CN116585335B - 一种抑制tyr活力和mc1r表达的皮肤外用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制TYR活力和MC1R表达的皮肤外用组合物，该组合物包括酚酸类化合物和三萜皂苷类化合物，其中所述酚酸类化合物为丹酚酸A，所述三萜皂苷类化合物为地榆皂苷I。经试验表明，本发明的组合物一方面抑制真皮层黑色素细胞中黑色素合成关键蛋白TYR和MC1R，抑制色素过度生成。另一方面，可以促进细胞自噬，加快已合成的黑色素的代谢，避免黑色素在表皮层聚集沉积影响肤色。
Description
技术领域
本发明涉及个人护理领域，特别是涉及一种抑制TYR活力和MC1R表达的皮肤外用组合物。
背景技术
黄褐斑是一种黑色素过度沉积类疾病，表现为面部的黄褐色色素沉着，对称蝶形分布于颊部，多见于女性。黄褐斑的病理学特征是真皮层黑色素细胞活跃和表皮层黑素颗粒的聚集。黑色素细胞中的黑皮质素受体1(MC1R)是黑色素生成过程的关键调节蛋白。MC1R在表皮和毛囊的黑色素细胞中表达并大量分布于细胞表面，能够与垂体前部释放的促黑激素(α-Melanocyte StimulatingHormone，α-MSH)或促肾上腺皮质激素(ACTH)结合，从而上调cAMP水平，激发酪氨酸酶TYR的表达及活性，促进皮肤黑色素形成。
黑色素细胞中的酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是一种调控黑色素生成的限速酶，存在于人体皮肤黑素细胞的黑色素体中。正常情况下，酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，再经过一系列的步骤最终生成黑色素。成熟的黑色素颗粒沿着微管、微丝运动到黑色素细胞的树突上，再到达相邻的角质细胞中，最后被角质细胞内的溶酶体降解，随表皮细胞的脱落而排出。当酪氨酸酶活性异常或者黑色素代谢途径发生阻碍就会诱发黄褐斑等黑色素过度沉积类疾病。
正常情况下，黑素细胞的黑素小体中合成的黑色素会转运至表皮层角质形成细胞中。黑色素被分布至表皮各层细胞后，大部分的黑色素随角质层细胞的剥脱而排出体外，部分黑色素在角质细胞内溶酶体的自噬作用而降解。正常个体皮肤中黑色素的合成与代谢保持动态平衡，从而维持皮肤健康，一旦失衡便容易诱发色素沉积类疾病。
目前临床上通过口服维生素E和维生素C，激光或者化学剥脱等手段降解已生成的色斑，外用氢醌乳膏、曲酸乳霜、氨甲环酸、木质素过氧化物酶、苯丙氨酸等治疗黄褐斑，上述的黄褐斑治疗方案治疗效果并不明显，临床上尚无特效的黄褐斑治疗方案。
因此，亟需找到一种治疗黄褐斑的技术方案，来克服上述问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明从调节黑色素生成和代谢的角度出发，提供一种抑制TYR活力和MC1R表达的皮肤外用组合物。
经试验表明，本发明的组合物一方面抑制真皮层黑色素细胞中黑色素合成关键蛋白TYR和MC1R，抑制色素过度生成。另一方面，可以促进细胞自噬，加快已合成的黑色素的代谢，避免黑色素在表皮层聚集沉积影响肤色。
本发明的一个目的，在于提供一种抑制TYR活力和MC1R表达的皮肤外用组合物，其包括酚酸类化合物和三萜皂苷类化合物。
进一步地，所述酚酸类化合物为丹酚酸A
进一步地，所述三萜皂苷类化合物地榆皂苷I。
进一步地，所述丹酚酸A和地榆皂苷I的质量比为5:1-1:5。
进一步地，所述抑制TYR活力和MC1R表达的皮肤外用组合物还包括溶剂。
进一步地，所述溶剂选自极性溶剂或非极性溶剂。
进一步地，所述极性溶剂选自DMSO、甲酰胺、三氟乙酸、丙二醇、甘油、乙醇、甲醇、乙醚的一种或多种。
进一步地，所述非极性溶剂选自矿物油、液体石蜡、白蜡、硬脂酸甘油酯、醋酸乙酯的一种或多种。
本发明具有以下有益效果：
目前临床上通过口服维生素E和维生素C，激光或者化学剥脱等手段降解已生成的色斑，外用氢醌乳膏、曲酸乳霜、氨甲环酸、木质素过氧化物酶、苯丙氨酸等治疗黄褐斑，上述的黄褐斑治疗方案治疗效果并不明显，临床上尚无特效的黄褐斑治疗方案。本发明从调节黑色素生成和代谢的角度出发，为黄褐斑患者开发一种由丹酚酸A和地榆皂苷I组合成的组合物，针对黄褐斑的病理学特征，即真皮层黑色素细胞活跃和表皮层黑素颗粒的聚集，该组合物能够抑制真皮层黑色素细胞中黑色素合成关键蛋白TYR和MC1R，抑制色素过度生成，同时可促进细胞自噬，加快已合成的黑色素的代谢，避免黑色素在表皮层聚集沉积影响肤色。
说明书附图
图1示出了不同浓度药物对B16细胞活力的影响(X±SD，n＝6)。
图2示出了TYR活力定量实验拟合曲线(X±SD，n＝6)。
图3示出了示出了组合物抑制B16细胞TYR活力的活性(X±SD，n＝6)。
图4示出了B组合物抑制B16细胞TYR活力的结果(X±SD，n＝6)。
图5示出了B组合物抑制B16细胞MC1R表达的结果(X±SD，n＝6)。
图6示出了B组合物对B16细胞黑色素合成的影响(X±SD，n＝6)。
图7示出了药物对B16细胞内LC3-II蛋白含量的影响(荧光强度比率％，X±SD，n＝3)。
图8示出了B组合物对B16细胞内ERK与LC3-II蛋白表达量的影响(X±SD，n＝3)。
图9示出了B组合物对B16细胞LC3-II蛋白表达的影响(X±SD，n＝3)。
图10示出了B组合物对B16细胞Beclin蛋白表达的影响(X±SD，n＝3)。
图11示出了B组合物对B16细胞MTOR蛋白表达的影响(X±SD，n＝3)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下制备例和应用例。制备例和应用例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。
小鼠黑色素瘤细胞(B16)，货号为MZ-0024，购自宁波明舟生物科技有限公司；
本发明制备例和应用例中的丹酚酸A、地榆皂苷I，购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均大于98wt％；
本发明制备例和应用例中的传明酸、左旋多巴(L-DOPA)采购自上海麦克林生化科技有限公司；
本发明制备例和应用例中的曲酸采购自上海笛柏生物科技有限公司。
制备例
药物储备液的配制：以DMSO作溶剂，将药物制备成储备液，并用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，用EP管分装，封口膜封口，贴标签，于-20℃避光环境保存备用。其中，A组合物(丹酚酸A:地榆皂苷I＝5:3)、B组合物(丹酚酸A:地榆皂苷I＝1:1)、C组合物(丹酚酸A:地榆皂苷I＝3:5)等按照比例配制。
应用例1
配制MTT工作液：称取50.00mg MTT粉末，加入15mL离心管，转移至超净台内环境，加10.0mLPBS溶液并震荡使完全溶解，制成5mg/mL浓度工作液。0.22μm孔径滤膜过滤除菌，用EP管分装，封口，贴标签，-20℃避光保存备用。
采用MTT实验检测药物对B16细胞活力的影响，具体实验步骤如下：
细胞分组与给药。设置Control组、曲酸组、丹酚酸A组、地榆皂苷I组、A组合物组、B组合物组、C组合物组的浓度为0.5、1、2、4、8、16和32μM，每组设置6个复孔。将B16细胞(2万/孔)接种在96孔板中，培养24h，当细胞融合度约为60％时，吸弃原有的培养基。阳性药组和给药组每孔加入200μL含不同浓度药物的1640培养基，每组设置6个复孔，空白对照组每孔加入200μL不含药物的1640培养基。然后，将96孔板放入培养箱中继续培养24h。
采用MTT实验检测药物对细胞活力的影响。具体步骤如下：培养结束，吸弃原有的培养基，PBS洗涤2次，于避光条件下用无血清1640培养基将5mg/mL MTT工作液稀释为0.5mg/ml，每孔加入200μl的0.5mg/ml MTT工作液，于培养箱中避光培养4h，取出孔板并倾倒液体，PBS洗涤2次，每孔加入100μL DMSO溶液，充分溶解10min，490nm处检测OD值，并计算细胞活力。
所采用的待测样品和相关测试结果，如表1和图1所示。
表1：不同浓度药物对B16细胞活力的影响(n＝6，X±SD)
注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，样品组与control组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示具有显著性差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。
图1示出了不同浓度药物对B16细胞活力的影响(n＝6，X±SD)。
从以上数据可知，与Control组比较，32μM丹酚酸A(P＜0.0001)、16μM丹酚酸A(P＜0.0001)、8μM丹酚酸A(P＜0.05)显著抑制B16细胞活性，丹酚酸A合适的给药范围为0.5-4μM，其中8μM丹酚酸A对应的细胞活力为96.88±0.02。与Control组比较，0.5-8μM的地榆皂苷I对B16细胞活性的影响没有统计学差异(P＞0.05)，地榆皂苷I合适的给药范围为0.5-8μM。与Control组比较，32μM曲酸(P＜0.0001)、16μM曲酸(P＜0.001)显著抑制B16细胞活性，曲酸合适的给药范围为0.5-8μM。
与Control组比较，32μM的A组合物(P＜0.0001)、16μM的A组合物(P＜0.001)显著抑制B16细胞活性，曲酸合适的给药范围为0.5-8μM。与Control组比较，32μM的B组合物显著抑制B16细胞活性(P＜0.0001)，B组合物合适的给药范围为0.5-16μM。与Control组比较，32μM的C组合物显著抑制B16细胞活性(P＜0.001)，C组合物合适的给药范围为0.5-16μM。
综上分析，后续实验中，设置给药浓度为8μM。
应用例2
采用基于细胞实验的多巴氧化法检测不同比例的药物对TYR的活性抑制作用。
左旋多巴(L-DOPA)溶液配制：称取20.00mg的L-DOPA粉末，加入15mL离心管中，转移至超净台内环境，加10.0mLPBS溶液并震荡使完全溶解，制成2g/L L-DOPA溶液。
具体实验步骤如下：
S1、TYR活力定量。取2.5KUnits活力量的蘑菇酪氨酸酶粉末，常温下溶于10mLPBS溶液中，制成250U/mL酶溶液，依次梯度稀释成125、51.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95U/mL各组酶溶液，以每孔100μL的量加入96孔板中，另设一组Control组，加入等量PBS，每组设置5个复孔。37℃孵育并加入10μL质量浓度为2g/L的L-DOPA溶液，反应1h。测定492nm处的OD值，校零后作出酶活力(U/mL)关于OD值的曲线图，酶活力值y(U/mL)与490nm处OD值x之间的拟合曲线如图2所示，计算得到酶活力值y(U/mL)与490nm处OD值x之间的拟合曲线方程如下：
y＝108.13*x^2+46.275*x-2.1163
S2、细胞分组及给药。根据应用例1的实验结果，将曲酸、丹酚酸A、地榆皂苷I、A组合物、B组合物、C组合物等给药浓度设置为8μM。设置Control组、曲酸组(阳性药物)、丹酚酸A组、地榆皂苷I组、A组合物组、B组合物组、C组合物组，每组设置6个复孔。将B16细胞均匀接种在96孔板中并培养1d，当B16细胞达到约60％密度时给药。Control组加100μL完全培养基，给药组加100μL含8μM浓度各组药物的完全培养基，继续培养24h。
S3、检测药物对B16细胞TYR活力的影响。培养结束后，吸弃培养液后用PBS缓冲液冲洗3次。加入50μL浓度为1％的细胞裂解液，低温冷冻30min，取出后室温融化。37℃孵育并加入10μL质量浓度为2g/L的L-DOPA溶液，反应1h。测定492nm处的OD值，代入曲线方程，得到酶活力数值。依照下列TYR活力抑制率计算公式，计算不同浓度药物处理后对B16细胞酪氨酸酶的抑制率：
TYR抑制率％＝(1-实验组平均酶活力/Control组平均酶活力)×100％
所得结果如表2和图3所示。
表2：不同比例组合物抑制B16细胞TYR活力的结果(X±SD，n＝6)
注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，与曲酸组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。与丹酚酸A组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。与地榆皂苷I组相比，+P<0.05，++P<0.01，+++P<0.001，++++P<0.0001。
图3示出了组合物抑制B16细胞TYR活力的活性(X±SD，n＝6)。
从以上数据可知，与曲酸组(阳性药物组)相比，丹酚酸A组(P<0.0001)、地榆皂苷I组(P<0.01)、A组合物组(P<0.0001)、B组合物组(P<0.0001)、C组合物组(P<0.0001)等均极显著降低B16细胞中TYR活力。
与丹酚酸A组相比，B组合物组极显著降低B16细胞中TYR活力(P<0.001)。与地榆皂苷I组相比，B组合物组极显著降低B16细胞中TYR活力(P<0.0001)。
综合上述实验结果，组合物降低B16细胞中TYR活力的作用优于单用丹酚酸A或者地榆皂苷I，且B组合物的作用最强，后续将进一步研究B组合物抑制B16细胞TYR活力和MC1R表达的活性。
应用例3
采用基于细胞实验的多巴氧化法检测B组合物对TYR的活性抑制作用，实验细胞、实验药物、材料与试剂、主要仪器设备等同应用例1，具体步骤如下：
细胞分组及给药：根据应用例1的实验结果，设置Control组、曲酸组(8μM)、B组合物高、中、低浓度组(16、8、4μM)，每组设置6个复孔。将B16细胞(2万每孔)接种在96孔板中，放入培养箱中培养24h，当B16细胞达到约60％融合密度时给药。吸弃原有培养基，Control组加100μL不含药物的完全培养基，给药组加100μL含相应浓度药物的完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养24h。
培养结束，采用基于细胞实验的多巴氧化法检测药物对TYR的活性抑制作用，具体实验方法同应用例2，所得结果如表3和图4所示。
表3：B组合物抑制B16细胞TYR活力的结果(X±SD，n＝6)
注：与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。与曲酸组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。
图4示出了B组合物抑制B16细胞TYR活力的结果(X±SD，n＝6)。
从以上数据可知，与Control组相比，曲酸组、B组合物低剂量组、中剂量组和高剂量组均对B16细胞中TYR活力有极显著的抑制作用(各组均P<0.0001)。
与曲酸组相比，B组合物低剂量组没有显著性差异(P＞0.05)，即与曲酸组B16细胞中TYR活力的效果没有统计学差异。与曲酸组相比，B组合物中剂量组、B组合物高剂量组均极显著抑制B16细胞中TYR活力(各组均P<0.0001)。且B组合物对B16细胞中TYR活力的抑制作用呈现浓度依赖性。
应用例4
采用基于细胞实验的Elisa法验证B组合物抑制MC1R表达的影响，实验细胞、实验药物、材料与试剂、主要仪器设备等同应用例1，具体步骤如下：
S1、细胞分组及给药。根据应用例1的实验结果，设置Control组、曲酸组(8μM)、B组合物高、中、低浓度组(16、8、4μM)，每组设置3个复孔。将B16细胞(20万每孔)接种在24孔板中，放入培养箱中培养24h，当B16细胞达到约50％融合度时给药。用无血清1640培养基将B组合物储备液稀释至相应给药浓度。吸弃原有培养基，Control组加1000μL不含药物的完全培养基，给药组加1000μL含相应药物浓度的完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养24h。
S2、检测药物对B16细胞MC1R表达的影响。培养结束后吸弃培养液，每孔加1mL 1％的曲拉通裂解液，于冰上裂解细胞1h。收集裂解后的细胞悬液至1.5mL离心管中，于4℃，3000rpm离心20min，取上清液按照MC1R Elisa试剂盒说明步骤操作，设置标准品孔、空白孔和待测样品孔，以空白孔校零，酶标仪检测450nm处OD值。以标准品蛋白浓度为横坐标，标准品OD值为纵坐标，绘制标准曲线。将待测样品OD值代入标准曲线并计算蛋白浓度，再乘以样品稀释倍数，即得样品组蛋白浓度，根据如下计算公式计算MC1R蛋白下调率：
MC1R下调率％＝(1-实验组平均蛋白浓度/Control组平均蛋白浓度)×100％
表4：B组合物抑制B16细胞MC1R表达的结果(X±SD，n＝6)
注：与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，与曲酸组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001
图5示出了B组合物抑制B16细胞MC1R表达的结果(X±SD，n＝6)。
从以上数据可知，与Control组相比，曲酸组(P＜0.05)、B组合物低剂量组(P＜0.0001)、中剂量组(P＜0.0001)和高剂量组(P＜0.0001)均对B16细胞中MC1R表达具有显著的抑制作用。与曲酸组相比，B组合物低剂量组(P＜0.0001)、中剂量组(P＜0.0001)和高剂量组(P＜0.0001)均对B16细胞中MC1R表达具有极显著的抑制作用，且B组合物对B16细胞中MC1R表达的抑制作用呈现浓度依赖性。
应用例5
采用NaOH裂解法检测B组合物给药前后对B16细胞黑色素合成量的影响，实验细胞、实验药物、材料与试剂、主要仪器设备等同应用例1，具体实验方法如下：
细胞分组及给药。根据应用例1的实验结果，设置Control组、曲酸组(8μM)、B组合物高、中、低浓度组(16、8、4μM)，每组设置3个复孔。将B16细胞(20万每孔)接种在24孔板中，放入培养箱中培养24h，当B16细胞达到约60％融合密度时给药。吸弃原有培养基，Control组加1000μL不含药物的完全培养基，给药组加900μL完全培养基与100μL相应浓度药液，使得终浓度为目标试验浓度，放入细胞培养箱中继续培养24h。弃上清，用PBS洗两次，每孔加入150μL浓度为0.25％的胰酶消化细胞，随后加入1mL培养基收集孔底细胞，将含有细胞的溶液转移至1.5mL离心管中。1000rpm离心10min，PBS洗涤后加入1.0mL 1.0mol/LNaOH溶液，80℃水浴孵育1h使细胞中黑色素颗粒溶解在NaOH溶液中。之后2000rpm离心10min，将上清转移至96孔板中，每孔200μL并在405nm处测量上清液的吸光度，黑色素相对含量及其抑制率计算公式如下：
黑色素相对含量％＝样品组吸光值/Control组吸光值×100％
黑色素抑制率％＝1-黑色素相对含量
所得结果如表5和图6所示。
表5B组合物对B16细胞黑色素合成的影响(X±SD，n＝6)
注：与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，与曲酸组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001
图6示出了B组合物对B16细胞黑色素合成的影响(X±SD，n＝6)。
从以上数据可知，与Control组相比，曲酸组(P＜0.001)、B组合物低剂量组(P＜0.0001)、中剂量组(P＜0.0001)、高剂量组(P＜0.0001)黑色素抑制率均有显著性差异，即显著抑制B16细胞内黑色素合成。与曲酸组相比，B组合物低剂量组(P＜0.0001)、中剂量组(P＜0.0001)、高剂量组(P＜0.0001)黑色素抑制率均有显著性差异，即显著抑制B16细胞内黑色素合成。
应用例6
采用CLSM观察B组合物对B16细胞内LC3-II蛋白含量的影响，实验细胞、实验药物、材料与试剂、主要仪器设备等同应用例1，具体步骤如下：
S1、细胞爬片、分组与给药。设置的细胞组别如下：Control组、传明酸组(阳性药，给药浓度为8μM)、B组合物低剂量组(给药浓度为4μM)、B组合物中剂量组(给药浓度为8μM)、B组合物高剂量组(给药浓度为16μM)，每组设置3个复孔。
将盖玻片用洗洁剂清洗干净，之后用自来水将洗洁剂冲洗干净，再用纯水冲洗三遍，95％的酒精中静置浸泡10min。转移至超净台内，用镊子夹起盖玻片在酒精灯上将酒精烧干，温度不可太高。将烧干的盖玻片放在6孔板中，待冷却后在6孔板中先加入2ml完全培养基，后加入B16细胞悬液，使得细胞密度为20万/mL，轻轻上下左右晃动使细胞液均匀覆盖板底与爬片表面，爬片与板底不能有缝隙，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，当B16细胞达到约60％融合密度时给药。Control组加2ml不含药物的完全培养基，给药组加入含相应浓度药物的完全培养基各2mL，放入细胞培养箱中继续培养24h。倾去培养基，加入PBS轻轻地洗两次，再加入4％多聚甲醛固定25-30min后，去掉固定液，加入能覆盖过爬片的PBS泡着细胞，4℃保存。
S2、免疫荧光染色与封片。固定好的爬片稍甩干，用组化笔在细胞分布均匀的位置画圈，加50-100μL破膜工作液，室温孵育20min，PBS洗涤3次。之后在圈内滴加BSA均匀覆盖细胞表面，室温封闭30min。甩掉封闭液，在孔板里滴加用PBS配好的一抗，培养板4℃孵育过夜。孔板置于脱色摇床上洗涤3次。稍甩干后在圈内滴加相应种属的二抗，室温孵育50min。爬片置于PBS中洗涤3次，玻片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。最后洗涤甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
S3、CLSM拍照观察。按照CLSM操作说明对封好的免疫荧光染色片进行拍照观察。
图7示出了药物对B16细胞内LC3-II蛋白含量的影响(荧光强度比率％，X±SD，n＝3)。
从图7可知，与Control组相比，传明酸组(P＜0.01)、B组合物低剂量组(P＜0.01)、B组合物中剂量组(P＜0.001)、B组合物高剂量组(P＜0.001)荧光显著增强，即B16细胞内LC3-II蛋白含量均显著增加。与传明酸组相比，B组合物低剂量、中剂量和高剂量组荧光增强无统计学差异(P＞0.05)，即B组合物低剂量、中剂量和高剂量组增加B16细胞内LC3-II蛋白含量的效果与传明酸组没有差异。
应用例7
采用Western Blot检测B组合物对B16细胞LC3-II、Beclin、MTOR等自噬蛋白表达量的影响，实验细胞、实验药物、材料与试剂、主要仪器设备等同应用例1，具体步骤如下：
S1、细胞分组及给药。在6孔板中先加入2ml完全培养基，后加入B16细胞悬液，使得细胞密度为20万/mL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，当B16细胞达到约60％融合密度时给药。吸弃原有培养基，Control组加2ml不含药物的完全培养基，给药组加入含相应浓度药物的完全培养基各2mL，放入细胞培养箱中继续培养24h。
S2、提取细胞总蛋白与测定蛋白浓度。培养完成后，去掉培养基，加入PBS轻轻地洗两次，用细胞刮刀刮取贴附在板底的各组细胞，收集于1.5mL离心管中。加入细胞裂解液，冰浴30min，期间用移液枪反复吹打，确保细胞完全裂解，置于低温高速离心机，4℃，12000rpm离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。参照试剂盒说明书，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。
S3、蛋白电泳、转膜、免疫反应、显影与分析。制胶后依次上样(顺序为空白、传明酸、低、中、高剂量给药组)，按步骤进行蛋白电泳。电泳完成后转膜1h，加封闭液封闭1h，用一抗孵育过夜(4℃)，放置于摇床用TBST清洗5次，15min更换一次TBST，二抗孵育(37℃)1h。滴加显影液，于化学发光仪曝光显影，进行蛋白水平分析。
所得实验结果如图7、图8、图9、图10所示
图8示出了B组合物对B16细胞内ERK与LC3-II蛋白表达量的影响(X±SD，n＝3)，其中阳性药传明酸组，浓度为8μM；L、M、H分别为B组合物低、中、高剂量，浓度分别为4、8、16μM；与Control组相比，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001；与传明酸相比，#P<0.05，###P<0.001。
图9示出了B组合物对B16细胞LC3-II蛋白表达的影响(X±SD，n＝3)。
图10示出了B组合物对B16细胞Beclin蛋白表达的影响(X±SD，n＝3)。
图11示出了B组合物对B16细胞MTOR蛋白表达的影响(X±SD，n＝3)。
从以上数据可知，与Control组相比，B组合物低剂量组(P<0.001)、B组合物中剂量组(P<0.001)、B组合物高剂量组(P<0.01)LC3-II蛋白表达量均显著增加；与传明酸组相比，B组合物低剂量组(P<0.001)、B组合物中剂量组(P<0.001)、B组合物高剂量组(P<0.01)LC3-II蛋白表达量均显著增加。
与Control组相比，B组合物低剂量组(P<0.01)、B组合物中剂量组(P<0.0001)、B组合物高剂量组(P<0.0001)Beclin蛋白表达量均显著增加；与传明酸组相比，B组合物低剂量组(P<0.001)、B组合物中剂量组(P<0.0001)、B组合物高剂量组(P<0.0001)Beclin蛋白表达量均显著增加。
与Control组相比，传明酸组(P<0.01)、B组合物中剂量组(P<0.01)、B组合物高剂量组(P<0.0001)MTOR蛋白表达量均显著增加；与传明酸组相比，B组合物中剂量组和B组合物高剂量组Beclin蛋白表达量增加没有显著性差异(两组均P＞0.05)。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性制备例和应用例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将制备例和应用例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各制备例和应用例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种治疗黄褐斑的皮肤外用组合物，其特征在于，所述治疗黄褐斑的皮肤外用组合物成分包括酚酸类化合物和三萜皂苷类化合物；
所述酚酸类化合物为丹酚酸A；
所述三萜皂苷类化合物为地榆皂苷I；
所述丹酚酸A和所述地榆皂苷I的质量比为1:1。
2.根据权利要求1所述治疗黄褐斑的皮肤外用组合物，其特征在于，所述丹酚酸A和地榆皂苷I的纯度均大于98 wt%。
3.根据权利要求1所述治疗黄褐斑的皮肤外用组合物，其特征在于，所述治疗黄褐斑的皮肤外用组合物还包括溶剂。
4.根据权利要求3所述治疗黄褐斑的皮肤外用组合物，其特征在于，所述溶剂选自极性溶剂或非极性溶剂。
5.根据权利要求4所述治疗黄褐斑的皮肤外用组合物，其特征在于，所述极性溶剂选自DMSO、甲酰胺、三氟乙酸、丙二醇、甘油、乙醇、甲醇、乙醚的一种或多种。
6.根据权利要求4所述治疗黄褐斑的皮肤外用组合物，其特征在于，所述非极性溶剂选自矿物油、液体石蜡、白蜡、硬脂酸甘油酯、醋酸乙酯的一种或多种。
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