CN111387290B - 一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品及其制备方法 - Google Patents
一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制α‑葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品及其制备方法，特点是将何首乌及葛根超微粉碎，再按一定比例与水、脱脂乳粉和白糖，经搅拌混合均匀、过滤、胶体磨乳化、杀菌、冷却、添加植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂、混匀、灌装、发酵、冷却和后熟工艺，得到一种具有抑制α‑葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性及抗疲劳功能的酸乳制品，优点是能显著提高多酚和黄酮苷元含量且提高小鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和乳酸脱氢酶活性，降低丙二醛及尿素氮含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种酸乳制品，尤其是涉及一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性 的功能性酸乳制品及其制备方法。
背景技术
α-葡萄糖苷酶是淀粉水解酶类的一种，主要作用是通过水解-1,4糖苷键，从淀粉和 有关多糖的非还原端切下葡萄糖。人体对粉、糊精、蔗糖等碳水化合物的吸收利用主要依赖 于小肠刷状缘上该酶的活性。抑制α-葡萄糖苷酶活性，可以减缓葡萄糖的生成和吸收，从 而起到降低血糖的作用。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂对糖尿病和肥胖症具有防作用，开发 对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用的发酵乳制品有十分重要的意义。酪氨酸酶是生物体内合成 黑色素的关键酶，它可通过催化酪氨酸生成黑色素，当酪氨酸酶活性增强时，会引发黄褐 斑、雀斑，甚至黑色素瘤等色素紊乱性疾病，严重危害人类健康。因此，开发对酪氨酸酶活 性具有抑制作用的发酵乳制品可以有效避免色素沉着性疾病的发生。
何首乌系著名滋补强壮中药，有补肝，益肾，养血，祛风之功效，用于肝肾阴亏， 发须早白，血虚头晕，腰膝软弱，筋骨酸痛，遗精，崩带，久疟，久痢，慢性肝炎，痈肿， 肠风，痔疾等症。现代研究表明，何首乌主要含有蒽醌类、多糖等化合物。葛根中含有大量 的异黄酮类药用和保健成分，如葛根素、葛根素木糖甙、金雀异黄素、和大豆甙等，具有降 血脂、降血糖、降血醇、抗衰老、抗癌、抗疲劳、解酒、增强机体免疫力等多种生理功能。 酸奶是采用鲜牛奶加入白糖均质，经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制 品。目前，市面上还没有将何首乌、葛根粉碎后添加到酸奶加工配料中制备得到具有抑制α -葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品的相关产品以及研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能显著提高多酚和黄酮苷元含量且提高小鼠 血清谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和乳酸脱氢酶活性，降低丙二醛及尿素氮含量的 具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品及其制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨 酸酶活性的功能性酸乳制品，将何首乌及葛根超微粉碎，再按一定比例与水、脱脂乳粉、白 糖，经搅拌混合均匀、过滤、胶体磨乳化、杀菌、冷却、添加乳酸菌发酵剂、混匀、灌装、 发酵、冷却和后熟工艺，得到一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性及抗疲劳功能的 酸乳制品。
上述具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品的制备方法，包括以 下步骤：
(1)菌株的活化：在无菌操作条件下，将保藏编号为CGMCC No.15953的植物乳杆菌PDD-1、保藏编号为CGMCC No.8920的嗜酸乳杆菌WZ-D1和嗜热链球菌分别接种于MRS 液体培养基中，分别在35-40℃的培养箱中培养20-28小时；
(2)乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌在无菌操作 条件下，分别按质量浓度1.50-3.0％的接种量接种于在经巴氏杀菌后冷却至37-40℃的纯牛奶 中，在34-40℃保温箱中培养3-6h，制成植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂；
(3)何首乌粉制备：将生何首乌洗净切片，50-60℃烘干，粉碎后，再用超细粉碎机磨成 细粉，过100-150目筛，得到何首乌粉；
(4)葛根粉制备：将生葛根洗净切片，50-60℃烘干，粉碎后，再用超细粉碎机磨成细 粉，过100-150目筛，得到葛根粉；
(5)配料制备：在水中分别加入水质量3.0-6.0％的何首乌粉、3.0-6.0％的葛根粉、10.0- 13.0％的脱脂奶粉和6.0-8.0％的白糖，混合均匀后过滤，再用胶体磨磨3次，得到混合液；
(6)杀菌、冷却、接种：将上述混合液加热到75-90℃，保温10-20分钟后，冷却至38-43℃，在无菌操作的条件下，加入混合液质量1.0-2.0％的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链 球菌发酵剂，搅拌混合均匀；
(7)罐装、发酵：用罐装机罐装至酸奶瓶或塑料杯，封口后，装入塑料框，移入发酵室， 在37-43℃保温发酵3-8小时；
(8)冷却、后熟：将上述发酵结束后的酸奶移入0-4℃的冷库内冷却、后熟即得到具有抑制 α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品。
步骤(1)中所述的MRS液体培养基的配制方法如下：将蛋白胨l0g，牛肉膏l0g， 酵母提取物5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-80lmL， MgSO4·7H2O0.5g，MnSO40.25g，溶于1L蒸馏水，调pH至6.2～6.4，121℃灭菌20min 即可。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种具有抑制α-葡萄糖苷 酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品及其加工方法，将何首乌与葛根超微粉碎，再按一定比 例与水、脱脂乳粉、白糖，经搅拌混合均匀、过滤、胶体磨乳化、杀菌、冷却、添加乳酸菌发酵剂、混匀、灌装、发酵、冷却等工艺，得到一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活 性的功能性酸乳制品,该酸乳制品对α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的抑制率分别提高了59.03-82.28％与62.51-78.58％。在整个发酵过程中，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)能够分泌出β-葡糖糖苷酶等水解酶类，将何首乌和葛根蒽醌 甙、多糖及黄酮等物质进行降解，产生对酪氨酸酶与α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用的降 解产物游离型多酚类物质及黄酮苷元，同时把黄酮苷类物质转化为易被肠道吸收的黄酮苷 元，显著提高了黄酮的生物利用率，与发酵前比较，酸乳中酚类物质和黄酮苷元分别提高了 32.65-80.61％与36.49-92.90％；同时，植物乳杆菌植物亚种、嗜酸乳杆菌及嗜热链球菌分泌 出蛋白分解酶将乳蛋白分解产生对酪氨酸酶与α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用的多肽，制 得的酸乳制品能显著提高小鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD) 和乳酸脱氢酶活性，降低丙二醛(MDA)及尿素氮含量，具有潜在的抗疲劳、调节血糖、抗 衰老、降低胆固醇、免疫调节等功能，为功能性酸奶开发提供一定的思路和启发。上述植物 乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)PDD-1株，于2018年06月19 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。上述嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)，菌株为WZ-D1，保藏号为CGMCC No.8920，于2014年03 月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一、实验测定方法
1、α-葡萄糖苷酶抑制率测定
α-葡萄糖苷酶抑制率的测定参考文献[Kim Y M,et al.A novel alpha-glucosidase inhibitor from pink bark.Carbohydrate Research,2004,339(3):715-717]中方法稍作改动。在600μL 0.05moL/L 磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中分别加入200μLα-葡萄糖苷酶(0.2U/m L)和100μL酸 乳；将混合物于37℃水浴10m in，再加入300μL 20mmol/LPNPG溶液，继续反应5 min；加入1mL 1moL/L Na2CO3作为反应终止液，于405n m处测定其吸光值，计算α- 葡萄糖苷酶抑制率。α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[1-(C-D)/(A-B)]×100；式中，A为含 α-葡萄糖苷酶溶液但不含酸乳的吸光值；B为不含α-葡萄糖苷酶溶液及酸乳的吸光值； C为含有α-葡萄糖苷酶溶液及酸乳的测定吸光值；D为不含α-葡萄糖苷酶溶液含酸乳的测 定吸光值。
2、酪氨酸酶抑制率测定
参照刘杰超等[刘杰超等。苹果多酚提取物对酪氨酸酶的抑制作用。日用化学工业，2013， 43(6)：414-456]的方法稍加修改，取酸乳500μL置于2mL比色管中，分别加入0.175mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH6.8)200μL和5mmol/L L-DOPA 200μL，混匀后 加入蘑菇酪氨酸酶液100μL，35℃保温2min，在475nm的吸光值下测定酶活力。将酪氨 酸酶液换成蒸馏水作空白对照，根据以下公式计算样品提取液对酪氨酸酶的抑制率。酪氨酸 酶抑制率(％)＝[1-(A-B)/C]×100；式中，A为酸乳与L-DOPA试剂反应的吸光值，B为 酸乳与蒸馏水反应的吸光值，C为蒸馏水代替酪氨酸酶与L-DOPA试剂反应的空白组吸光 值。
3、游离黄酮甘元含量的测定
黄酮苷元含量的测定方法采用高效液相色法，将大豆苷(daidzin)、染料木苷
(genistin)、 大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)四种标准品分别配制成
0.001mg/mL、 0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL浓度梯度的混合标准品溶液，
经过 0.45um的微孔滤膜后选择适用的液相色谱条件进行测定，以标准品浓度x(单位mg/
mL) 为横坐标，高效液相色谱法出峰面积y为纵坐标，计算线性回归方程结果如下：
| 标准品 | 线性回归方程 | 相关系数 |
| 大豆苷 | y＝42231x-7.9415 | R<sup>2</sup>＝0.9998 |
| 染料木苷 | y＝67086x-15.12 | R<sup>2</sup>＝0.9998 |
| 大豆苷元 | y＝64485x-14.439 | R<sup>2</sup>＝0.9998 |
| 染料木素 | y＝64862x+77.386 | R<sup>2</sup>＝0.9993 |
游离黄酮甘元含量的测定：按照上述步骤发酵的酸奶，搅拌均匀取1ml发酵好的酸奶样品， 吸取3ml乙酸乙酯与其混合，涡旋30s后，超声10-15min，在转速为6000r，4℃的条件下 离心5min，取乙酸乙酯层(即上层液封)放入超声洗净的玻璃试管中，将试管放在80℃的 水浴锅中水浴至乙酸乙酯(乙酸乙酯的沸点是77℃)挥发完全。取500μL甲醇复溶，过滤膜，选择上述标准曲线同样的色谱条件过高效液相色谱仪。设置不同发酵条件，分别测酸奶中的黄酮苷元的含量。以未发酵前的配料作为阴性对照。以对照组和实验组中分别测得游离 黄酮苷元含量之差作为黄酮苷元转化条件优化的指标。
4、总多酚含量测定
参考《王兴东等，茅台酱香型酒糟中总黄酮及总多酚含量的测定，中国酿造，2015，34 (10)：86-90》，采用Folin-Ciocateu比色法。
5、抗疲劳动物实验及指标测定
选取6-8周龄的清洁健康雄性昆明小鼠140只，体重28-32g，在21-22℃温度下饲养，适 应环境7d后，随机分组，酸乳及发酵前原料分别冷冻干燥后，再用生理盐水溶解(300mg/mL，W/V),设3个剂量组(0.10、0.15、0.20mL/10g体重)及一个对照组，每组 20只，对照组给予等体积生理盐水，每日于同一时间灌胃，持续灌胃30d。动物实验参考 《李品等，拟黑多刺蚁、牡蛎提取物抗疲劳作用研究，广西科学，2019,26(5):583-586》 的方法。小鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶 活性及丙二醛(MDA)和血清尿素氮含量采用试剂盒测定(购自南京建成生物工程研究 所)。
二、具体实施例
实施例1
一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的酸乳制品，其将何首乌与葛根超微粉碎，再 按一定比例与水、脱脂乳粉、白糖，经搅拌混合均匀、过滤、胶体磨乳化、杀菌、冷却、添 加乳酸菌发酵剂、混匀、灌装、发酵、冷却和后熟工艺，其具体制备方法包括以下步骤：
(1)菌株的活化：在无菌操作条件下，将植物乳杆菌(PDD-1，保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953)、嗜酸乳杆菌(WZ-D1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8920)和嗜热链球菌(CGMCC No.1.2471或1.1855、1.1481或1.1864或1.6472或1.2718)分别接种 于MRS液体培养基中，分别在35-37℃的培养箱中培养26-28小时；
(2)乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌在无菌操作 条件下，分别按质量浓度1.50-3.0％的接种量接种于在经巴氏杀菌后冷却至37-40℃的纯牛奶 中，在38-40℃保温箱中培养3-4h，制成植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂；
(3)何首乌粉制备：将生何首乌洗净切片，50-55℃烘干，粉碎后，再用超细粉碎机磨成 细粉，过100目筛，得到何首乌粉；
(4)葛根粉制备：将生葛根洗净切片，50-60℃烘干，粉碎后，再用超细粉碎机磨成细 粉，过100-150目筛，得到葛根粉；
(5)配料制备：按质量比，在水中分别加入4.0％的何首乌粉、4.0％的葛根粉、11.0％的脱 脂奶粉和7.0％的白糖，混合均匀后过滤，再用胶体磨磨3次，得到混合液；
(6)杀菌、冷却、接种：将上述混合液加热到75-80℃，保温20分钟后，冷却至38- 39℃，在无菌操作的条件下，加入混合液质量1.50％的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂，搅拌混合均匀；
(7)罐装、发酵：用罐装机罐装至酸奶瓶或塑料杯，封口后，装入塑料框，移入发酵室， 在38-39℃保温发酵3-4小时；
(8)冷却、后熟：将上述发酵结束后的酸奶移入0-4℃的冷库内冷却、后熟即得具有抑制α -葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的酸乳制品。
实施例2
同实施例1，其区别在于：步骤(1)菌株的活化：在无菌操作条件下，将植物乳杆菌(PDD-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15953)、嗜酸乳杆菌(WZ-D1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏编号为CGMCC No.8920)和嗜热链球菌分别接种于MRS液体培养基中，分别在 38-40℃的培养箱中培养20-24小时；步骤(2)乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的植物乳杆 菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌在无菌操作条件下，分别按一定接种量接种于在经巴氏杀菌后 冷却至37-40℃的纯牛奶中，在34-37℃保温箱中培养5-6h，制成植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌 和嗜热链球菌发酵剂。
实施例3
同实施例1，其区别在于：步骤(3)何首乌粉制备：将生何首乌洗净切片，56-60℃烘干， 粉碎后，再用超细粉碎机磨成细粉过120-150目筛，得到何首乌粉。
实施例4
同实施例1，其区别在于：步骤(5)配料制备：按质量比，在水中分别加入3.0％的何首乌 粉、3.0％的葛根粉、13.0％的脱脂奶粉和8.0％的白糖，混合均匀后过滤，再用胶体磨磨3 次，得到混合液。
实施例5
同实施例1，其区别在于：步骤(5)配料制备：配料制备：按质量比，在水中分别加入6.0％的何首乌粉、6.0％的葛根粉、10.0％的脱脂奶粉和6.0％的白糖，混合均匀后过滤，再用 胶体磨磨3次，得到混合液；步骤(6)杀菌、冷却、接种：将上述混合液加热到85-90℃， 保温10-15分钟后，冷却至40-43℃，在无菌操作的条件下，加入混合液质量1.6-2.0％的植 物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂，搅拌混合均匀。
三、实验结果分析
1、发酵前后总多酚与黄酮苷元含量及α-葡萄糖苷酶与酪氨酸酶抑制率
备注：其中发酵前配料指的是步骤(5)所得混合物。
由上述表1可知，由于在整个发酵过程中，植物乳杆菌能够分泌出β-葡糖糖苷酶等水解酶类，将何首乌和葛根蒽醌甙、多糖及黄酮等物质进行降解，产生对酪氨酸酶与α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用的降解产物游离型多酚类物质及黄酮苷元，植物乳杆菌、嗜酸乳 杆菌及嗜热链球菌将乳蛋白分解产生对酪氨酸酶与α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用的多 肽，两者共同作用，大幅提高了酪氨酸酶与α-葡萄糖苷酶活性抑制率；同时把黄酮苷类物 质转化为易被肠道吸收的黄酮苷元，显著提高了黄酮的生物利用率，与发酵前比较，酸乳中 酚类物质和黄酮苷元分别提高了32.65-80.61％与36.49-92.90％，该酸乳制品对α-葡萄糖苷 酶和酪氨酸酶活性的抑制率分别提高了59.03-82.28％与62.51-78.58％。
2、抗疲劳实验结果
表2小鼠抗疲劳实验结果
由上述表2可知，所得的酸乳制品能显著提高小鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、 超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶活性，降低丙二醛(MDA)及尿素氮含量，具有潜在的 抗疲劳、调节血糖、抗衰老、降低胆固醇、免疫调节等功能。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技 术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范 围。
Claims (3)
1.一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品，其特征在于：将何首乌及葛根超微粉碎，再按一定比例与水、脱脂乳粉、白糖，经搅拌混合均匀、过滤、胶体磨乳化、杀菌、冷却、添加乳酸菌发酵剂、混匀、灌装、发酵、冷却工艺，得到一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性及抗疲劳功能的酸乳制品，所述的乳酸菌为保藏编号为CGMCCNo.15953的植物乳杆菌植物亚种PDD-1、保藏编号为CGMCC No.8920的嗜酸乳杆菌WZ-D1和嗜热链球菌。
2.一种权利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）菌株的活化：在无菌操作条件下，将保藏编号为CGMCC No.15953的植物乳杆菌植物亚种PDD-1、保藏编号为CGMCC No.8920的嗜酸乳杆菌WZ-D1和嗜热链球菌分别接种于MRS液体培养基中，分别在35-40℃的培养箱中培养20-28小时；
（2）乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的植物乳杆菌植物亚种、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌在无菌操作条件下，分别按质量浓度1.50-3.0%的接种量接种于在经巴氏杀菌后冷却至37-40℃的纯牛奶中，在34-40℃保温箱中培养3-6h，制成植物乳杆菌植物亚种、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂；
（3）何首乌粉制备：将生何首乌洗净切片，50-60 ℃烘干，粉碎后，再用超细粉碎机磨成细粉，过100-150目筛，得到何首乌粉；
（4）葛根粉制备：将生葛根洗净切片，50-60 ℃烘干，粉碎后，再用超细粉碎机磨成细粉，过100-150目筛，得到葛根粉；
（5）配料制备：在水中分别加入水质量3.0-6.0%的何首乌粉、3.0-6.0%的葛根粉、10.0-13.0%的脱脂奶粉和6.0-8.0%的白糖，混合均匀后过滤，再用胶体磨磨3次，得到混合液；
（6）杀菌、冷却、接种：将上述混合液加热到75-90℃，保温10-20分钟后，冷却至38-43℃，在无菌操作的条件下，加入混合液质量1.0-2.0%的植物乳杆菌植物亚种、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂，搅拌混合均匀；
（7）罐装、发酵： 用罐装机罐装至酸奶瓶或塑料杯，封口后，装入塑料筐 ，移入发酵室，在37-43℃保温发酵3-8小时；
（8）冷却、后熟：将上述发酵结束后的酸奶移入0-4℃的冷库内冷却、后熟即得到具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品。
3.根据权利要求2所述的一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的功能性酸乳制品的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的MRS 液体培养基的配制方法如下：将蛋白胨l0g，牛肉膏l0g，酵母提取物5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-80lmL，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO40.25g，溶于1L蒸馏水，调pH至6.2～6.4，121℃灭菌20min即可。
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