实验组2 10 227±19*
对照组 10 213±20
空白对照组 10 205±16
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
（5）本发明增强免疫力产品对小鼠血清溶血素的影响
由表6 可知，实验1、2组和对照组小鼠抗体积数均高于空白对照组，但差异不显著，表明本发明增强免疫力产品对小鼠的血清溶血素无明显影响。
表6本发明增强免疫力产品对小鼠血清溶血素的影响
实验组别 动物只数（只） 抗体积数
实验组1 10 138.64±13.42
实验组2 10 138.41±17.36
对照组 10 134.89±15.87
空白对照组 10 131.25±14.22
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
（6）本发明增强免疫力产品对小鼠单核－巨噬细胞碳廓清功能的影响
由表 7可知，实验组1、2相对空白对照组显著提高小鼠的吞噬指数，对照组相对空白对照组无显著差异，表明本发明增强免疫力产品对小鼠的单核－巨噬细胞碳廓清功能有显著的促进作用。
表7本发明增强免疫力产品对小鼠单核－巨噬细胞碳廓清功能的影响
实验组别 动物只数（只） 吞噬指数α
实验组1 10 6.14±0.69*
实验组2 10 6.10±0.71*
对照组 10 5.54±0.67
空白对照组 10 5.26±0.58
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
（7）本发明增强免疫力产品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
由表 8可知，实验组1、2相对空白对照组显著提高小鼠的吞噬率和吞噬指数，对照组相对空白对照组无显著差异，表明本发明增强免疫力产品对小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬能力有显著的提高作用。
表8本发明增强免疫力产品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
实验组别 动物只数（只） 吞噬率( % ) 吞噬指数
实验组1 10 17.79±3.67* 0.238±0.034*
实验组2 10 17.68±2.96* 0.234±0.036*
对照组 10 14.62±3.25 0.198±0.028
空白对照组 10 12.35±3.14 0.173±0.025
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
（8）本发明增强免疫力产品对小鼠NK细胞活性的影响
由表 9可知，实验组1、2相对空白对照组显著提高小鼠的NK细胞活性，对照组相对空白对照组无显著差异，表明本发明增强免疫力产品对小鼠的 NK 细胞活性有显著的促进作用。
表9本发明增强免疫力产品对小鼠NK 细胞活性的影响
实验组别 动物只数（只） NK 细胞活性（%）
实验组1 10 37.87±2.98*
实验组2 10 37.51±3.04*
对照组 10 33.96±2.93
空白对照组 10 31.64±2.86
与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
综合上述实验结果表明，本发明增强免疫力产品具有促进小鼠的细胞免疫功能、抗体生成细胞增殖、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK 细胞活性的作用，因此，本发明增强免疫力产品具有增强免疫力的功能。

Claims (10)

1.一种灰树花发酵培养基，其特征在于，该培养基包括：将树莓加水高速匀浆成树莓果浆糊， 树莓与水的质量比为1: 3～5，加入白砂糖，用量为树莓果浆糊的2.0～3.5%w/w。
2.一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，发酵工艺具体包括如下步骤：
（1）树莓培养基的制备：
将树莓，搅碎成果浆，加水高速匀浆成树莓果浆糊，补充白砂糖搅拌均匀后，80℃，30min灭菌，制备成树莓培养基；
（2）树莓灰树花发酵液的制备：
将活化的灰树花菌种接种PD培养基，制备灰树花种子液，将其接种于灭菌的树莓培养基中，发酵96～120h，制备树莓灰树花发酵液；
（3）树莓灰树花发酵液酶解浓缩：
向树莓灰树花发酵液中加入复合酶酶解并匀浆、过筛处理，获得树莓灰树花发酵酶解液，进一步将酶解液真空浓缩，获得树莓灰树花发酵酶解浓缩液。
3.根据权利要求2所述的一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，步骤（1）中树莓与水的质量比为1: 3～5；白砂糖用量为树莓果浆糊的2.0～3.5%w/w。
4.根据权利要求2所述的一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，步骤（1）中树莓培养基中颗粒粒径均小于200目。
5.根据权利要求2所述的一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，步骤（2）中树莓培养基中灰树花种子液的接种量为5～10%v/w。
6.根据权利要求2所述的一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，步骤（2）中发酵培养温度为28～30℃，转速180～220rpm，待发酵液干物质含量达到3.0～3.4%停止发酵。
7.根据权利要求2所述的一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，步骤（3）中树莓灰树花发酵酶解液的制备：按照灰树花发酵液0.3～0.5‰w/w添加复合酶，控制温度为20～40℃，搅拌反应4～6h。
8.根据权利要求2所述的一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，所述的复合酶选自酸性脂肪酶、纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶、β-1，4-葡聚糖内切酶、单宁酶中的至少3种。
9.根据权利要求2或7或8所述的一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，按重量份计，复合酶组成为：酸性脂肪酶5～10份、纤维素酶5～15份、果胶酶5～20份、酸性蛋白酶20～50份、β-1，4-葡聚糖内切酶10～30份、单宁酶10～20份。
10.根据权利要求2所述的一种树莓及灰树花发酵产品，其特征在于，步骤（3）中匀浆后过200目筛；步骤（3）中真空浓缩条件为：-0.08～-0.1MPa，80～90℃；浓缩至干物质含量15.0～16.0%。
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