KR20190092800A

KR20190092800A - 피부 광노화 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20190092800A
Application number: KR1020180011977A
Authority: KR
Inventors: 임순호; 최화정; 배은영; 윤미영; 이승웅
Original assignee: 동신대학교산학협력단
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2019-08-08

Abstract

본 발명은 지유(Sanguisorba officinalis Linne) 추출물 또는 분획물이나, 이로부터 분리된 지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 유효 성분으로 포함하는 피부 광노화 개선, 피부 주름 개선 및 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

Description

피부 광노화 개선용 조성물{Composition for improving skin photo-aging}

본 발명은 지유(Sanguisorba officinalis Linne) 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 피부 광노화 개선, 피부 주름 개선 및 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

생활수준의 향상으로 인해 아름답고 건강한 피부를 유지하려는 욕구가 증대되고 야외활동이 증가하면서 태양광선 노출로부터 야기되는 피부손상을 방지하기 위한 관심이 증가함과 동시에 피부노화 억제에 관한 연구가 진행되고 있다. 태양광선의 자외선(UVR, ultraviolet radiation)에 반복적이거나 장기간 노출시 피부의 탄력 및 수분이 감소되고 주름이 형성되는 등 피부손상이 일어나는 현상을 광노화(photoaging)라고 부른다.

자외선(UVR)은 파장에 따라 UVA(ultraviolet A, 320∼400nm), UVB(ultraviolet B, 280∼320nm), UVC(ultraviolet C, 200∼280nm)로 분류된다. 그 중 UVB는 매우 유해한 광선으로 표피 손상에 관여하거나 건조, 피부 홍반, 색소 침착, 표피 비후 등을 일으킨다. 또 항산화 기전의 불균형 유발을 통해 피부를 구성하는 지질, 단백질, 효소 등을 손상시킴으로써 염증 반응과 피부암, 광노화를 심화시킨다. 반면, UVA는 UVB에 비해 단기간의 위력은 미미하지만 파장이 길어서 피부 깊숙이 침투해 피부의 진피를 손상시켜서 피부를 검게 하고 피부노화를 촉진시킨다. 따라서 UVA 및 UVB를 저해할 수 있는 소재 및 제품의 효능기준이 자외선 차단 지수로 이용된다.

UVB 노출에 의해 생성이 유도되는 ROS(reactive oxygen species)는 광노화의 원인 중 하나로 세포 내 신호전달 체계를 자극하여(Wu etal., Proteomic analysis of UVB-induced protein expression- and redox-dependent changes in skin fibroblasts using lysine- and cysteine-labeling two-dimensional difference gel electrophoresis. J Proteomics 75, 2012, 1991-2014) DNA, 지질 및 단백질 등 생체분자에 산화적 스트레스 유발을 통한 피부조직 손상을 일으킨다. ROS는 표피 각질세포와 진피 섬유아세포의 자극으로 Ap-1(activator protein-1) 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activator B cells)의 전사인자를 활성화하고 염증관련 사이토카인(cytokine)을 분비하도록 하여 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현을 증가시키고 피부 조직을 구성하는 교원질과 탄력섬유의 분해를 촉진하여 주름을 형성시킨다(Darr etal.,Free radicals in cutaneous biology. J InvestDermatol 102,1994, 671-675). 생체에는 이러한 ROS 자극으로부터 생성 및 및 활성되는 지질과산화물과 산화효소로부터 방어하고자 CAT(catalase), SOD(superoxide dismutase) 및 GST(glutathione-s-transferase) 등 항산화효소가 작용을 하며(Hassan HM,Biosynthesis and regulation of superoxide dismutases. FreeRadicBiolMed 5,1988, 377-384) 체외에서는 비타민 C, E 및 폴리페놀류와 플라보노이드 등 생리활성물질의 도움을 통해 생성된 ROS에 의한 손상을 방어한다고 보고된 바 있다(Borek et al.,Dietary antioxidants and human cancer. Integr Cancer Ther 3,2004, 333-341). 피부 광노화에 따른 피부 손상 및 주름 개선을 위한 항산화제의 역할과 중요성이 부각되면서 항산화 활성을 지니면서도 장기간 사용을 통해 부작용없이 효능을 나타낼 수 있는 천연 기능성 소재 및 제품을 개발하기 위한 연구가 활발히 일어나는 실정이다.

본 발명의 일 목적은 지유(Sanguisorba officinalis Linne) 추출물 또는 분획물로 지유글리코사이드 I(Ziyuglycoside I)를 유효 성분으로 포함하는 피부 광노화의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 지유 추출물 또는 분획물로 지유글리코사이드 I를 유효 성분으로 포함하는, 피부 주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 지유 추출물 또는 분획물로 지유글리코사이드 I를 유효 성분으로 포함하는, 피부 미백용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 지유 추출물 또는 분획물로 지유글리코사이드 I를 유효 성분으로 포함하는, 과색소침착에 기인한 색소 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 발명자들은 지유(Sanguisorba officinalis Linne) 추출물 또는 분획물, 그 중에서도 특히 지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)가 피부 광노화를 억제하여 그에 따라 피부 주름 또한 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있고, 피부에 멜라닌 생성을 억제하여 과색소 침착에 기인한 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있으며, 피부 미백 효과가 뛰어난 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 지유(Sanguisorba officinalis Linne) 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 피부 노화의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 “지유(地楡, Sanguisorba officinalis Linne)”는 오이풀이라고도 불리며 우리나라 각처의 산지에서 자라는 장미과의 다년생 초본이다. 약용으로 사용하는 부위는 뿌리이며, 주요 성분으로 탄닌(tannin), 트리터페노이드(triterpenoid)계 사포닌(saponin)이 함유되어 있고(도해 향약대사전, 영림사, 신민교 외1, p654-656; 약초의 성분과 이용, 일월서각, 문관심, p362-363), 약리 작용으로는 본초강목에서 뿌리의 유동엑스는 혈관 수축 작용이나, 대장균에 대한 항균 작용도 있다고 알려져 있다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 지유 추출물은 지유에 추출 용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출 용매가 이용될 수 있다.

본 발명에서 상기 추출 용매로는 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 본 발명에서 상기 극성 용매로는 (i) 물, (ii) 알코올(본 발명의 일 구현예에 따르면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 비극성 용매로는 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 본 발명에서 상기 지유 추출물은 지유에 (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (b) 물, (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 메틸렌 클로라이드, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르로부터 선택된 1종 이상의 추출 용매를 처리하여 수득된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 지유에 물, 메탄올 또는 이의 혼합물을 처리하여 수득된 것일 수 있다.

본 발명에서 추출 방법으로는 냉침 추출, 열 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등 당업계에서 당업자에 의해 통상적으로 사용하는 모든 추출 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 추출 방법의 일 예시로, 건조된 지유를 세절하여 건조 중량의 1 내지 20 배, 바람직하게는 2 내지 6배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 20 내지 150℃, 바람직하게는 70 내지 120℃의 추출 온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간 동안 환류 냉각 추출 방법으로 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 “추출물”은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 지유 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 지유 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 지유 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 본 발명의 추출물이 얻어질 수 다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명에서 상기 지유 추출물 제조에 사용되는 지유의 부위는 특별히 제한하지 않으며, 뿌리, 줄기, 잎, 종자 및/또는 열매가 모두 사용 가능하나, 바람직하게는 뿌리 부위를 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 지유 추출물 및 분획물은 하기 화학식 1로 표시되는 지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 포함할 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 지유 추출물, 분획물 및 지유글리코사이드 I는 피부 노화, 특히는 피부 광노화를 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 “유효 성분으로 포함하는”이란 하기의 지유 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 지유 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다. 다만, 본 발명에서 피부 노화의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 그 효과를 발휘하기 위해서는 상기 지유 추출물, 분획물 또는 지유글리코사이드 I은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 피부 노화의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학, 화장료 또는 식품 조성물의 다양한 용도로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 지유 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 지유 추출물 및 분획물은 지유글리코사이드Ⅰ를 포함할 수 있고, 본 발명에서 상기 지유 추출물, 분획물 및 지유글리코사이드 I는 피부 주름을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 지유 추출물, 분획물 및 지유글리코사이드 I에 관한 내용은 상기 피부 노화의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에서 기재한 바와 중복되어 이하 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 상기 피부 주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학, 화장료 또는 식품 조성물의 다양한 용도로 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 지유 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 지유 추출물 및 분획물은 지유글리코사이드Ⅰ를 포함할 수 있고, 본 발명에서 상기 지유 추출물, 분획물 및 지유글리코사이드 I는 피부 세포에서 멜라닌 생성을 억제하여 과다색소침착에 기인한 색소 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 피부 색소 질환은 과다색소침착에 기인한 질환으로, 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검거나 어둡게 되는 질환을 의미한다. 바람직하게는 상기 피부 색소 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 잡티, 모반 또는 일광흑색증(solar lentigines) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 지유 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 지유 추출물 및 분획물은 지유글리코사이드Ⅰ를 포함할 수 있고, 본 발명에서 상기 지유 추출물, 분획물 및 지유글리코사이드 I는 피부 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하여 피부 미백 효과가 뛰어나다.

본 발명에서 상기 피부 미백용 조성물은 약학, 화장료 또는 식품 조성물의 다양한 용도로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 조성물을 이용하여 피부 광노화, 피부 주름 또는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에서, "개선"은 본 발명의 조성물을 이용하여 피부 광노화, 피부 주름 또는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 조성물을 이용하여 피부 광노화, 피부 주름 또는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 각 용도의 조성물은 약학 조성물로 사용할 수 있다. 여기서 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 각 용도의 조성물은 화장료 조성물로 사용할 수 있다. 여기서 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물 첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백 크림, 핸드로션, 헤어 로션, 화장용 크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.

상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용 가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.

그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명에 있어서, 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 각 용도의 조성물은 식품 조성물로 사용할 수 있다. 여기서 상기 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.

여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.

그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 지유 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리된 지유글리코사이드 I는 피부 광노화를 효과적으로 억제하여, 피부 주름을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 지유 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리된 지유글리코사이드 I는 피부 세포에 멜라닌 생성 또한 억제하여 과색소 침착에 기인한 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 정상 피부에도 미백 효과를 부여할 수 있다.

도 1은 HRM-2 마우스의 등 피부에 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO) 또는 음성 대조군으로 무처리 후 UVB 조사한 뒤 마우스의 체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다. 그래프의 각 값은 평균±표준편차(n=5)로 나타내었다.
도 2는 HRM-2 마우스의 등 피부에 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO) 또는 음성 대조군으로 무처리 후 UVB 조사한 뒤 마우스의 식이 섭취량의 변화를 그래프로 나타낸 것이다(** p<0.01, *** p<0.001). 그래프의 각 값은 평균±표준편차(n=5)로 나타내었다.
도 3은 HRM-2 마우스의 등 피부에 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO) 또는 음성 대조군으로 무처리 후 UVB 조사한 뒤 마우스의 식이 효율의 변화를 그래프로 나타낸 것이다(** p<0.01, *** p<0.001). 그래프의 각 값은 평균±표준편차(n=5)로 나타내었다.
도 4는 HRM-2 마우스의 등 피부에 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 처리한 후 UVB 조사한 뒤 음성 대조군 대비 마우스의 등 피부에서 MMP-2 mRNA의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). 그래프의 각 값은 평균±표준편차로 나타내었다.
도 5는 HRM-2 마우스의 등 피부에 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO) 또는 음성 대조군으로 무처리 후 UVB를 조사한 뒤 음성 대조군 대비 마우스의 등 피부에서 MMP-9 mRNA의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). 그래프의 각 값은 평균±표준편차로 나타내었다.
도 6은 HRM-2 마우스의 등 피부에 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 처리한 후 UVB 조사한 뒤 음성 대조군 대비 마우스의 등 피부에서 IL-β mRNA의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 그래프의 각 값은 평균±표준편차로 나타내었다.
도 7은 HRM-2 마우스의 등 피부에 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 처리한 후 UVB 조사한 뒤 MMP-2 단백질의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, #: p<0.05 compared with normal group). 그래프의 각 값은 평균±표준편차로 나타내었다.
도 8은 실험 시작 후 1주차에 정상 HRM-2 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 9는 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 연고 기제를 도포한 후 UVB 조사 1주 차에 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 10은 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)의 도포 후 UVB 조사 1주 차에 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 11은 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 연고 기제 또는 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 1주 차에 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 정상 군의 왼쪽 부위 대비 색소 침착 정도를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다(n=5).
도 12는 실험 시작 후 3주 차에 정상 HRM-2 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 13은 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 연고 기제를 도포한 후 UVB 조사 3주 차에 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 14는 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)의 도포 후 UVB 조사 3주 차에 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 15는 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 연고 기제 또는 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 3주 차에 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 정상 군의 왼쪽 부위 대비 색소 침착 정도를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다(n=5) (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 16은 실험 시작 후 5주 차에 정상 HRM-2 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 17은 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 연고 기제를 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 18은 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)의 도포 후 UVB 조사 5주 차에 마우스의 등 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 19는 HRM-2 마우스의 등을 왼쪽과 오른쪽으로 나눈 뒤 왼쪽 부위에는 무처리, 오른쪽 부위에는 연고 기제 또는 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 정상 군의 왼쪽 부위 대비 색소 침착 정도를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다(n=5).
도 20은 HRM-2 마우스의 등의 오른쪽 부위에 연고 기제 또는 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 4주차 및 5주 차에 skin dermobella 3D 분석기를 이용하여 피부 주름 깊이를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 실험 시작 후 3주 차에서 정상 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 피부를 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=4).
도 22는 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 연고 기제를 도포한 후 UVB 조사 3주 차에 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 23은 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 3주 차에 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=4).
도 24는 실험 시작 후 4주 차에서 정상 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 피부를 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=4).
도 25는 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 연고 기제를 도포한 후 UVB 조사 4주 차에 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 26은 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 4주 차에 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=4).
도 27은 실험 시작 후 5주 차에서 정상 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 피부를 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=4).
도 28은 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 연고 기제를 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=5).
도 29는 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 USB 디지털 현미경으로 400배 확대하여 촬영한 사진을 나타낸 것이다(n=4).
도 30은 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 연고 기제 또는 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 상피 조직의 두께를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 31은 실험 시작 후 5주 차에서 정상 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 피부의 조직을 H&E 염색한 뒤 단면 조직을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 32는 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 연고 기제를 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 채취한 조직을 H&E 염색한 후 조직 단면을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 33은 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 채취한 조직을 H&E 염색한 후 조직 단면을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 34는 실험 시작 후 5주 차에서 정상 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 피부의 조직을 마쓴 트리콤 염색한 뒤 단면 조직을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 35는 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 연고 기제를 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 채취한 조직을 마쓴 트리콤 염색한 후 조직 단면을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 36은 HRM-2 마우스의 오른쪽 등 부위에 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 후 UVB 조사 5주 차에 채취한 조직을 마쓴 트리콤 염색한 후 조직 단면을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 지유의 추출 및 분획, 지유글리코사이드 I의 분리

지유(Sanguisorba officinalis Linne)로부터 유효 성분 후보 물질을 분리하기 위하여, 준비된 지유를 100 % 메탄올로 추출하여 추출물 448 g을 얻었다. 얻어진 추출물 448g을 HP 20 컬러크로마토그래피를 100% 물부터 100% 메탄올까지 수행하여 4개의 분획물을 얻었다. 얻어진 분획 중 SO-3 분획물 106.14 g으로부터 유효성분 물질을 분리하기 위해 C18 컬러크로마토그래피를 20 % 메탄올에서 100 % 메탄올로 수행하여 4개의 분획으로 나누었으며, 그 과정에서 얻어진 SO-3-6-3 분획물을 HPLC로 분리 및 정제하여 지유글리코사이드 I를 1.5 g을 얻었다.

2. 지유 추출물 유래 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물의 제조

증류수 100 ml에 하기 표 1에 나타낸 각 성분들을 혼합하여 크림 형의 화장료 조성물을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
세틸 에틸헥사노에이트(cetyl ethylhexanoate, C.E.H)	7
유동 파라핀(㈜서진화학사의 PARACOS KF-70)	10
글리세린(glycerin)	6
세틸 알코올(cetyl alcohol; Kao사의 KALCOL 6098)	1.6
1,3-부틸렌 글리콜(1,3-butylene glycol)	4.0
85% 포타슘 하이드록사이드(potassium hydroxide)(KOH)	0.12
Arlacel 165	0.3
세틸 스테아릴 알코올(cetyl stearyl alcohol; Lanette O Gesch)	0.8
글리세릴 모노 스테아레이트(glyceryl mono stearate; K.M. #205C)	2.5
2% 카보폴 940(carbopol 940)	0.4
디소디움 EDTA(disodium EDTA)	0.020
1,2-헥산디올(1,2-hexanediol)	0.8
지유 추출물 유래 지유글리코사이드 I	1
증류수	잔부

3. 광노화 마우스 모델의 준비

7주령의 HRM-2 마우스의 등 피부에 UVB 램프 (15 W type, UV maximum wave length 312 nm; UV intensity 100 μW cm-2, Ieda Boeki Co., Tokyo, Japan)를 조사하여 피부 두께, 탄력, 주름 생성의 변화 및 색소침착에 대하여 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I의 효과를 검증하고자 한다. 구체적으로, 첫 번째 1 주일 동안은 매일 HRM-2 마우스에 100 mJ/cm²의 세기로 UVB(1 minimal erythematal dose=100 mJ/cm²)를 조사하였다. 그 다음 2주째부터 4주째 까지는 주 3회(월요일, 수요일 및 금요일)에 200 mJ/cm²의 세기로 UVB를 조사하였다. 단, UVB를 조사하기 전에 하기 표 2 및 3에 나타낸 조건으로 HRM-2 마우스의 등 피부에 상기 2.에서 제조한 지유글리코사이드 I를 포함하는 크림 제형의 화장료 조성물(이하, ‘SO’라 한다.) 200 μL/mouse를 도포한 뒤 UVB를 등 피부로부터 15 ㎝가 이격된 거리에서 5~10 분간 조사하였다.

구분	처리
정상	무처리
음성 대조군	UVB 조사
실시예	SO 200 μL/mouse 도포 및 UVB 조사

	1주차(횟수)	2주차(횟수)	3주차(횟수)	4주차(횟수)	5주차(횟수)
UVB 조사 횟수	7	3	3	3
약물 처리	7	7	7	7
주름 촬영			측정	측정	측정 및 안락사

4. HRM-2 마우스의 체중 변화 및 식이섭취량의 변화 확인

상기와 같이 처리된 HRM-2 마우스의 체중, 식이 섭취량 및 식이 효율을 매주 일정한 시간에 측정하여 기록하였고, 그 결과는 도 1 내지 3에 나타내었다. 단, 체중, 식이섭취량 및 식이효율의 변화의 측정 조건은 하기와 같다.

(1) 체중 (body weight)

① 체중 변화: 매주 목요일 10시에 측정/기록

② 총 체중 증가량: Final body wt - initial body wt

③ 1일 평균 체중 증가량 = Total body wt gain / days

(2) 식이 섭취량 (food intake)

1일 평균 식이 섭취량 - Total food intake / days

(3) 식이 효율 (food efficiency ratio, FER)

FER = [Total weight gain / Total food intake] x 100

도 1에서 보는 바와 같이, HRM-2 마우스에 UVB 조사 여부 혹은 약물 처리 여부와 관계없이 그룹 간 체중변화는 크게 나타나지 않은 것을 볼 수 있었다.

도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 정상 군에 비하여 UVB 조사 군에서 식이 섭취량이 약간 감소하였고, 식이 효율은 약간 증가하였으나 통계적 유의성은 없었다. 단, 본 발명에 따라 UVB 조사 전 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군의 경우 식이 섭취량은 정상군과 비슷한 결과를 보였다.

5. RT-PCR을 통한 주름 또는 염증 관련 유전자의 발현 수준 분석

지유 추출물 유래 지유글리코사이드 I가 광노화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 3.에서와 같이 UVB 조사 후 색소 침착이 유발된 마우스 피부에서 실시간 PCR(real-time PCR)을 통해 주름 관련 유전자인 기질 금속단백분해효소-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2) 및 MMP-9의 mRNA와, 피부 손상 관련 유전자인 IL-1β mRNA의 발현 수준을 확인하였다. 구체적인 공정은 다음과 같다.

1) RNA 추출

UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부를 적출하여 트리졸(Trizol) 500 ㎕를 넣고 균질기(homogenizer)로 세포들을 분쇄하였으며 여기에 클로로포름(chloroform; CHCl₃) 100 ㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15 분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심 분리하였고 약 200 ㎕의 상층액을 회수하여 2-프로판올(2-propanol) 200 ㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15 분간 방치하였다. 이를 다시 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 80 % 에탄올(EtOH)로 수세하고 3분간 진공 펌프(vacuum pump)에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC를 처리한 20 ㎕의 증류수에 녹여 75℃의 히팅 블록(heating block)에서 불활성화 시킨 후 제1 가닥(first strand) cDNA합성에 사용하였다.

2) 역전사 (reverse transcription)

UVB를 조사하여 주름을 유발한 마우스의 피부로부터 추출한 총 RNA 3 ㎍을 75℃에서 10분 동안 변성시킨 다음 이에 2.5 ㎕의 10 mM dNTPs mix, 1 ㎕ 임의의 시퀀스 헥사뉴클레오티드(random sequence hexanucleotides) (25 pmole/ 25 ㎕), RNA 억제제로서 1 ㎕ RNase 억제제 (20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5 × RT 버퍼 (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT (200 U/㎕)를 다시 가한 뒤 DEPC 처리된 증류수를 가하여 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 이렇게 준비한 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 혼합한 뒤 2,000 rpm에서 5 초간 원심 침강하여 37℃의 히팅 블럭에서 60분 동안 반응시켜 제1 가닥 cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.

3) 실시간 PCR(Real-time PCR; RT-PCR)

Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 단 실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다.

타겟 유전자	프라이머/프로브	서열
MMP-2	정방향	5'-CAG GGA ATG AGT ACT GGG TCT ATT-3
MMP-2	역방향	5'-ACT CCA GTT AAA GGC AGC ATC TAC-3'
MMP-9	정방향	5'-AAT CTC TTC TAG AGA CTG GGA AGG AG-3
MMP-9	역방향	5'-AGC TGA TTG ACT AAA GTA GCT GGA-3'
IL-1β	FAM	5'-CTGTGTAATGAAAGACGGCACACCCACC-3'

상기 표 4의 mRNA 유전자 발현은 TaqMan 프로브 (FAM dye-labeled, ABi, USA)로 측정하였다. 내부 표준(internal standard)으로 마우스 GAPDH 프로브 세트를 사용하였고, Applied Biosystems (4352339E)의 내인성 제어(Endogenous Control)(VIC® /MGB Probe, Probe limited)를 사용하였고, 프라이머의 최종 농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. 실시간 정량 PCR의 조건은 pre-denaturation은 50 ℃에서 2 분; 94 ℃에서 10 분; 및 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 1분을 40 사이클(cycles)로 수행하였다. 실험군과 대조군은 내부 표준(internal standard)으로 GAPDH를 사용하였다. 타겟 그룹(target group)의 RQ (relative quantitative)는 정량적 PCR로 다음의 식 1을 이용하여 계산하였다. 각 약물 처리에 따른 MMP-2, MMP-9 및 IL-1β mRNA의 RQ 값을 계산한 뒤 UVB 만 조사한 음성 대조군에서의 각 mRNA 유전자 발현의 RQ값을 1로 했을 때 각 약물 처리군의 상대정량 값을 분석하여, 그 결과를 각각 도 4 내지 6에 나타내었다.

[식 1]

y = x(1+e)n

단, 상기 식 1에서, x = starting quantity, y = yield, n = number of cycles, e = efficiency에 해당한다.

도 4에서 보는 바와 같이, 정상군에 비하여 UVB를 조사한 대조군에서 주름 관련 유전자인 MMP-2 mRNA의 발현 수준이 유의성 있게 증가하였으나, 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군에서는 UVB만을 조사한 음성 대조군에 비하여 MMP-2 mRNA 유전자의 발현 수준이 유의성 있게 감소한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5에서 보는 바와 같이 주름 관련 또 다른 유전자인 MMP-9 mRNA 유전자 또한 정상군에 비해 UVB를 조사한 대조군에서 유의성 있게 증가하였다. 반면, 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군에서는 UVB만을 조사한 음성 대조군에 비하여 MMP-9 mRNA 유전자 발현이 유의성 있게 감소하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, HRM-2 마우스에 UVB를 조사하여 주름을 유도한 다음 5주째에 등 피부 조직을 분리하여 염증 관련 유전자인 IL-1β의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과, 정상 군에 비하여 UVB를 조사한 군에서 상기 IL-1β mRNA의 발현 수준이 유의적으로 증가하였지만, 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군에서는 정상 군과 동등한 수준으로 IL-1β mRNA의 발현 수준이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물을 처리하는 경우 UVB가 조사되어도 주름 또는 염증 관련 유전자의 발현 수준을 현저히 저감시켜 피부 광노화를 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

6. ELISA를 통한 주름 관련 단백질의 발현 수준 분석

지유 추출물 유래 지유글리코사이드 I가 광노화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 3.에서와 같이 HRM-2 마우스에 UVB 조사 5주 째에 마우스의 등 피부 조직 (dorsal skin tissue)을 채취하여 ELISA를 통해 주름 관련 단백질인 MMP-2 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로는 마우스용 MMP-2 ELISA 키트(R&D System, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 MMP-2 코팅 항체(antibody)를 마이크로웰(microwell)에 100 ㎕씩 분주하고 4℃에서 16시간 두었다. 이후 세척 버퍼(wash buffer)를 이용하여 웰을 세척한 뒤 각 웰당 검사 희석액(assay diluent)을 200 ㎕씩 첨가하여 1시간 동안 웰을 막은 후 실온에서 배양하였다. 표준품을 희석하고 상청액을 20배 희석한 후 마이크로플레이트(microplate)를 세척하고 각 표준품과 상청액을 100 ㎕씩 넣었으며 2시간 동안 웰을 막은 후 실온에서 배양하였다. 마이크로플레이트를 세척하고 작동 검출기(working detector)를 제조하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 1시간 동안 웰을 막은 후 실온에서 배양하였다. 마이크로플레이트를 세척하고 기질 용액(substrate solution)을 제조하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 30분 동안 어두운 곳에서 실온으로 배양하였다. 정지 용액(Stop solution)을 각 웰에 50 ㎕씩 넣고 마이크로플레이트 분광 광도계(spectrophotometer)에서 흡광도 450㎚로 측정하였다. 이와 같이 측정된 MMP-2 단백질의 발현 수준을 도 7에 그래프로 나타내었다.

도 7에서 보는 바와 같이, 정상 군에 비하여 UVB를 조사한 대조군에서 MMP-2 단백질의 발현 수준이 40배 이상 현저히 증가하였다. 하지만, 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군에서는 UVB를 조사한 대조군에 비하여 MMP-2 단백질의 발현이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물을 처리하는 경우 UVB가 조사되어도 주름 관련 단백질의 발현 수준을 현저히 저감시켜 피부 광노화를 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

7. 멜라닌 생성 정도 및 색소 침착 정도의 분석

HRM-2 마우스의 등을 세로로 2 부위로 나눈 뒤, 왼쪽 부위는 무처리, 오른쪽 부위는 상기 2.에서 제조한 지유글리코사이드 I를 포함하는 크림 제형의 화장료 조성물(이하, ‘SO’라 한다.) 200 μL/mouse를 도포한 뒤 상기 3.과 동일한 방법으로 UVB를 조사하였다. 단, 음성 대조군으로는 오른쪽 부위에 연고 기제(base ointment)를 도포하였다. 이후 UVB가 조사되어 색소 침착이 유발된 등 피부를 육안적으로 관찰하기 위하여 실험 시작 후 1주차(1차), 3주차(2차), 5주차(3차)에 총 3회 실험동물 피부의 착색 상태를 용매 대조군 도포 부위와 시료군 도포 부위를 비교하여 상대적인 미백 효과를 관찰하였고, 쥐를 에테르로 마취한 후 피부 표면 상태를 디지털 카메라 (D70 model, Nikon, Tokyo, Japan)로 촬영하고, 이미지 분석 소프트웨어(image analysis software) (Bio-Rad, USA)를 이용하여 촬영된 사진을 분석하였다. 전체 등 부위 중 멜라닌 생성 정도를 비교하기 위하여 아무 처리하지 않은 왼쪽 부위와 각 시료를 도포한 오른쪽 부위를 구분하였으며 왼쪽 부위의 색소 침착의 면적과 오른쪽 부위의 색소 침착 면적의 차로부터 멜라닌 생성량 또는 색소 침착 정도를 분석하였다. 단, 1주차(1차), 3주차(2차) 및 5주차(3차) 각각에서 정상 군, 연고 기제를 도포한 음성 대조군 및 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물을 처리한 실시예 군에서 마우스 등 피부의 사진과, 색소 침착의 정도를 이미지 분석한 그래프를 도 8 내지 22에 나타내었다.

도 8 내지 12에서 보는 바와 같이, 1주차(1차)에는 정상 군과, 연고 기제를 도포한 뒤 UVB 만을 조사한 군 및 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 뒤 UVB를 조사한 군에서 마우스 등의 왼쪽 부위와 오른쪽 부위의 색소 침착 정도에 큰 차이를 보이지 않았으며, 각 군 별로도 큰 차이를 나타내지 않았다.

하지만 도 13 내지 17에서 보는 바와 같이, 3주 차(2차)에서는 육안으로 보더라도 정상 군에 비하여 UVB를 조사한 대조군에서 멜라닌 생성이 증가하여 색소 침착이 발생한 것을 확인할 수 있었다. 다만, 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군의 오른쪽 부위는 무처리한 왼쪽 부위에 비하여 멜라닌 생성이 감소하여 색소 침착 정도 또한 낮아진 것을 확인할 수 있었다.

더욱이, 도 18 내지 22에서 보는 바와 같이, 5주차(3차)에서는 정상 군의 오른쪽 부위에 비하여 연고 기재를 도포한 뒤 UVB를 조사한 음성 대조군의 오른쪽 부위에서 멜라닌 생성 정도가 현저히 증가하여 색소 침착 정도도 유의성 있게 증가하였다. 하지만, 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군의 오른쪽 부위는 무처리한 왼쪽 부위에 비하여 멜라닌 생성이 현저히 감소하여 색소 침착 정도 또한 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물을 처리하는 경우 UVB가 조사되어도 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백을 개선시키는 효과가 있으며, 더 나아가서는 과색소침착에 기인한 색소 질환 또한 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

8. 피부 주름 개선 효과 분석

상기 7.의 실험 후 마우스 등 피부의 주름 개선 효과를 관찰하기 위하여, 실험 시작 후 3주차, 4주차 및 5주차에서 마우스를 에틸 에터(ethyl ether)로 잠시 마취한 후 skin dermobella 3D 분석기를 이용하여 피부 주름 깊이를 측정하여 그 결과를 도 23에 그래프로 나타내었다. 또한, 마우스의 전체 등 중 각 시료를 도포하였던 오른쪽 부위의 피부를 USB 디지털 현미경(x400, CE FOROHS, china)으로 400배 확대 촬영하여 피부 주름의 변화를 검경하였다. 단, UVB 조사 3주차, 4주차 및 5주차 각각에서 정상 군, 연고 기제를 도포한 음성 대조군 및 본 발명에 따른 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물을 처리한 실시예 군에서 마우스의 오른쪽 등 피부 사진을 도 24 내지 32에 나타내었다.

도 23 내지 32에서 보는 바와 같이, 정상 군에 비하여 UVB를 조사한 대조군에서 UVB 광노화로 인하여 피부 주름의 깊이가 현저히 깊어진 것을 볼 수 있었다. 하지만, 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군의 경우 연고 기제를 도포한 음성 대조군에 비하여 피부 주름의 깊이가 현저히 얕아진 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물을 처리하는 경우 UVB가 조사되어도 주름 형성을 억제하고 피부 광노화를 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

9. 피부의 조직학적 관찰

상기 7.의 실험 시작 후 5주 차에 각 실험군에서 적출한 피부 조직을 10 % 포르말린 용액에 48시간 정도 고정한 뒤, 카세트에 들어갈 만한 적당한 크기로 절단하여 카세트에 넣고 라벨링(labeling) 하였다. 조직처리기 (Thermo Shandon Ltd./Thermo Fisher Scientific, England)를 이용하여 이들 조직을 알코올 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 및 100 %에 각각 1 ~ 2시간정도 처리한 후 자일렌(xylene)으로 4시간 처리하고, 파라핀에서 4시간 처리하였다. 고정된 조직은 Paraffin Embedding Station (LEICA MICROSYSTEMS NUSSLOCH GMBH, Germany)을 사용하여 임베딩(embedding)한 후 냉동실에서 하루 정도 보관하고 Rotary Microtome (LEICA MICROSYSTEMS NUSSLOCH GMBH, Germany)을 사용하여 블록(block)을 박절하였다. 박절된 조직은 H&E staining을 실시하기 위하여 자일렌에 3분씩 3번, 알코올 100 %에 각각 2분, 1분, 알코올 95 %, 80 %, 70 %에 각 1분 30초 담근 후에 물로 1분 세척하고, 헤마톡실린(hematoxylin)에 1분, 10 % 스콧 탭 워터(scott's tap water)에 1분, 에오신(eosin)에 3분 동안 처리하여 염색을 하였다. 염색된 조직은 다시 알코올 70 %, 80 %, 95 %, 100 %에 순서대로 처리하여 탈수시킨 후 자일렌에 3분씩 3번 처리하였다. 슬라이드를 건조 후 캐나다 발삼(Canada balsam)과 자일렌을 이용하여 퍼마운팅(permounting)을 실시한 후 현미경을 이용하여 상피 조직의 두께를 측정해 그 결과를 도 33에 나타내었다. 또한, 전반적인 피부 조직의 변화를 관찰하기 위하여 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin) 용액에 옮겨 5 분간 핵을 염색한 후 흐르는 물에 수세하고 1 % HCl-알코올 용액으로 3 회 침적 후 충분히 수세하여 1 % 암모늄(ammonium) 용액으로 청색화 하고 에오신(eosin) 용액에 3 분간 세포질을 염색한 후 80 % 알코올로 이동하였으며 95 % 및 100 % 알코올을 사용하여 탈수시켰다. 이와 같은 H&E 염색 후 피부 조직 단면을 촬영한 사진을 도 34 내지 36에 나타내었다. 또한 다른 조직 슬라이드는 피부 표피층에서 콜라겐 침착을 관찰하기 위하여 마쓴 트리콤(Masson's trichrome) 염색을 실시하였다. 청명 과정을 거친 후 캐나다 발삼으로 봉입 후 현미경으로 검경하였다. 이와 같이 마쓴 트리콤 염색 후 피부 조직의 단면을 촬영한 사진을 도 37 내지 39에 나타내었다.

도 33 내지 36에 나타낸 바와 같이, 정상 군에 비하여 UVB를 조사한 대조군에서 상피 조직의 두께가 두꺼워졌지만, 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군의 경우 상피 조직의 두께가 음성 대조군에 비하여 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 37 내지 39에서 보는 바와 같이, 마쓴 트리콤(M-T) 염색을 통해 콜라겐 섬유 변화를 측정한 결과 정상 군에 비하여 UVB를 조사한 대조군에서는 M-T 염색 강도가 감소된 것으로 보아 콜라겐 섬유의 분해가 진행되어 주름 형성이 가속된 것을 알 수 있었다. 반면, 본 발명에 따라 지유글리코사이드 I를 포함하는 화장료 조성물(SO)을 도포한 군의 경우 음성 대조군에 비하여 M-T 염색 강도가 증가하여 콜라겐 섬유의 합성이 현저히 증가하였고, 이는 즉 주름이 개선되었음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

지유(Sanguisorba officinalis Linne) 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 피부 노화의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지유 추출물은 지유를 극성 용매 또는 비극성 용매의 추출 용매로 추출하여 얻어진 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지유 추출물은 지유의 뿌리, 줄기, 잎, 종자 및 열매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 부위를 추출하여 얻어진 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지유 추출물 또는 분획물은 지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 포함하는, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 노화는 피부 광노화(photo-aging)인, 약학 조성물.
지유(Sanguisorba officinalis Linne) 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 피부 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제6항에 있어서,
상기 지유 추출물은 지유를 극성 용매 또는 비극성 용매의 추출 용매로 추출하여 얻어진 것인, 화장료 조성물.
제6항에 있어서,
상기 지유 추출물은 지유의 뿌리, 줄기, 잎, 종자 및 열매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 부위를 추출하여 얻어진 것인, 화장료 조성물.
제6항에 있어서,
상기 지유 추출물 또는 분획물은 지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 포함하는, 화장료 조성물.
제6항에 있어서,
상기 피부 노화는 피부 광노화(photo-aging)인, 화장료 조성물.
지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 유효 성분으로 포함하는 피부 노화의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 유효 성분으로 포함하는 피부 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
지유 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 유효 성분으로 포함하는 피부 주름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
지유 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
지유 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로 포함하는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제17항에 있어서,
상기 과다색소침착에 기인한 색소 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 잡티, 모반 또는 일광흑색증(solar lentigines)인, 약학 조성물.
지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ)를 유효 성분으로 포함하는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.