CN112336642A - 一种纳米人参皂苷ck的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米人参皂苷CK的制备方法，涉及化妆品技术领域，采用薄膜水化法制备各聚合物胶束：分别称取PEG‑PLA2k/2k、PEG‑PLA5k/5k100mg，人参皂苷CK0‑8mg，加1‑50mL甲醇溶解，于25‑60℃减压旋转蒸发，形成均一透明薄膜，加入1‑20mL去离子水振荡，经0.22μm微孔滤膜滤过，得不同载药量的载人参皂苷CK的PEG‑PLA纳米胶束，冻干备用；本发明制备了纳米人参皂苷CK，提高了其水溶性，有望增强其药效发挥，并研究了其美白作用，可望作为纳米人参化妆品用于美白、抗皱、祛斑等化妆品领域。

Description

一种纳米人参皂苷CK的制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体为一种纳米人参皂苷CK的制备方法。
背景技术
人参具有得天独厚的滋补美容效果，其作为中国传统的美容护肤佳品，被公认为具有美白、抗皱、延缓衰老的功效，从20世纪80年代开始人参被广泛应用于化妆品中，如人参润肤霜、人参美白霜、人参面膜等多种人参化妆品，成为目前使用最为广泛的植物化妆品原料之一。
美白作用通常通过抑制黑色素的生成来实现，皮肤美白剂通常是以酪氨酸酶为作用靶点，通过抑制酪氨酸酶活性或者阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径，从而减少黑色素的生成，达到美白皮肤的效果。
人参皂苷CK是二醇型人参皂苷在人肠道内的代谢产物，是人参在体内发挥活性的成分之一，生物活性研究表明人参皂苷CK是一个多靶点、高活性化合物，其不但在抗肿瘤、抗炎、保肝和抗过敏方面表现出较好的活性，而且在神经系统及免疫系统方面也具有很好的调节作用。
然而，人参皂苷CK溶解度较低，口服吸收较差，限制了其功效作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种纳米人参皂苷CK的制备方法，解决了背景技术中提到的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种纳米人参皂苷CK的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取PEG-PLA2k/2k 100mg、PEG-PLA5k/5k 100mg、人参皂苷CK 1-10mg；
(2)加1-50mL甲醇溶解，于25-60℃减压旋转蒸发，形成均一的透明薄膜；
加入1-20mL去离子水振荡，经0.22μm微孔滤膜滤过，得不同载药量的载人参皂苷CK的PEG-PLA纳米胶束。
纳米人参皂苷CK胶束粒径的测定：取各胶束溶液置比色皿中，分别在室温及37℃条件下观察，采用激光粒度分析仪测定，结果表明PEG-PLA2k/2k-2mg和PEG-PLA5k/5k-4mg的载药胶束的稳定性优于其他胶束，在三天内粒径稳定均匀，其他胶束在第三天析出晶体，稳定性较差；
采用α-脱氧核糖氧化法测定羟基自由基水平：取200μLFeSO4-EDTA混合液(10mM)于带塞试管中，加入等体积的α-脱氧核糖溶液(10mM)，然后加入200μL样品溶液(游离CK，四种纳米CK浓度0,10,50,100,250,500,1000μg/mL)，然后用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)定容至1.8mL，最后加入0.2mLH2O2(10mM)，混匀，在37℃孵育4h，然后，加入1mL2.8％三氯乙酸(TCA)和1mL1.0％硫代巴比妥酸(TBA)，混匀后于沸水浴加热10min，冰水冷却，采用紫外-可见光谱仪分析532nm处吸光度，用同体积水替代样品，作为对照组，羟基自由基捕获能力(％)＝(Asample-Ablank)/Asample×100；
CK褪黑作用：细胞培养及细胞活性分析，培养人黑素细胞，培养板中分别加入0,10,50,100,250,500,1000μg/mL游离CK及4种纳米CK，37℃培养48h，检测MTT活性；
黑色素含量：人黑素细胞采用不同浓度的CK及4种纳米CK(0,10,100,1000μg/mL)处理72h，收集细胞，溶于200μL含1NNaOH及10％DMSO的溶液，在100℃处理30min，13,000rpm离心10min，采用酶标仪在415nm分析黑色素含量；
酪氨酸酶活性：通过测量L-DOPA转化成多巴色素的速度分析酪氨酸酶的活性，人黑素细胞接种于6孔板，采用游离CK及4种纳米CK(0,10,100,1000μg/mL)处理，冷PBS洗涤3次，采用150μL含0.5％TritonX-100和0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的PBS溶液(0.1M,pH6.8)孵育，细胞提取物在4℃及13,000离心20min，将10μL的10mML-DOPA加入到90μL上清液中，检测492nm处的吸收，分析多巴色素的含量；
WesternBlot：人黑素细胞在60mm培养板中培养，加入0,10,100，1000μg/mL的游离CK及4种纳米CK，培养24h，收集细胞，采用放射免疫沉淀分析裂解液裂解，样品以4-20％梯度的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入一抗如MITF、酪氨酸酶及GAPDH，HRP-兔抗作为二抗，成像仪成像；
人黑素细胞在60mm培养板中培养，分别加入0,10,100，1000μg/mL的PELA5k/5k/NT，培养24h，分析p-p38、p-ERK、p-JNK的表达，β-actin作为参比。
本发明与现有技术相比具备以下有益效果：本发明制备了纳米人参皂苷CK，提高了其水溶性，有望增强其药效发挥，并研究了其美白作用，可望作为纳米人参化妆品用于美白、抗皱、祛斑等化妆品领域。
附图说明
图1为本发明纳米人参皂苷的稳定性数据图；
图2为本发明不同纳米人参皂苷对自由基的捕获能力图；
图3为本发明不同纳米人参皂苷处理后黑色素含量图；
图4为本发明不同纳米人参皂苷处理后的酪氨酸酶活性图；
图5为本发明不同纳米人参皂苷处理后MITF和酪氨酸酶的表达图；
图6为本发明PELA5K5K/CK/NT作用下黑素细胞相关蛋白的表达图；
图7为本发明3D人皮肤模型经不同纳米人参皂苷处理后亮度变化图；
图8为本发明3D人皮肤模型经不同纳米人参皂苷处理后黑色素含量图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-8，本发明提供一种技术方案：
实施例1：纳米人参皂苷CK的制备
采用薄膜水化法制备各聚合物胶束，分别称取PEG-PLA2k/2k、PEG-PLA5k/5k各100mg，人参皂苷CK1-10mg，加1-50mL甲醇溶解，于25-60℃减压旋转蒸发，形成均一透明薄膜，加入1-20mL去离子水振荡，经0.22μm微孔滤膜滤过，得不同载药量的载人参皂苷CK的PEG-PLA纳米胶束。冻干备用。含有氮酮(NT)的纳米人参皂苷的制备方法为，将人参皂苷与0.1％的NT混合，采用成膜法制备纳米胶束。纳米人参皂苷的稳定性见图1。
实施例2：纳米人参皂苷对自由基的捕获能力
培养人黑素细胞，培养板中分别加入0,10,50,100,250,500,1000μg/mL游离CK及4种纳米CK，37℃培养48h，检测不同纳米人参皂苷对自由基的捕获能力，见图2。
实施例3：黑色素含量
人黑素细胞采用不同浓度的CK及4种纳米CK(0,10,100,1000μg/mL)处理72h。收集细胞，溶于200μL含1NNaOH及10％DMSO的溶液，在100℃处理30min，13,000rpm离心10min，采用酶标仪在415nm分析黑色素含量，见图3。
实施例4：酪氨酸酶活性
通过测量L-DOPA转化成多巴色素的速度分析酪氨酸酶的活性。人黑素细胞接种于6孔板，采用游离CK及4种纳米CK(0,10,100,1000μg/mL)处理，冷PBS洗涤3次，采用150μL含0.5％TritonX-100和0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的PBS溶液(0.1M,pH6.8)孵育，细胞提取物在4℃及13,000离心20min，将10μL的10mML-DOPA加入到90μL上清液中，检测492nm处的吸收，分析酪氨酸酶的活性，结果见图4。
实施例5：WesternBlot
人黑素细胞在60mm培养板中培养，加入0,10,100，1000μg/mL的游离CK及4种纳米CK，培养24h。收集细胞，采用放射免疫沉淀分析裂解液裂解(EMDMillipore,Billerica,MA,USA)，样品以4-20％梯度的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入一抗如MITF、酪氨酸酶及GAPDH，HRP-兔抗作为二抗，成像仪成像。MITF及酪氨酸酶的表达见图5。
人黑素细胞在60mm培养板中培养，分别加入0,10,100，1000μg/mL的PELA5k/5k/NT，培养24h，分析p-p38、p-ERK、p-JNK的表达，β-actin作为参比。PELA5k/5k/NT作用后细胞中各蛋白表达见图6。
实施例6：3D人皮肤模型黑色素含量分析
3D人皮肤组织3D人皮肤模型采用不同的纳米人参皂苷处理，PBS洗涤，加入600μL0.25％胰酶溶液在37℃处理2h，再加入同样体积的10％胎牛血清使胰酶灭活，并使用移液枪吹打皮肤组织。离心后，将细胞团溶于1mL1NNaOH溶液，在80℃处理30min，吸取200μL溶液加入96孔板，通过测量405nm处的吸光度测定3D人皮肤模型中的黑色素含量，结果见图8。经不同纳米人参皂苷处理后3D人皮肤模型的亮度见图7。
相对于单纯的人参皂苷，经纳米化后的人参皂苷可有效提高对自由基的捕获能力，降低人黑色素细胞中黑色素、小眼畸形相关转录因子(MITF)、磷酸化p38和JNK的表达及酪氨酸酶的活性，利用3D人工皮肤模型评价纳米人参皂苷的美白作用，纳米人参皂苷可明显降低模型皮肤中的黑色素含量。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.一种纳米人参皂苷CK的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取PEG-PLA2k/2k 100mg、PEG-PLA5k/5k 100mg、人参皂苷CK 1-10mg；
(2)加1-50mL甲醇溶解，于25-60℃减压旋转蒸发，形成均一的透明薄膜；
(3)加入1-20mL去离子水振荡，经0.22μm微孔滤膜滤过，得不同载药量的载人参皂苷CK的PEG-PLA纳米胶束。
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