CN109568518B

CN109568518B - 中药混合菌固体发酵的方法和所得到的发酵中药及其应用

Info

Publication number: CN109568518B
Application number: CN201910072956.5A
Authority: CN
Inventors: 方文棋; 郑雪媚; 蒋顺进; 黄炜乾; 程艳; 张文
Original assignee: Qingyuan Yisheng Natural Biological Research Institute Co ltd; Guangdong Rongda Biology Co ltd
Current assignee: Qingyuan Yisheng Natural Biological Research Institute Co ltd; Guangdong Rongda Biology Co ltd
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109568518A

Abstract

本发明提供了中药混合菌固体发酵的方法和所得到的发酵中药及其应用。本发明方法包括：向中药发酵培养基中，分别接入冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌，进行发酵；其中，所述中药发酵培养基中含有中草药固体。本发明中，将冠突散囊菌以及鼠李糖杆菌配合使用，不仅能够通过细菌发酵使得中药有效成分的溶出，而且还能够改善中药发酵制剂的风味。同时，通过对于不同菌种接入时间，以及发酵温度和时间等条件的优化，进一步提高了发酵效率。

Description

中药混合菌固体发酵的方法和所得到的发酵中药及其应用

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体而言，涉及中药混合菌固体发酵的方法和所得到的发酵中药及其应用。

背景技术

抗生素的使用，给畜牧业带来了一次洗礼，促进了动物生长，提高了动物的机体免疫能力。然而，抗生素的过度使用，也导致了病菌的耐药性增强和药物残留等问题，对畜牧业和人类健康带来了重大的危害。虽然对于抗生素的使用有着严格的限制，然而，在养殖生产中，抗生素的应用仍然十分广泛，甚至出现滥用抗生素的情况。

中草药含有蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素和矿物质等营养物质，这些都是动物生长中所必不可少的营养元素，而其的多糖、生物碱类、植物油、有机酸等功能性物质也有利于提高家畜的生长性能和免疫功能。

然而，由于植物细胞壁的阻碍作用，使得中草药所含的有效物质难以得到充分的释放。通过微生物发酵之后，由于植物细胞壁被酶解，大量的活性物质溶出，极大的提高了功能性物质的溶出，因而发酵后的中药药效一般都会优于中药原药。

虽然中草药发酵技术取得一定的进展，但在中药发酵产品研究中，仍有不足之处。例如，选择合适的发酵菌种，对于生物发酵的生产有着重要的意义。然而，如何合理的选择菌种以及进行菌种搭配，则仍是需要解决的技术问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种中药混合菌固体发酵的方法，本发明中，以冠突散囊菌和鼠李糖杆菌对中药进行固体发酵，有效提高了中药的生物活性。

本发明的第二目的在于提供一种所述由本发明方法所得到的发酵中药。

本发明的第三目的在于提供一种本发明发酵中药在饲料添加剂中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种中药混合菌固体发酵的方法，所述方法包括：向中药发酵培养基中，分别接入冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌，进行发酵；其中，所述中药发酵培养基中含有中草药固体。

优选的，本发明所述的方法中，所述中草药包括：麦芽，薏苡仁，淡竹叶，桑叶以及山楂。

优选的，本发明所述的方法中，所述中药发酵培养基主要由中草药，碳源，氮源，以及无机盐混合后灭菌制得；更优选的，所述碳源包括：葡萄糖；以及/或者，所述氮源包括：麸皮，蛋白胨以及酵母粉中的一种或几种；以及/或者，所述无机盐包括：磷酸二氢钾以及硫酸镁中的一种或几种。

优选的，本发明所述的方法中，所述中药发酵培养基中，各原料含量如下：中草药80～90％，碳源3～8％，氮源3～15％，无机盐0.2～0.5％。

优选的，本发明所述的方法中，首先在中药发酵培养基中接入冠突散囊菌，然后再接入鼠李糖乳杆菌。

优选的，本发明所述的方法中，冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌的接入间隔时间为6～48h。

优选的，本发明所述的方法中，发酵的时间为：5～8d，发酵的温度为：25～30℃。

同时，本发明还提供了由本发明方法得到的发酵中药。

进一步的，本发明也提供了本发明发酵中药在动物生长促进剂中的应用；以及/或者，本发明发酵中药在动物饲料添加剂中的应用。

同样的，本发明还提供了包含本发明发酵中药的饲料。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中，将冠突散囊菌以及鼠李糖杆菌配合使用，不仅能够通过细菌发酵使得中药有效成分的溶出，而且还能够改善中药发酵制剂的风味。

同时，通过对于不同菌种接入时间，以及发酵温度和时间等条件参数的优化，也进一步提高了发酵效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明具体实施方式中不同处理固体发酵前后还原糖含量变化；

图2为本发明具体实施方式中不同处理固体发酵前后可溶性总糖含量变化；

图3为本发明具体实施方式中不同处理固体发酵前后总黄酮含量变化；

图4为未发酵中药5d后中药发酵培养基示意图；

图5为以冠突散囊菌单菌发酵5d后中药发酵培养基示意图；

图6为以冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌+啤酒酵母发酵5d后中药发酵培养基示意图；

图7为冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌5d后中药发酵培养基示意图；

图8为以冠突散囊菌+啤酒酵母发酵5d后中药发酵培养基示意图；

图9为未发酵中药8d后中药发酵培养基示意图；

图10为以冠突散囊菌单菌发酵8d后中药发酵培养基示意图；

图11为以冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌+啤酒酵母发酵8d后中药发酵培养基示意图；

图12为冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌8d后中药发酵培养基示意图；

图13为以冠突散囊菌+啤酒酵母发酵8d后中药发酵培养基示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)，俗称“金花菌”，是获砖茶发花过程中自然形成的一种具有益生性能的优势菌，2016年12月获国家卫计委新食品原料受理，具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、促消化等保健功效。同时，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)是从健康人肠道分离出的一株乳杆菌，是人类研究最广泛的益生菌之一，有调节肠道菌群、增强宿主肠道抵抗力，排除毒素、预防和治疗腹泻、提高机体免疫力等生理保健功能。

虽然利用多菌种对于中药制剂进行发酵已经有过一些相关的尝试，然而，利用冠突散囊菌或者鼠李糖乳杆菌对中药复合剂进行固体发酵的研究却鲜有报道，更没有将二者配合对中药进行发酵的尝试。

相较于单一菌种发酵而言，本发明中，将冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌配合发酵作用，取得了更好的发酵效果。

具体的，本发明所提供的以冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌复合菌为菌种，对中药进行固体发酵的方法可参考如下：

首先，将麦芽，薏苡仁，淡竹叶，桑叶以及山楂烘干后分别进行粉碎，混合得到中草药混合物；

其中，麦芽，薏苡仁，淡竹叶，桑叶，以及山楂的质量比为：(40～60)：(40～60)：(30～50)：(20～30)：(20～30)；

优选的，麦芽，薏苡仁，淡竹叶，桑叶，以及山楂的质量比为：(50～55)：(50～55)：(40～45)：(25～30)：(25～30)；

更优选的，麦芽，薏苡仁，淡竹叶，桑叶，以及山楂的质量比为：54:54:40:27:27。

研究表明，天然植物中草药具有天然、无毒副作用等优势，且含有大量活性物质，兼具药用与营养两种属性，能够提高畜禽健康水平，增强畜禽免疫力。麦芽、薏苡仁、淡竹叶、桑叶和山楂作为中草药添加剂，不仅能确保畜禽机体健康，不产生抗药性，无污染，无残留，同时有着健脾开胃、清热、利尿、促进吸收，提高饲料营养物质利用率和提高机体免疫能力等功能。而将中药原料制剂进行发酵后，能够更为有效的促进其中有效物质的溶出，提高其药效。

然后，将中草药混合物以及碳源、氮源和微量元素混合，得到中药发酵培养基；

其中，碳源物质为：蔗糖；

氮源物质为：蛋白胨，酵母粉，以及可选的麸皮；

微量元素为：磷酸二氢钾和硫酸镁。

中药培养基中，各原料含量如下：中草药(粉碎混合物)80～90％，碳源3～8％，氮源3～15％，无机盐0.2～0.5％；

优选的，中药培养基中，各原料含量如下：中草药80％，麸皮10％，蔗糖5％，蛋白胨2.2％，酵母粉2.5％，磷酸二氢钾0.2％，以及硫酸镁0.1％；

或者，中药培养基中，各原料含量如下：中草药90％，蔗糖5％，蛋白胨2.2％，酵母粉2.5％，磷酸二氢钾0.2％，以及硫酸镁0.1％。

将如上任意配方的各原料混合，即得到中药培养基，无需对于培养基的pH进行调整，中药培养基的含水量在45％～55％。

然后，向中药培养基中依次接入冠突散囊菌(菌液)和鼠李糖乳杆菌(菌液)，进行发酵。

其中，所述冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌均为市售产品，例如：冠突散囊菌(CICC2650，采购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)；鼠李糖乳杆菌(JCI6137，采购自广东省微生物保藏中心)。

冠突散囊菌菌液可以由如下方法得到：将冠突散囊菌菌种接种于改良氯硝胺甘油琼脂培养基(蛋白胨5份，无水葡糖糖10份，磷酸二氢钾1份，硫酸镁0.5份，琼脂15份，甘油180份，pH自然)中，培养7d，超净台中取10ml无菌生理盐水(或无菌水)倒至长有菌落的平板上，用接种环刮取菌落表面的孢子于带有玻璃珠的三角瓶中，200rpm振荡20min，使孢子充分散开，即可得5.0～6.0×10⁷个/ml的孢子悬液；

然后，超净台中，吸取3ml孢子悬液于装有30ml的DG18液体培养基中，28℃摇瓶培养2d。

鼠李糖乳杆菌菌液可以由如下方法得到：以5ml无菌水稀释鼠李糖乳杆菌斜面的菌体，得到对应的菌悬液。

进一步的，冠突散囊菌菌液的接入体积毫升数与中药培养基质量克数比例为：3:(10～50)；优选为3：(20～40)；更优选为3:25；

鼠李糖乳杆菌菌液的接入体积毫升数与中药培养基质量克数比例为：1：(10～50)；优选为1：(20～40)；更优选为1:25。

为了避免不同菌种在发酵过程中的相互影响，本发明中，特别将冠突散囊菌菌液和鼠李糖乳杆菌菌液间隔接入中药培养基中。

优选的，是先在中药发酵培养基中接入冠突散囊菌，然后再接入鼠李糖乳杆菌；

同时，冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌的接入间隔时间为6～48h，优选为24h以上。

进一步的，本发明中，发酵温度优选为28℃，发酵(总)时间优选为5d。

由本发明如上方法发酵所得中药发酵物中，中草药的有效成分释放更为充分，而且，经过发酵后的中药颜色金黄澄亮，且有独特的菌香味，相较于未发酵中药而言，无论是在颜色还是在适口性上，都有明显的提高。

进一步的，还可以将由如上方法得到的发酵中药作为饲料添加剂，而用于对应的饲料中，起到增强禽畜免疫力的功效，以确保禽畜机体健康，且不会产生无污染，无残留，也有益于人体健康。

同时，本发明也可以相应的提供一种包含本发明发酵中药的禽畜饲料，以满足市场上对于无抗添加饲料的需求。

实施例1

按照麦芽54，薏苡仁54，淡竹叶40，桑叶27，山楂27份的比例，分别称取各中药原料；

然后，将各中药原料分别烘干后，进行粉碎，然后混合，得到中药混合物。

按照：中药混合物90％，蔗糖5％，蛋白胨2.2％，酵母粉2.5％，磷酸二氢钾0.2％，以及硫酸镁0.1％的质量比例，分别称取各原料，然后混合，得到中药固体培养基。

将冠突散囊菌菌种接种于改良氯硝胺甘油琼脂培养基(蛋白胨5，无水葡糖糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，琼脂15，甘油180，pH自然)中，培养7d，超净台中取10ml无菌生理盐水(或无菌水)倒至长有菌落的平板上，用接种环轻轻刮取菌落表面的孢子于带有玻璃珠的三角瓶中，200rpm振荡20min，使孢子充分散开，即可得5.0～6.0×10⁷个/ml的孢子悬液；

然后，超净台中，吸取3ml孢子悬液于装有30ml的DG18液体培养基中，28℃摇瓶培养2d，得到冠突散囊菌种子发酵液。

鼠李糖乳杆菌菌液可以由如下方法得到：以5ml无菌水稀释鼠李糖乳杆菌斜面的菌体，得到对应的鼠李糖乳杆菌悬液。

吸取3ml冠突散囊菌种子发酵液，加入25g中药固体培养基中，28℃条件下培养10h后，接入1ml鼠李糖乳杆菌悬液，然后在28℃继续培养，共发酵5d。

实施例2

按照实施例1的方法，进行中药发酵。实施例2与实施例1的区别在于，实施例2中，共发酵8d。

实验例1不同发酵条件下，中药内还原糖、可溶性总糖和总黄酮含量变化

1、样品制备：

将未发酵的中药(中草药组成配比与实施例1相同，作为对照)，以冠突散囊菌单菌发酵的中药(方法与实施例2相同，但仅接入等量冠突散囊菌种子发酵液，作为对照)，实施例1中发酵后的中药，以及实施例2中发酵后的中药，将各组待检测样品烘干后，称取4.00g烘干后的样品于100ml容量瓶中，加50ml蒸馏水浸泡2h后于80℃水浴加热3h，滤液过滤，作为糖含量测定样品；

同时，参照如上处理方法，并分别再次取4.00g烘干后的各组样品，于100ml容量瓶中，加50ml蒸馏水浸泡2h后于80℃水浴加热3h，滤液过滤，作为黄酮含量测定样品。

2、检测方法：

(1)还原糖的检测：

(i)标准曲线的绘制

配置1.0g/L的葡萄糖标准液，在10mL的试管中分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的葡萄糖标准液(每组浓度设二个平行)，用蒸馏水稀释至每支试管总体积为0.5mL，加入1.5ml DNS试剂，混匀后沸水浴5min，冷却后分别向试管中加入4.0ml蒸馏水，混匀后于540nm处测其吸光度。标准曲线：Y＝0.98043X-0.02538，R²＝0.9960。

(ii)样品还原糖的检测

将预处理过的中药滤液用蒸馏水稀释一定倍数，参照步骤(i)中方法测其吸光度，代入标准曲线方程，计算各组中药滤液中还原糖含量。

(2)可溶性总糖的检测(苯酚-硫酸法)

(i)标准曲线的绘制

配置0.1mg/L的葡萄糖标准液，在10mL的试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的葡萄糖标准液(每组浓度设二个平行)，用蒸馏水补充至每支试管总体积为1.0mL，加入1.0ml 6％的苯酚溶液和5.0ml浓硫酸，摇匀冷却，沸水浴显色10min后于490nm处测其吸光度。

(ii)样品可溶性总糖的检测

将预处理过的中药滤液用蒸馏水稀释一定倍数，步骤(i)中方法测其吸光度，代入标准曲线方程，计算各组中药滤液中可溶性总糖含量。

(3)总黄酮的检测(NaNO₂-AI(NO₃)₃-NaOH法)

(i)标准曲线的绘制

配置0.1g/L的芦丁标准液(60％乙醇溶解)，在10mL的试管中分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的芦丁标准液(每组浓度设二个平行)，用30％乙醇补充至每支试管总体积为5.0mL，加入0.3ml 5％的亚硝酸钠，充分混匀放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml，混匀放置6min，加入1M的氢氧化钠溶液2.0ml，用30％的乙醇溶液补充至每支试管总体积为10.0ml，混匀静置15min后于510nm处测其吸光度。

(ii)样品总黄酮的检测

将预处理过的中药滤液用30％乙醇稀释一定倍数，参照步骤(i)中方法测其吸光度，代入标准曲线方程，计算各组中药滤液中总黄酮含量。

3、测定结果：

(1)发酵前后还原糖含量变化情况

中药复合配方固体不同处理发酵前后还原糖含量结果如图1所示(数据均为平均值±标准差(n＝3)，柱形图上标有不同字母表示在0.01水平有显著差异)。

由图1结果可知，当冠突散囊菌单菌发酵时，随着发酵时间的增加，还原糖含量逐渐减少，未发酵、发酵5d和发酵8d三组之间存在极显著差异(P<0.01)；当冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵时，还原糖含量先增加后减少，未发酵、发酵5d和发酵8d三组之间也存在极显著差异(P<0.01)；无论是单菌发酵还是混合菌发酵，发酵时长对中药复合配方中还原糖含量影响较大。

(2)发酵前后可溶性总糖含量变化情况

中药复合配方固体不同处理发酵前后可溶性总糖含量结果见图2(数据均为平均值±标准差(n＝3)，柱形图上标有不同字母表示在0.01水平有显著差异)。

无论是冠突散囊菌单菌发酵还是冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵，随着发酵时间的增加，可溶性总糖含量均逐渐减少，未发酵、发酵5d和发酵8d三组之间存在极显著差异(P<0.01)；说明了冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌在进行固体发酵时，为了维持自身生长代谢，消耗了大量的糖。固体发酵对中药复合配方中可溶性总糖含量影响较大。

(3)发酵前后总黄酮含量变化情况

中药复合配方固体不同处理发酵前后总黄酮含量结果见图3(数据均为平均值±标准差(n＝3)，柱形图上标有不同字母表示在0.01水平有显著差异)。

当冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵时，随着发酵时间的增加，总黄酮含量逐渐增加；当冠突散囊菌单菌发酵时，总黄酮含量先增加后减少，发酵8d后总黄酮下降明显。未发酵、发酵5d和发酵8d三组之间存在极显著差异(P<0.01)。总体可言，发酵时长对中药复合配方中总黄酮含量影响也较大，发酵5d明显效果更优。

实验例2两种菌种接入时间间隔影响实验

配置实施例1中相同的中药发酵培养基，以冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌为益生菌进行混菌发酵，探究两种菌不同接入时间对发酵的影响。两种菌接入的间隔时间分别设为0、24、48h，加上对照，每组设一个平行，发酵5d后自封袋分别收集，-20℃保存备用。(注：冠突散囊菌接入时间早于鼠李糖乳杆菌)

结果发现，如果将冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌同时接入，冠突散囊菌生长收受到抑制，发花较少，鼠李糖乳杆菌有生长，可以闻到乳酸味。间隔时间为24、48h的两组冠突散囊菌生长良好，鼠李糖乳杆菌也有生长。冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌最好不要同时接入，间隔24h以上时间为好。

实验例3不同菌种组合和发酵时间影响实验

配置实施例1中相同的中药发酵培养基，分别接入冠突散囊菌(简记为金)、冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌(简记为乳)、冠突散囊菌+啤酒酵母(简记为酵)、冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌+啤酒酵母，每组设一个平行，发酵5d、8d后60℃烘干，并测其含水量。后续分别测发酵前后还原糖、总糖、总黄酮含量。(注：冠突散囊菌接种10h后才接入鼠李糖乳杆菌和啤酒酵母，各实验组中，相同菌种的原料来源以及接入量均相同；对照组为未接入发酵菌的中药发酵培养基)。

不同实验组中药发酵培养基在发酵后的含水率和pH如下表所示：

发酵后各组中药发酵培养基外观分别如图4-图13所示。

其中，图4为未发酵中药5d后中药发酵培养基示意图，图5为以冠突散囊菌单菌发酵5d后中药发酵培养基示意图，图6为以冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌+啤酒酵母发酵5d后中药发酵培养基示意图，图7为冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌5d后中药发酵培养基示意图，图8为以冠突散囊菌+啤酒酵母发酵5d后中药发酵培养基示意图；

图9为未发酵中药8d后中药发酵培养基示意图，图10为以冠突散囊菌单菌发酵8d后中药发酵培养基示意图，图11为以冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌+啤酒酵母发酵8d后中药发酵培养基示意图，图12为冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌8d后中药发酵培养基示意图，图13为以冠突散囊菌+啤酒酵母发酵8d后中药发酵培养基示意图。

由上述各组培养基含水率、pH以及培养基外观的检测结果可知，从接入益生菌的生长情况、发酵后感官等标准来评价，冠突散囊菌单菌发酵，冠突散囊菌+鼠李糖乳杆菌混菌发酵效果较好，发酵后颜色金黄澄亮，产生独特的菌香味，与未发酵比有明显的差别。

同时，对各组发酵后中药的检测结果可知，发酵后中药的还原糖、总糖的含量有所减少，总黄酮含量增加；

进一步的，发酵5d和8d相比，发酵5d效果更优。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种中药混合菌固体发酵的方法，其特征在于，所述方法包括：

向中药发酵培养基中，分别接入冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌，进行发酵；

所述方法中，首先在中药发酵培养基中接入冠突散囊菌，然后再接入鼠李糖乳杆菌；

冠突散囊菌和鼠李糖乳杆菌的接入间隔时间为24～48h；

发酵的时间为：5d，发酵的温度为：25～30℃；

其中，所述中药发酵培养基中含有中草药固体；

所述中草药由以下组分组成：麦芽，薏苡仁，淡竹叶，桑叶以及山楂，其中,麦芽，薏苡仁，淡竹叶，桑叶，以及山楂的质量比为：（40～60）：（40～60）：（30～50）：（20～30）：（20～30）。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中药发酵培养基主要由中草药，碳源，氮源，以及无机盐混合后灭菌制得。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碳源包括：葡萄糖；

以及/或者，所述氮源包括：麸皮，蛋白胨以及酵母粉中的一种或几种；

以及/或者，所述无机盐包括：磷酸二氢钾以及硫酸镁中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中药发酵培养基中，各原料含量如下：

中草药80～90%，碳源3～8%，氮源3～15%，无机盐0.2～0.5%。

5.由权利要求1-4中任一项所述的方法得到的发酵中药。

6.权利要求5所述的发酵中药在制备动物饲料添加剂中的应用。

7.包含权利要求5所述发酵中药的饲料。