CN102397183B

CN102397183B - 人参、无患子发酵提取物及其在化妆品方面的应用

Info

Publication number: CN102397183B
Application number: CN 201110247430
Authority: CN
Inventors: 金立华; 郑毅男; 高飞飞; 石景芝; 金玉娇
Original assignee: Hunchun Huarui And Industry Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Hunchun Huarui ginseng biotechnology engineering Limited by Share Ltd
Priority date: 2011-08-24
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2031-08-24
Also published as: CN102397183A

Abstract

本发明涉及人参、无患子发酵提取物及其在化妆品方面的应用。其特征是以人参为原料，添加无患子经过乳酸菌发酵用乙醇等溶剂提取并纯化其提取液应用到化妆品中。本发明制备的发酵人参加工品提取液及其化妆品可用来保湿、美白、抑菌、抗衰老、保护皮肤修护皮肤氧化损伤。因其提取工艺充分利用了人参、无患子发酵提取物的活性物质如稀有人参皂苷Rh₂、CK等，以及发酵无患子等中的有效护肤组作用，提高其人参、无患子发酵提取物化妆品的抗氧化和营养作用。给出了护肤化妆品的具体实施例。同时阐述了人参、无患子发酵加工品与白参比较，含有不同的人参皂苷具有较强的化妆品应用功效。

Description

人参、无患子发酵提取物及其在化妆品方面的应用

技术领域

本发明涉及一种人参、无患子发酵提取物，属于中药技术和化妆品应用领域，同时还涉及人参、无患子发酵提取物的制备方法。

背景技术

人参中含有人参皂苷、人参多糖、蛋白质、聚炔醇、挥发油、氨基酸及其衍生物、多肽、腺苷、维生素、微量元素等多种生物活性成分，具有调节中枢神经系统、改善学习记忆、调节糖代谢、增强机体抗应激能力、延缓衰老、提高机体免疫功能、降血脂、促进性腺激素释放、促进蛋白质的合成、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤及抗肥胖、清除自由基等多种作用。

人参皂苷能延缓神经细胞衰老，人参二醇组皂苷和人参三醇组皂苷能拮抗超氧自由基引起的心肌细胞损伤，保护细胞免受氧化损伤。谷胱甘肽过氧化物酶在体内的主要作用是催化还原型谷胱甘肽变成氧化型谷胱甘肽，并能使有害的过氧化物还原为无害的羟基化合物。王红丽等在口服人参皂苷对小鼠皮肤抗衰老的研究中，得出人参皂苷使D-半乳糖所致的衰老模型小鼠皮肤中SOD活力、羟脯氨酸含量、血中过氧化氢酶(CAT) 、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 活力明显升高，MDA含量显著降低，说明人参皂苷可增强皮肤对抗自由基的能力，减少脂质过氧化产物的堆积。从红参中分离出的人参皂苷Rg3经人肠道菌转化得到主要代谢物人参皂苷Rh2，研究其抗过敏活性，认为人参皂苷Rh2 能抑制IgE 诱导RBL-2H3 细胞和β-氨基己糖苷酶和小鼠被动皮肤过敏反应，作用强于色甘酸钠。人参皂苷Rg1 和Rb1 能提高UVB 照射诱导的HaCaT细胞的存活率并对细胞紫外损伤有保护作用。

程俊霖等在观察人参茎叶总皂苷口服对皮肤的抗衰老作用中发现人参茎叶总皂苷可使衰老小鼠全血中的过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力显著升高，皮肤组织匀浆中超氧化物歧化酶活力显著升高，丙二醛含量降低，口服总皂苷对D-半乳糖所诱导的小鼠皮肤衰老具有拮抗作用。韩国人申请的含有人参花或人参种子提取物的皮肤外用剂组合物专利应用了人参作为化妆品植物原料（专利号：200980122190.1）。

本发明涉及的人参、无患子发酵提取物及其在化妆品方面的应用经检索相关文献未见报道。

发明内容

本发明提供了一种人参、无患子发酵提取物，具有保护皮肤，防止辐射伤害，抗衰老，抗皱纹，抗黑色素产生，增强皮肤免疫力的作用。

本发明还提供了人参、无患子发酵提取物的提取方法，适用于工业化生产，

本发明进一步公开了人参、无患子发酵提取物在制备美容化妆品中的应用。

本发明提供的人参、无患子发酵提取物的制备方法，具体技术方案如下：

取1份脱脂奶粉放入9-12倍量的水中溶解，115-130℃灭菌20-40min，灭菌后放至室温，接入嗜酸乳酸杆菌冻干粉；接菌后放入37℃恒温培养箱中活化10-15h；

取人参切成饮片，40℃-50℃干燥24h-48h，干燥品粉碎，取人参粉末和干燥的无患子果皮粉末，按质量比将人参：无患子=1:1~100:1混合，加入5-10倍量纯净水混悬，100-120℃高温灭菌20min-30min；灭完菌后，放至室温，接入嗜酸乳杆菌；接完菌后放入恒温培养箱中37℃培养10-15天；将发酵完的人参在10-50℃低温通风烘干24-72h烘干；

再加入3~5倍量的0～80％的乙醇水溶液浸泡12～24 h，超声提取3次(60 -100kHz, 330W)每次30-60分钟，或者溶剂分次加入，闪式提取30-60分钟，过滤，合并滤液，溶剂减压回收，滤液浓缩成浸膏。

本发明人参、无患子发酵提取物在制备美容化妆品中的应用，其特征在于是以人参、无患子发酵提取物为主要有效成分制成的。

化妆品基质为日用化妆品基质所需要的材料，包括所用到的表面活性剂油性成分，该提取物加入到化妆品中能起到保湿、抗皱纹、修复皮肤紫外线损伤的作用。

人参、无患子发酵提取物可以制备的人参化妆品类型灵活，用于护肤润肤（包括全身的皮肤），化妆品类型不限，包括乳液、化妆水、润肤膏、平衡液、保湿霜、营养液、营养霜、日霜、晚霜、眼霜、按摩霜、精华素、洗面奶、洗发水、润发精华、洗浴精华素等。

本发明人参、无患子发酵提取物美容乳液的制备方法，其特征在于：

乳液的制备包括去离子水3-12%、甘油0.1-10%、螯合剂0.001-1%、色料0.001-1%，60-70℃加热溶解，油相60-75℃加热溶解，加入表面活性剂，和人参、无患子发酵提取物0.01-2%，防腐剂0.01-0.5%和香料0.001-0.1% ，55-75℃加热溶解；水相和油相混合乳化，余量加水补足，60-70℃，搅拌混合，用乳化机处理，脱气，过滤，冷却，贮存，灌装既得发酵人参、无患子乳液。

在本发明的人参、无患子发酵提取物中，大量抗氧化物质是化妆品应用中的有效物质，对皮肤具有抗衰老作用，能使皮肤保持细嫩，其次发酵后的人参提取物能够为细胞生长提供完好的营养物质。人参、无患子发酵提取物可用于日常的皮肤护理和抗衰老的皮肤护理，经过发酵所得的小分子物质是促进皮肤细胞生长的营养物质。人参、无患子发酵提取物在人参的基础上因为发酵而使其中的抗氧化物质增加，从而抑制细胞氧化，保护皮肤，尤其对眼部等皮肤细嫩部分能起到很好的保护作用修复已经受损的皮肤细胞防止皮肤过早老化。本发明人参、无患子发酵加工品，提取其中有效物质，使其具有保持皮肤光滑细嫩，保水性能强，促进皮肤较好吸收，适合化妆品应用。

人参、无患子发酵加工品中含有比白参、红参更多的稀有人参皂苷，经过发酵产生不同于人参的活性物质。其中的人参皂苷（Rg1，Re， Rh1， Rb1， Rc， Rb2，Rd，Rh2，20(S)-， 20(R)-Rg3) 含量发生变化。人参经过与无患子混合发酵加工其中的人参皂苷Rg1、Re、Rb2、Rd转化为人参皂苷Rg3、Rh2、Rh1，在嗜酸乳杆菌发酵下，人参中的糖、蛋白质、多肽等物质进一步水解为更容易被人体吸收的小分子物质。

人参、无患子发酵提取物中的大量抗氧化物质是化妆品应用中的有效物质，对皮肤具有抗衰老作用，能使皮肤保持细嫩，其次发酵后的人参提取物能够为细胞生长提供完好的营养物质。人参、无患子发酵提取物可用于日常的皮肤护理和抗衰老的皮肤护理，经过发酵所得的小分子物质是促进皮肤细胞生长的营养物质。人参、无患子发酵提取物在人参的基础上因为发酵而使其中的抗氧化物质增加，从而抑制细胞氧化，保护皮肤，尤其对眼部等皮肤细嫩部分能起到很好的保护作用修复已经受损的皮肤细胞防止皮肤过早老化。本发明人参、无患子发酵加工品，提取其中有效物质，使其具有保持皮肤光滑细嫩，保水性能强，促进皮肤较好吸收，适合化妆品应用。

本发明在人参中加入一定量的无患子发酵，使得发酵提取物中既含有人参的有效成分又有无患子的有效成分。人参经过此发酵处理之后有效护肤作用增加，其提取物有抗氧化、保湿、抗酪氨酸酶等作用，应用在化妆品中具有抗衰老、保湿皮肤细嫩、美白的作用。同时该人参、无患子发酵提取物具有无患子的抑菌作用和天然表面活性剂的作用可以在化妆品的制备中起到增溶的作用。

本发明的积极效果在于：在人参中加入无患子发酵，使得发酵提取物中既含有人参的有效成分又有无患子的有效成分。人参经过此发酵处理之后有效护肤作用增加，其提取物有抗氧化、保湿、抗酪氨酸酶等作用，应用在化妆品中具有抗衰老、保湿皮肤细嫩、美白的作用。同时该人参、无患子发酵提取物具有无患子的抑菌作用和天然表面活性剂的作用可以在化妆品的制备中起到增溶的作用。

附图说明

图1：为常规人参皂苷标准品高效液相色谱图（Rg1、Re、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rd）；

图1.1为人参皂苷标准品高效液相色谱图（Rh1、S-Rg3、R-Rg₃、Rh2、C-K、PPT）；

图2：白参提取物高效液相色谱图；

图3：本发明发酵提取物高效液相色谱图；

图4：本发明发酵提取物中常春藤皂苷元的含量测定的HPLC图；

图5：常春藤皂苷元对照品HPLC图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

人参、无患子发酵提取物的制备

1、取1g脱脂奶粉加入8ml水中溶解，置试管中，在115℃灭菌器中灭菌20min，灭菌后放至室温，在超净工作台中接入嗜酸乳杆菌冻干粉。接完菌后放入37℃恒温培养箱中活化10h。

2、取人参切成饮片100克，放入烘箱中40℃干燥24h，粉碎，取人参粉末和干燥的无患子果皮粉末（人参：无患子=5:1质量比）混合物，加入5倍量纯净水混悬，放入容器中，120℃高温灭菌30min。灭完菌后，放至室温，在超净工作台中接入嗜酸乳杆菌溶液1ml（约109个细胞）。接完菌后放入恒温培养箱中37℃培养10天。发酵完的人参在50℃低温通风烘干36h，烘干，得到35.5克。

3、将人参、无患子发酵加工品粉碎成粗粉100g加入300ml 70%的乙醇，浸泡12 h，超声提取3次(60 kHz, 330W)，每次60分钟，过滤，合并滤液，溶剂减压回收，滤液浓缩干燥，得人参、无患子发酵提取物17.20g。

实施例 2

人参、无患子发酵提取物的制备

1、取1g脱脂奶粉放入9ml水中溶解，制成两份放入试管中，在115℃灭菌器中灭菌20min，灭菌后放至室温，在超净工作台中分别接入嗜酸乳杆菌冻干粉。接完菌后放入37℃恒温培养箱中活化15h。

2、取人参切成饮片100克，放入烘箱中40℃干燥24h，粉碎，取人参粉末和干燥的无患子果皮粉末（人参：无患子=5:1质量比）混合物，取人参粉末和干燥的无患子果皮粉末（人参：无患子=50:1质量比）放入烘箱中40℃干燥24h，粉碎，嗜酸乳杆菌，加入7倍量纯净水混悬，放入容器中，115℃高温灭菌20min。灭完菌后，放至室温，在超净工作台中分别接入嗜酸乳杆菌。接完菌后放入恒温培养箱中37℃培养10天。发酵后在50℃低温通风烘干48h，得到人参、无患子发酵加工品38.5g。

3、人参、无患子发酵加工品10克加入30毫升的80％的乙醇水溶液，浸泡12h，超声提取3次(60 kHz, 330W)，每次60分钟，过滤，合并滤液，溶剂减压回收，滤液浓缩干燥，即为人参、无患子发酵提取物1.252g。

实施例 3

人参、无患子发酵提取物的制备

取1g脱脂奶粉放入10ml水中溶解，放入试管中，在120℃灭菌器中灭菌20min，灭菌后放至室温，在超净工作台中接入嗜酸乳杆菌冻干粉。接完菌后放入37℃恒温培养箱中活化10h。

取鲜人参切成饮片100g，放入烘箱中40℃干燥48h，粉碎，取人参粉末与无患子果皮粉末以50:1的质量比加入，加入10倍量纯净水混悬，放入容器中，120℃高温灭菌30min。灭完菌后，放至室温，在超净工作台中接入嗜酸乳杆菌溶液1ml（约109个细胞）。接完菌后放入恒温培养箱中37℃培养12天。发酵完的人参、无患子在50℃低温通风直至烘干，得到人参、无患子发酵产品 40.5g。

将人参、无患子发酵加工品粉碎成粗粉称取10g用30毫升的80％的乙醇水溶液，浸泡12 h，再分次加入2倍量的80%的乙醇，闪式提取3次(330W)，每次30分钟，过滤，合并滤液，溶剂减压回收，滤液浓缩干燥即为人参、无患子发酵提取物1.576g。

实施例 4

人参、无患子发酵提取物的制备

取鲜人参切成饮片100g，放入烘箱中40℃干燥48h，粉碎，取人参、无患子（80:1）粉碎混合，加入10倍量纯净水混悬，放入容器中，120℃高温灭菌30min。灭菌后，放至室温，在超净工作台中接入嗜酸乳杆菌溶液1ml（约109个细胞）。接完菌后放入恒温培养箱中37℃培养12天。发酵完的人参、无患子在50℃低温通风，直至烘干得到 40.2g。

将人参、无患子发酵加工品粉碎成粗粉10g用3倍量的80％的乙醇水溶液，浸泡12 h，再分次加入2倍量的80%的乙醇，闪式提取3次(330W)，每次30分钟，过滤，合并滤液，溶剂减压回收，滤液浓缩成浸膏即为人参、无患子发酵提取物12.3g。

实施例5

人参、无患子发酵加工品雪花膏的制备

将保湿剂丙二醇5.0g、三乙醇胺0.4g 加到精制水中在70℃加热溶解，将油分硬脂酸8.0g ，硬脂醇4.0g、硬脂酸丁酯6.0g溶解后，加入表面活性剂单硬脂酸甘油酯2.0g、防腐剂、抗氧化剂维生素E 各0.05g人参、无患子发酵提取物0.5g，去离子水补足量到100g，即为发酵人参、无患子雪花膏。

实施例 6

人参、无患子发酵加工品营养霜的制备

将保湿剂1.3-丁二醇6.0g 、PEG1500 4.0g加入到10g的去离子水中溶解，在70℃加热调整，在油分硬脂醇5.0g、硬脂酸2.0g、加氢羊毛脂4.0g、 2-辛基十二烷醇10.g溶解后，加入表面活性剂POE（25）1.0g、鲸蜡醇醚3.0g、单硬脂酸甘油酯2.0g、防腐剂尼泊金乙酯0.1g、抗氧化剂维生素C 0.5g，人参、无患子发酵提取物1g，余量加水补足到100g，在70℃下水浴加热溶解混合，将此加入到水相中，使用均质搅拌机将乳化粒子均一，脱气，过滤，冷却。既得人参、无患子发酵加工品营养霜。

实施例 7

发酵人参、无患子眼霜的制备

将保湿剂二丙二醇5.0g，甘油5.0g，三乙醇胺1.0g加入到10g的量的去离子水中，在70℃调整，油分包括鲸蜡醇5.0g，硬脂酸3.0g，凡士林5.0g，鱼鲨烷10.0g，甘油三-2-乙基己酸酯7.0g 加热溶解后，加入表面活性剂丙二醇单硬脂酸酯3.0g，POE（20）2g、鲸蜡醇醚3.0g，防腐剂尼泊金乙酯0.1g，实施例1中的人参、无患子发酵提取物1g，加水补足100g。将此加入上述水相中进行预乳化，再使用均质搅拌机将乳化粒子均一，脱气，过滤，冷却。既得发酵人参、无患子眼霜。

实施例 8

发酵人参、无患子乳液的制备

将二丙二醇5.0g、PEG1500 3.0g、三乙醇胺1.0g加入到精制水75g中，在70℃加热调整。将硬脂酸2.0g，凡士林4.0g，二甲基聚硅氧烷2.0g，甘油三-2-乙基己酸酯2.0g在70℃下溶解后，将失水山梨醇单油酸酯2.0g，实施例1中所得的人参、无患子发酵提取物0.1g，芦荟提取物1g，防腐剂0.05g和香料0.001g加入到油分中，在70℃下加热调整，将油相加入到水相中，加水补足100g，进行预乳化。在均质搅拌机中将乳化离子均一后，脱气，过滤冷却，既得发酵人参、无患子乳液。

实施例 9

发酵人参、无患子营养洗面奶的制备

将保湿剂丙二醇5.0g、氢氧化钾0.1g 加入到10g的去离子水中溶解，在70℃溶解混匀，油分硬脂酸2.0g、鲸蜡醇3.0g、凡士林10g、液体石蜡38g、肉豆蔻酸异丙酯10.0g 加热溶解后，加入表面活性剂单硬脂酸甘油酯2.5g、POE（20）失水山梨醇单硬脂酸甘油酯2.5g 防腐剂尼泊金乙酯0.1g、维生素C 0.05g、人参、无患子发酵提取物0.5g和香精0.001g在70℃加热混合，加水补足100g，将此缓慢加入到调整好的水相中，进行预乳化，在均质搅拌机中将乳化离子均一后，脱气，过滤冷却，既得发酵人参、无患子营养洗面奶。

实施例 10

人参、无患子发酵提取物制备的补水保湿凝胶

将水溶性高分子聚丙烯酸0.4g和甲基纤维素0.2g均一地溶解在10g的去离子水中后，加入8.0g 的PEG1500，将表面活性剂POE(15)油醇醚1.0g加入到7.0g的二丙二醇中，在50℃下加热溶解，加入防腐剂尼泊金酯0.1g、香料0.05g、人参、无患子发酵提取物0.5g。将上述调整好的水相在搅拌下慢慢加入到此相中，最后0.1g三乙醇胺溶解在40g水中，加入其中，加水补足100g，充分搅拌均一，使中和完全。既得含有发酵人参、无患子的补水保湿凝胶。

实施例11

发酵人参、无患子保湿乳液的制备

将水相L-谷氨酸钠1.6g，L-丝氨酸0.4g，人参、无患子发酵提取物0.5g，去离子水12g在50℃加热溶解后为水相（1），搅拌下逐渐加入到同样50℃加热的表面活性剂中，组成乳化组合物，将油相液体石蜡30.0g、微晶蜡2.0g、凡士林5.0g在70℃下加热溶解后，再向其中加入乳化组合物，均一分散，随后将水相（2）丙二醇3.0g和去离子水57.0g在70℃加热后，也加入上述的分散液中，一面充分搅拌一面添加，使用均质搅拌机将其均一乳化后，脱气，过滤，冷却至30℃，既得发酵人参、无患子保湿乳液。

实施例12

发酵人参、无患子透明化妆水的制备

将1，3-丁二醇 6.0g，乳酸1g，在室温下溶解于去离子水中87.18g作为水相。将甘油4.0g ，对羟基苯甲酸甲酯0.1g，防腐剂0.001g，聚氧乙烯油醇醚0.5g，香叶醇0.01g，实施例2中的人参、无患子发酵提取物0.2g加热溶解，再加入到水相中混合增溶。最后加入许可色素0.01g调色，过滤，装瓶。既得人参、无患子发酵加工品透明化妆水。

实施例13

发酵人参、无患子滋润凝胶面膜的制备

将乳酸0.1g，L-谷氨酸0.1g，聚乙二醇（300）1.0g，3-丁二醇4.0g，人参、无患子发酵提取物0.5g加入去离子水73.7g，加热到75℃，再加入增粘剂羧甲基纤维素5.0g、成膜剂聚乙烯醇15.0g，搅拌溶解。将尼泊金类0.1g和表面活性剂POE油醇醚0.5g加到乙醇中，溶解后，加入到上述的水相中，进行增溶，脱气，过滤冷却，即得凝胶状揭离开式面膜。

实施例14

发酵人参、无患子香皂的配方

月桂酸单甘油酯硫酸钠盐 54.0%月桂基硫酸钠盐10.0%肥皂30.0%鲸蜡醇4.0%二氧化钛1.0%香料0.3%，人参、无患子发酵提取物0.1%，染料0.1%抗氧化剂维生素C0.1%。

实施例15

发酵人参、无患子护手霜的配方

去离子水55.0 g ，甘油20.0g，尿素2.0g， POE（60）2.3g，异硬脂酸甘油酯2.5g，硬脂酸单甘油酯1.5g，鲸蜡醇4.0g，凡士林2.0g，液体石蜡10.0g，维生素E乙酸酯0.1g，维生素D0.1g，人参、无患子发酵提取物0.5g。

通过以下实验表明本发明提取物的有效作用

实验例1

人参皂苷含量测定

为进一步说明本发明的人参、无患子发酵提取物的活性成分，下面提供人参、无患子发酵提取物中人参皂苷含量测定。

1.实验仪器及材料

色谱柱：大连依利特 C18 柱 (150 mm ×6.0 mm, 5μm)；电子天平； EYEL 4旋转蒸发仪：(日本东京理化公司)；高效液相色谱仪：岛津2010系列高效液相色谱仪。甲醇：分析纯，北京化工厂；纯水（杭州哇哈哈公司）；甲醇、乙睛（色谱纯）：美国Tedia。人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh1、S-Rg3、R-Rg3、Rh2、C-K、PPT标准品(实验室自，HPLC检测纯度≥98%)。人参、无患子发酵提取物采用实施例1中方法加工而成。

2. 标准品溶液的配制

标准品分别配制成1.00mg/ml的溶液。

3. 提取方法

将实施例1中人参、无患子发酵提取物粉碎，精确称取1g放入超声提取器中加入50ml分析甲醇，40℃水浴加热提取3h。完成以后将甲醇减压旋转蒸发回收，干物质用色谱甲醇定容于25ml，取样过0.22μm滤膜，待HPLC测定。

将同时制作发酵加工品用的同一批次白参提取物，放入烘箱中40℃干燥24小时，过100目筛用同上的方法处理制成白参提取物样品，待HPLC测定。

4. HPLC分析条件的建立：柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：203nm；流动相：乙腈和水，梯度洗脱条件见表1。

表1梯度洗脱条件

时间/min	乙腈(A)/%	水（B）/%
			0	19	81
25	20	80
			35	31	69
60	40	60
			90	80	20
120	100	0

5. 人参、无患子发酵提取物人参皂苷HPLC-UV分析

分别将标准品溶液稀释至1.000 mg/ml、0.500mg/m、l0.250mg/ml、0.1mg/ml、0.050mg/ml、0.010mg/ml。分别按照液相分析条件分析，以浓度为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y，线性回归得标准曲线。

将配制好的样品溶液分别按照分析条件进针20μl，计算各峰面积，用标准曲线计算出样品中各物质含量。

6. 实验结果

分析结果见表2，图1、图1.1、图2和图3分别为人参皂苷对照品液相色谱图、白参提取物液相色谱图以及人参、无患子发酵提取物液相色谱图。

表2人参皂苷分析结果（%，质量百分比）

人参皂苷	本发明提取物	白参提取物
			Rg1	N.D.	1.07
Re	N.D.	0.95
			Rg2	N.D.	0.12
Rb1	N.D.	1.29
			Rc	N.D.	1.35
Rb2	N.D.	0.85
			Rd	N.D.	0.45
S-Rg3	1.70	0.00
			R-Rg3	1.70	0.00
Rh2	0.18	0.00
			PPT	0.04	0.00
C-K	N.D.	0.00
			Rh1	N.D.	0.00

注：N.D.为未检测到。

人参、无患子发酵提取物中人参皂苷与白参提取物中皂苷含量组成不同，从表2可以发现人参、无患子发酵提取物中稀有人参皂苷比普通白参提取物多。这说明采用发酵处理有利于人参中稀有人参皂苷的产生。

实验例2

常春藤皂苷元含量测定

1.样品溶液的制备

人参、无患子发酵提取物按照实施例2制备，取2克用50 毫升乙醇超声3次，每次30分钟，过滤，合并滤液，浓缩。用甲醇定容到10毫升的容量瓶中。

对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的常春藤皂苷元对照品适量, 加甲醇制成1mg/ml 的对照品溶液, 即得。供试样品液过0.45微米孔径的滤膜，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20微升用液相色谱仪，测定。

2. 色谱条件

Agilent 1100 高效液相色谱仪器美国 Agilent公司，大连依利特Hypersil ODS2 色谱柱（150mm ×4.6mm，5）柱温：35℃；检测波长210nm；流动相：乙腈-水；流速：1.0 ml/min.

梯度洗脱如下：

表3常春藤皂苷元测定梯度洗脱条件

时间/min	乙腈(A)/%	水（B）/%
			0	20	80
30	65	35
			60	100	0
100	100	0

结果：图4、图5分别为人参、无患子发酵提取物液相色谱图和常春藤皂苷元液相色谱图。该人参、无患子发酵提取物中常春藤皂苷元的含量为0.16%。

实验例3

人参、无患子发酵提取物保湿效果测定

1实验仪器及材料

按实施例1中的方法制备人参、无患子发酵提取物。白参按实施例1中同样方法制备白参提取物，按照实施例6 制备白参霜剂和人参、无患子发酵霜剂和白参提取物霜剂；猪皮由市场购买，处理均匀平整。

试剂：纯水（杭州哇哈哈公司）；硫酸铵(北京化工厂)，醋酸钾(北京化工厂)等

仪器：真空干燥器；干燥器；分析天平，BP211D；湿度计；皮肤水分测试仪（SK-8866U中西仪器）；玻璃板。

2实验方法

2.1保湿效果体外测定方法

根据文献报道选用硫酸铵和醋酸钾的饱和溶液来控制湿度，空气湿度分别为RH81 和RH60 。为了更好地模拟皮肤的实际情况，选用适当大小的猪皮，样品用量大约2mg/cm2 。将白参提取物霜剂和人参、无患子发酵提取物霜剂分别涂敷在猪皮上，放进干燥器一定时间后称重，计算保湿率。

计算：保湿率g=M2/M1×100

M2一放置后水分重量

M1一放置前水分重量

2.2人体保湿效果测定方法

发酵人参、无患子霜剂的保湿性能：选择左右前臂内侧作为测试区域。试验前受试者需要统一地用温和清洁剂清洗前臂屈侧，并在左右前臂上划出5 *5cm 大小的位置对称的正方形实验区域，将各实验区域编号，以左臂作为涂抹保湿品的测试区域，右臂相应的对称区域为空白对照。测试者在恒定环境中静坐30 min，然后用皮肤水分测试仪检测每个试验部位，分别重复5次，得出其平均值；然后将各保湿剂的溶液按顺序轻轻涂于各试验区域，涂抹要均匀。各区域试验样品为0.03 g，在涂抹后30 min、60min、和120 min在这些部位再次分别检测，每个时间段每个测试区域各检测5次，并求出该时段5次的平均值。室内温度为22℃ ～24℃，湿度为50g～60%的实验室内进行。

3结果

表4人参、无患子发酵提取物保湿作用

人参、无患子发酵提取物的保湿效果高于白参提取物和空白对照组。保湿能力，体外和体内测试，结果一致。相同浓度的原料提取物相同的提取方法加入到相同的化妆品基质中，保湿能力大小按以下顺序：人参、无患子发酵提取物>白参提取物>空白组。由于发酵过程使得人参、无患子发酵提取物中的活性物质增加，其中具有保湿能力的物质的也随之增加，从而使人参、无患子发酵提取物的保湿能力强于白参。

人参、无患子发酵提取物具有的保湿效果，应用在化妆品中能增加其对皮肤的保湿性能，从而保护皮肤光滑细嫩。

实验例4

人参、无患子发酵提取物的酪氨酸酶的抑制作用

酪氨酸酶 (Tyrosinase) 是皮肤黑色素生物合成的关键酶。在黑色素形成过程中，酪氨酸酶是一主要限速酶。该酶活性决定着黑色素形成的数量。如果酪氨酸酶活性受到抑制，黑色素的生成量减少，从而起到美白的作用。

依据抑制机理，可将该类化合物分为2类。① 酪氨酸酶的破坏型抑制(即破坏酪氨酸酶的活性部位)直接对酪氨酸酶进行修饰、改性，使之失去对黑色素前体-酪氨酸的作用，从而达到抑制黑色素形成的目的；② 酪氨酸酶的非破坏型抑制，指不对酪氨酸酶本身进行修饰、改性，通过抑制酪氨酸酶的合成或取代酪氨酸酶的作用底物，从而达到抑制黑色素形成的目的。

1实验材料

实验试剂：双重蒸馏水：自制；乙醇（分析纯）：北京化学试剂厂。多巴、熊果苷对照品购买自广东齐云生物技术公司；马铃薯：市场购买新鲜马铃薯；磷酸缓冲盐：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。人参、无患子发酵提取物：用实施例1中方法加工而成。

2 实验方法

2.1 溶液的配制

0. 10 mol/L缓冲溶液(pH值7. 2) ：50 ml 0. 20 mol/L Na2 HPO4 + 20 ml 0. 1 mol/L HCl，定容至200 ml；

0. 10 mol/L缓冲溶液(pH值6. 0) ：50 ml 0. 20 mol/LNa2HPO4 + 9 ml 0. 1 mol/L HCl，定容至200 ml；

0. 010 mol/L多巴(二羟基苯丙胺酸)溶液：称取0. 198g多巴，用pH值6.0的磷酸缓冲溶液溶解并定容至100 ml。

人参、无患子发酵提取物的制备

精确称取0.2 g 人参、无患子发酵提取物，然后以pH 6.0的磷酸缓冲液将浓缩液定容至10 mL，则提取物浓度为20.0 mg/mL。

酪氨酸酶液的制备

将洗净的土豆预冷，去皮，切碎。在预冷的研钵中放入15 g马铃薯，加入预冷的7.5 mL pH7.2的磷酸缓冲液，研磨匀浆。用两层纱布滤出提取物，立即于3000 r/min 离心5 min。取上清液用pH 7.2的磷酸缓冲液定容至100 mL，2 h 内用完。

2.4 酪氨酸酶活性抑制率的测定

在酪氨酸酶反应生成黑色素的过程中，酪氨酸酶的催化作用主要发生在酪氨酸转化为多巴以及多巴转化为多巴醌这两个反应中。多巴醌是一有色物质，可以用分光光度计(475 nm)测定。准确吸取人参提取物溶液和pH 6.0 的磷酸缓冲液和0.010 mol/L 多巴溶液，在10 mL 比色管中充分混合，于30 ℃水浴孵育 10 min 后，加入酪氨酸酶液混匀，迅速转移到比色皿中，在475 nm 处测第10 min 的吸光度，见表5。以pH=6.0 的磷酸缓冲液为参比。每个样品做3个浓度，每个浓度做3次平行。

表5 反应液的组成

反应液成分	A	B	C	D
					待测样品液/mL	——	——	1	1
pH=6.0 的磷酸缓冲液/mL	3.5	4	2.5	3
					0.010mol/L 多巴溶液/mL	1	1	1	1
酪氨酸酶液/mL	0.5	——	0.5	——
					总体积/mL	5	5	5	5

用公式计算酪氨酸酶活性的抑制率。

抑制率(I g) =(ODA - ODB) - (ODC - ODD)/(ODA -ODB)×100g

A：有底物但没有测试物时的吸光度； B ：既无底物也无测试物的吸光度；C：同时有测试物和底物的吸光度；D:有测试物但没有底物的吸光度。

表6人参、无患子发酵提取物对酪氨酸酶抑制活性的实验结果

样品抑制率（g）	4mg/ml	2mg/ml	1mg/ml	IC50(mg/ml)
					本发明提取物	30.7	21.6	9.2	7.6
鲜参提取物	32.1	15.9	8.2	7.9

熊果苷对抑制酪氨酸酶IC50(mg/ml)为0.32 mg/ml

本实验使用的是土豆粗提液，与酪氨酸酶的进口试剂或土豆酪氨酸酶的精制品比较, 经济简便了许多。至于土豆中的其它干扰物质及提取物中的其他干扰物质，则采取了把B组和D组设置为背景组来消除干扰。方法参考徐鹏、付邵平等关于马铃薯酪氨酸酶体外筛选美白剂测定体系的建立中的方法。

人参、无患子发酵提取物对酪氨酸酶有抑制作用，可以抑制黑色素的生成，在化妆品应用中起到美白作用。

实验例5

人参、无患子发酵提取物的抗氧化作用

1实验材料

无患子（Sapindu Mukurossi Gaertn）与人参按比例混合，按照实施例1方法发酵加工并提取得到人参、无患子发酵提取物。

常春藤皂苷元为本实验室分离得到。

2实验方法

2.1试剂溶液的配制

DPPH·溶液：浓度为1.3×10^-4mol/L。HCl 溶液： 10mmol/L。邻苯三酚溶液： 30mmol/L。

Tris-HCl缓冲溶液pH8.2：甲基紫溶液：取甲基紫0.0394g用水溶解并定容于100mL容量瓶中，摇匀，浓度为1mmol/mL，避光保存。H₂SO₄溶液： 1mol/L。FeSO₄溶液：浓度为1mol/L。H₂O₂溶液：浓度为1mol/L，避光保存。亚硝酸钠溶液：取250.0mg于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，用水定容于500mL容量瓶中作为母液，避光保存，临用前，吸取1mL母液置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，待用，浓度为5.9×10-5mol/L。柠檬酸-磷酸缓冲溶液PH3.0；对氨基苯磺酸溶液：取1.0g无水对氨基苯磺酸，溶于70mL沸水中，冷却至室温，加入30mL冰乙酸混匀，置棕色瓶中室温保存。盐酸萘乙二胺溶液：取0.19g盐酸萘乙二胺，用60g冰乙酸溶解并定容于100mL容量瓶中，置棕色瓶中，4℃冰箱保存，一周内稳定。

2.2样品溶液的制备

称取总提取物配制成浓度依次为0.08mg/mL、 0.16 mg/mL、0.32 mg/mL、0.64mg/mL、1.28 mg/mL的待测液。

分别称取人参、无患子发酵提取物和常春藤皂苷元以及阳性对照品(维生素C)用无水乙醇溶解，配制成一定浓度的样品溶液，依次稀释，得到5个浓度待用。

2.3 最大吸收波长的选择

2.3.1 DPPH·溶液最大吸收波长的选择

将DPPH·溶液与水混合，用无水乙醇与水混合溶液作空白对照，进行全波长扫描，在523nm处有最大吸收，故采用523nm为提取物溶液的测定波长。

2.3.2 邻苯三酚自氧化法最大吸收波长的选择

向2.7mL、pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液中加入0.1mL蒸馏水，于25℃恒温水浴10min后，加入25℃预热的邻苯三酚溶液0.2mL，迅速混匀，以2.7mL、pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液加入0.1mL蒸馏水和0.2 mL浓度为10mmol/L 的HCl溶液为空白，进行全波长扫描，在319nm处有吸收，故采用319nm为测定波长。

2.3.3 Fenton体系法最大吸收波长的选择

取25mL蒸馏水，加入0.5mL甲基紫溶液，用H₂SO₄溶液调pH值3.5，一边搅拌一边加入0.5mL H2O2溶液和0.5mL FeSO₄溶液，反应20min，以水为空白，进行全波长扫描，在584.5nm有吸收，故选用584.5nm为测定波长。

2.3.4格里斯试剂比色法最大吸收波长的选择

取蒸馏水0.3 mL，加入pH值3.0的缓冲溶液0.9 mL，NaNO₂溶液0.3 mL，混匀后于37℃恒温水浴中保温30min，加入对氨基苯磺酸0.3 mL，混匀，静置5min，加入0.3 mL盐酸萘乙二胺0.3 mL，静置15min，转移至比色皿中，以蒸馏水为空白，进行全波长扫描，在549nm处有最大吸收，故采用549nm为测定波长。

2.4 样品测定

2.4.1 对DPPH·清除活性的测定

总提取物溶液按表7加入反应液，摇匀后于室温避光静置30min，转移至比色皿内测吸光度值。

表7提取物样品溶液加样表

A	1 mL水+1mL DPPH·溶液
		B	1 mL样品溶液+1 mL DPPH·溶液
C	1 mL样品溶液+1 mL 无水乙醇

每组做三个平行，按照抗氧化能力（清除自由基能力）公式SA%=[A-（B-C）]/A×100%计算各样品对DPPH·的清除率。

2.4.2对O2–·清除活性的测定

向2.7mL、pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液中加入0.1mL蒸馏水，于25℃恒温水浴10min后，加入25℃预热的邻苯三酚溶液0.2mL，迅速混匀，测定吸光度，记为A。向2.7mL、pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液中加入0.1mL不同浓度的样品溶液，于25℃恒温水浴10min后，加入25℃预热的邻苯三酚溶液0.2mL，迅速混匀，测定吸光度，记为B。向2.7mL、pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液中加入0.1mL不同浓度的样品溶液，于25℃恒温水浴10min后，加入25℃预热的10mmol/L 的HCl溶液0.2mL，记为C。每组做三个平行，按照公式SA%=[A-（B-C）]/A×100%计算各样品对O^2–· 的清除率。

2.4.3对·OH清除活性的测定

取25mL蒸馏水，加入0.5mL甲基紫溶液，用H₂SO₄溶液调pH值3.5，测定吸光度，记为A。取25mL蒸馏水，加入0.5mL甲基紫溶液，用H2SO4溶液调pH值3.5，一边搅拌一边加入0.5mL H₂O₂溶液和0.5mL FeSO₄溶液，反应20min，测定吸光度，记为B。取25mL蒸馏水，加入0.5mL甲基紫溶液，用H2SO4溶液调pH值3.5，一边搅拌一边加入0.5mL H₂O₂溶液和0.5mL FeSO4溶液，加入不同浓度的样品溶液，反应20min，测定吸光度，记为C。每组做三个平行，按照清除率公式SA%= (C-B) /(A-B) ×100%计算各样品对·OH清除能力。

2.4.4清除NO2–能力的测定

取蒸馏水0.3 mL，加入pH值3.0的缓冲溶液0.9 mL，NaNO₂溶液0.3 mL，混匀后于37℃恒温水浴中保温30min，加入对氨基苯磺酸0.3 mL，混匀，静置5min，加入0.3 mL盐酸萘乙二胺0.3 mL，静置15min，为对照。以蒸馏水为对照空白管。分别取不同浓度的提取物、样品溶液0.3 mL，加入pH值3.0的缓冲溶液0.9 mL，NaNO₂溶液0.3 mL，混匀后于37℃恒温水浴中保温30min，加入对氨基苯磺酸0.3 mL，混匀，静置5min，加入0.3 mL盐酸萘乙二胺0.3 mL，静置15min，为样品管。分别取不同浓度的样品溶液0.3 mL，加入pH值3.0的缓冲溶液0.9 mL，蒸馏水0.3 mL，混匀后于37℃恒温水浴中保温30min，加入对氨基苯磺酸0.3 mL，混匀，静置5min，加入0.3 mL盐酸萘乙二胺0.3 mL，静置15min，为样品空白管。测定各管的吸光度，对照管的吸光度记为A，对照空白管的吸光度记为B，样品管的吸光度记为C，样品空白管的吸光度记为D。每组做三个平行，按照清除率公式SA%=[(A-B)-(C-D)]/(A-B) ×100%计算各样品对NO^2-清除能力。

3 实验结果

表8人参、无患子发酵提取物自由基清除活性

自由基EC₅₀值	维生素C(μg/ml)	常春藤皂苷元浓度(mg/ml)	总提物浓度(mg/ml)
				DPPH·	12.387 ±0.01	25.051±0.03	0.443±0.02
O₂ ^–·	6.11±0.03	60.55±0.03	4.33±0.01
				·OH	7.51±0.03	96.31±0.5	6.69±0.04
NO₂ ^–	7.06±0.12	63.22±0.5	5.33±0.01

人参、无患子发酵提取物有不同程度清除DPPH、 ·O^2–·、·OH和NO^2– 的活性。

自由基损伤是皮肤衰老的主要原因，人参、无患子发酵提取物能够清除自由基引起的皮肤衰老，应用到化妆品中能起到抗衰老的作用。

实验例 6

人参、无患子发酵提取物的体外抑菌作用

1实验材料

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）大肠杆菌（Escherichia coli）肠炎沙门氏菌（Salmonellae enteritidis）试验菌株由中国检验检疫局提供。

试验菌培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，水1000mL；牛肉膏蛋白胨液体培养基，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL。

以上培养基灭菌条件：1.05kg/cm²，121℃条件下灭菌20min。

2方法

2.1.试验菌悬液的制备

在无菌条件下，分别取金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的单个菌落分别接入冷却后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃恒温箱培养24h。利用血球板计数法计数，将各菌株用无菌水配置成浓度分别为大肠埃希氏菌：1.986×107cfu/ml、金黄色葡萄球菌:2.102×106cfu/ml、肠炎沙门氏菌1.954×108 cfu/ml的菌悬液备用。

2.2.受试样品的制备

取实施例2中的人参、无患子发酵提取物及对照样品，加入水及吐温80制成混悬液原液，冷藏保存。

实验前再将各个原液用蒸馏水依次稀释到所需浓度，密封后紫外灯杀菌，备用。各受试样品的浓度为：

人参、无患子发酵提取物：50 mg/mL、12.5 mg/mL、3.125 mg/mL

另配制浓度为5mg/mL的硫酸链霉素水溶液为阳性对照，以无菌水为阴性对照。

2.3试验菌平板的制备

将经湿热灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基放入水浴中加热使其融化，在无菌条件下，待培养基温度降至40-50℃时，分别取各试验菌菌悬液3mL，加入300mL细菌培养基内摇匀，立即倒入灭菌后的平板中，制成含菌平板。

本抑菌试验采用纸片扩散法进行。

用打孔器将定性滤纸打成6mm直径的圆片，121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却。将滤纸片（Φ=6mm）浸泡在样品溶液中，过夜，使其充分吸收，干后，平放于含有测试菌的培养皿中，3次重复。

阳性对照：采用链霉素溶液（50μg/mL）为阳性对照。取在链霉素中浸泡2h的滤纸片放入培养基内，每个平板培养基放3个，每种菌重复做3次。

阴性对照：分别取在所用提取溶剂中浸泡2h的滤纸片放入培养基内，每个平板培养基放3个，每种做3次重复。

制备好后的培养皿在37℃恒温培养，24h后观察，测其抑菌圈直径的大小，并根据抑菌圈直径的大小按如下公式计算出抑菌率。

Figure 201110247430X100002DEST_PATH_IMAGE002

3 实验结果

通过预实验的筛选，选用了0.05mg/ml的链霉素做阳性药。对测试菌的抑制结果：人参、无患子发酵提取物对3种试验菌均有一定的抑制作用。

人参、无患子发酵提取物抑菌作用的测定

表9 人参、无患子发酵提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏杆菌抑菌率

本发明提取物提取物的抑菌作用对应用在化妆品中，可以抑制炎症的发生，增加化妆品的消炎作用，从而增加化妆品的应用范围和适用度。

Claims

1. 一种人参、无患子发酵提取物，其特征在于是通过以下方法制备的：

取人参切成饮片，40℃-50℃干燥24h-48h，干燥品粉碎；

取人参粉末和干燥的无患子果皮粉末，按质量比将人参：无患子=1:1~100:1混合，加入5-10倍量纯净水混悬，100-120℃高温灭菌20min-30min；灭完菌后，放至室温，接入嗜酸乳杆菌；接完菌后放入恒温培养箱中37℃培养10-15天；将发酵完的人参在10-50℃低温通风烘干24-72h，烘干；

再加入3~5倍量的0～80％的乙醇水溶液浸泡12～24 h，超声提取3次，频率60 -100kHz, 功率330W，每次30-60分钟，或者溶剂分次加入，闪式提取30-60分钟，过滤，合并滤液，溶剂减压回收，滤液浓缩成浸膏。

2. 如权利要求1所述人参、无患子发酵提取物的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

取人参切成饮片，40℃-50℃干燥24h-48h，干燥品粉碎，取人参粉末和干燥的无患子果皮粉末，按质量比将人参：无患子=1:1~100:1混合，加入5-10倍量纯净水混悬，100-120℃高温灭菌20min-30min；灭完菌后，放至室温，接入嗜酸乳杆菌；接完菌后放入恒温培养箱中37℃培养10-15天；将发酵完的人参在10-50℃低温通风烘干24-72h，烘干；

再加入3~5倍量的0～80％的乙醇水溶液浸泡12～24 h，超声提取3次，频率60 -100kHz, 功率330W每次30-60分钟，或者溶剂分次加入，闪式提取30-60分钟，过滤，合并滤液，溶剂减压回收，滤液浓缩成浸膏。

3、如权利要求1所述人参、无患子发酵提取物在制备美容化妆品中的应用。

4、一种人参、无患子发酵提取物美容化妆品，其特征在于是以权利要求1所述人参、无患子发酵提取物为主要有效成分制成的。

5、一种人参、无患子发酵提取物美容乳液的制备方法，其特征在于：

乳液的制备包括去离子水3-12%、甘油0.1-10%、螯合剂0.001-1%、色料0.001-1%，60-70℃加热溶解，油相60-75℃加热溶解，加入表面活性剂，和权利要求1所述人参、无患子发酵提取物0.01-2%，防腐剂0.01-0.5%和香料0.001-0.1% ，55-75℃加热溶解；水相和油相混合乳化，余量加水补足，60-70℃，搅拌混合，用乳化机处理，脱气，过滤，冷却，贮存，灌装得到人参、无患子发酵提取物美容乳液。