KR20220082192A - 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물은 천연 물질로 구성되어 피부에 안전하고, 우수한 피부미백 및 피부주름 개선 효과를 갖는다. 보다 구체적으로는 본 발명의 조성물은 멜라닌 합성 및 티로시나제 활성을 저해하여 피부미백에 효과적으로 작용하며, 피부주름의 생성에 직접적으로 작용하는 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하고, 콜라겐 단백질의 발현을 증가시켜 피부주름의 예방 및 개선에 효과적으로 작용한다.

Description

오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for anti-oxidation, skin whitening, and improving of skin wrinkle containing Sanguisorba officinalis extract}
본 발명은 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
최근 천연물 유래의 화장품에 관한 관심이 점점 커지고 있다. 또한 기능성 화장품에 대한 요구가 증가하면서 기능성 성분으로 사용되는 각종 화학성분들로 인하여 오히려 피부의 보호능력이나 재생능력이 저하되는 문제가 발생하고 있다. 이에 따라 스킨, 로션을 비롯해 색조 화장품에 이르기까지 천연물 소재의 화장품을 직접 만들어 사용하는 것이 유행하고 있기도 하다. 아토피 등의 피부질환을 가지고 있거나, 민감성 피부를 가진 사람들의 경우에는 피부 자극을 최소화하면서 피부 개선활성이 우수한 천연물 유래의 화장품에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다.
본 발명자들은 독성이 없고 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 우수한 천연소재에 대하여 연구를 수행하였으며, 오이풀 추출물이 우수한 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과를 나타낸다는 사실을 발견하였다. 또한, 상기 오이풀 추출물에 대한 연구를 계속하던 중, 오이풀을 겨우살이, 비타민나무열매, 오미자, 토마토 및 메밀과의 복합 추출물로 이용하는 경우 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 더욱 좋아질 뿐만 아니라 우수한 항산화 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-1020536 B KR 10-2133074 B
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 추출물은 열수 추출물, 초음파 추출물 또는 락토바실러스속 유산균 발효물의 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 추출물은 오이풀에 자외선 UVB를 350 ~ 1000 mJ/cm2로 조사한 후 추출한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 상기 추출물을 5 내지 200 ㎍/mL 농도로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물이 1 : 0.5-2.0 : 0.5-2.0 : 0.1-1.5 : 0.05-1.0 : 0.05-1.0의 중량비로 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 상기 추출물 총 중량에 대하여 5 내지 15 중량부의 울금 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 화장료 조성물은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장 연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더 및 메이크업 제거제 중에서 선택되는 제형일 수 있다.
본 발명에 따른 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물은 천연 물질로 구성되어 피부에 안전하고, 우수한 피부미백 및 피부주름 개선 효과를 갖는다. 보다 구체적으로는 본 발명의 조성물은 멜라닌 합성 및 티로시나제 활성을 저해하여 피부미백에 효과적으로 작용하며, 피부주름의 생성에 직접적으로 작용하는 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하고, 콜라겐 단백질의 발현을 증가시켜 피부주름의 예방 및 개선에 효과적으로 작용한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 오이풀(Sanguisorba officinalis L.)은 쌍떡잎식물 이판화군 장미목 장미과의 여러해살이풀로 잎을 자르면 상큼한 오이냄새가 나기 때문에 오이풀이라고 한다. 굵은 뿌리줄기에서 갈라진 뿌리는 양끝이 뾰족한 원기둥 모양으로 굵어지고 원대는 곧게 1m 정도 자라며 위에서 가지가 갈라진다. 잎은 마디마다 서로 어긋나게 자리하고 있으며 깃털 모양의 겹잎으로 홀수의 잎 조각을 가진다. 일반적으로 잎은 길쭉한 타원형으로 생겼고 끝이 무디며 가장자리에 거친 톱니를 가진다. 꽃은 7~9월에 피고 검붉은색이며 수상꽃차례에 달린다. 꽃이삭은 타원형 또는 거꾸로 선 달걀모양의 타원형이며 위에서부터 꽃이 피기 시작한다. 열매는 수과로 10월에 익고 사각형이며 꽃받침으로 싸여 있다.
상기 오이풀 추출물은 오이풀의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 부위를 추출한 추출물일 수 있고, 오이풀의 뿌리를 추출한 것이 가장 바람직하며, 상기 오이풀의 뿌리는 지유로 지칭할 수 있다.
상기 오이풀 추출물은 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출, 발효 후 추출 및 초음파 추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용하여 추출한 것일 수 있으나, 열수 추출, 초음파 추출 및 발효 후 추출 중에서 선택되는 하나의 방법을 이용하여 추출한 것이 효능 면에서 바람직하다.
상기 오이풀은 추출용매와 1 : 10 내지 30, 바람직하게는 1 : 15 내지 25, 더욱 바람직하게는 1 : 18 내지 22의 중량비로 혼합하여 추출하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 상기 오이풀 열수 추출물은 추출 용매로서 40 ℃ 내지 100 ℃의 열수를 사용할 수 있고, 바람직하게는 65 내지 95 ℃의 열수를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 85 내지 95 ℃의 열수를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 추출시간은 1 내지 50 시간인 것이 바람직하며, 구체적으로 2 내지 20 시간이 더욱 바람직하고, 보다 구체적으로 2 내지 10 시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 오이풀과 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 오이풀의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
그리고, 상기 오이풀 초음파 추출물은 추출 용매로서 물, C1 내지 C4 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하여 초음파 추출한 것일 수 있다. 상기 저급알코올로는 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올을 들 수 있다. 상기 초음파 추출물의 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 60 내지 80%의 에탄올 수용액으로 추출된 초음파 추출물이 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선에 바람직하게 작용한다.
또한, 상기 오이풀 발효물의 추출물은 오이풀 발효물을 원심분리한 후 얻은 상등액, 또는 오이풀 발효물에 추출 용매를 가한 후 추출한 추출물일 수 있으나, 오이풀 발효물을 원심분리한 후 얻은 상등액인 것이 효능 면에서 더욱 바람직하다. 상기 오이풀 발효물은 오이풀 또는 오이풀 추출물을 유산균으로 발효하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 람노서스 HK-9(기탁번호: KCCM11254P)로 발효시켜 수득할 수 있다. 구체적으로, 상기 오이풀 발효물은 락토바실러스 람노서스 HK-9를 적정한 양, 예를 들면 1 × 108 내지 5 × 109 cfu/mL 농도로 접종한 후, 25 내지 45 ℃에서 36 내지 60 시간 동안, 바람직하게는 30 내지 40 ℃에서 40 내지 55 시간 동안 발효시켜 수득한 것일 수 있다.
본 명세서에서 오이풀을 언급하면서 사용되는 용어 "추출물"은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 오이풀 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 오이풀 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 오이풀 추출물은 오이풀에 자외선 UVB를 350 ~ 1000 mJ/cm2, 바람직하게는 600 내지 950 mJ/cm2, 더욱 바람직하게는 800 내지 900 mJ/cm2로 조사한 후 추출한 추출물일 수 있다. 오이풀을 상기 범위의 조사량으로 자외선 UVB 조사한 후 추출하는 경우 오이풀 추출물의 피부미백 및 피부주름 개선 효능이 더욱 좋아진다. 만약, 상기 자외선 UVB의 조사량이 상기 하한치 미만인 경우에는 자외선 조사의 효과가 미미해지고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 오이풀 추출물의 피부미백 및 피부주름 개선 효능이 오히려 감소할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함하는"이란 오이풀 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 화장료 조성물은 상기 오이풀 추출물을 5 내지 200 ㎍/mL, 바람직하게는 5 내지 100 ㎍/mL, 더욱 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/mL, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 ㎍/mL 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 오이풀 추출물의 농도가 상기 하한치 미만인 경우에는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 원하는 정도로 나타나지 않을 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 농도가 증가하는 만큼 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 증가하지 않거나 독성이 있을 수 있어 바람직하지 않다. 한편, 인 비트로 실험 결과, 본 발명의 오이풀 추출물의 농도가 상기 범위인 경우에는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선에 대하여 유의적인 효과가 나타나면서도 세포독성 등의 부작용이 나타나지 않았다.
본 발명의 화장료 조성물은 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하여 미백 효과를 발휘할 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 오이풀 추출물로부터 유래한 미백 활성 성분을 유효성분으로 포함하므로, 현저한 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내어 멜라닌 생합성 억제 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 피부주름은 광노화 또는 자연노화에 의한 것일 수 있고, 광노화에 의한 것이 보다 바람직하며, UV 노출에 의한 광노화인 것이 더욱 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 피부주름은 MMP 효소의 활성을 기반으로 하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, UV 노출 후 피부의 주요 구성물질인 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP의 발현 및 활성 증가로 인하여 피부주름 생성이 촉진된다.
또한, 상기 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키고, MMP-1 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 상기 오이풀 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 콜라겐 분해를 촉진시키는 기질 단백질 분해효소-1(matrix metallo-proteinase)의 발현을 억제시키면서, 타입 Ⅰ 프로콜라겐의 생성을 증가시키는바, 피부 탄력 증가, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과 등을 가질 수 있다. 즉, 피부주름의 예방 또는 개선의 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 피부주름 개선용 화장료 조성물에 포함된 오이풀 추출물은 그 자체로 피부주름을 제거하는 효과가 있으며, 기존에 알려진 피부 주름 개선에 효과가 있다고 공지된 물질들과 혼합하여 사용하는 경우에도 피부 주름의 예방 또는 개선 효과를 지속적으로 유지할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 화장료 조성물은 상기 오이풀 추출물 외에 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 더 포함하는 혼합 추출물을 유효성분으로 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "혼합 추출물"은 1) 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물의 혼합 형태, 또는 2) 오이풀, 겨우살이, 비타민나무열매, 오미자, 토마토 및 메밀을 먼저 혼합한 후 이를 추출한 형태를 의미한다. 상기 혼합 추출물은 상기 1) 번과 같이 각각의 추출물을 따로 제조한 후 혼합하여 제조하는 것이 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효능 면에서 더욱 바람직하다. 상기 각각의 추출물은 상기 오이풀 추출물과 동일한 방법으로 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물의 혼합 추출물은 추출물들 간의, 및/또는 추출물 내 유효성분들 간의 상승효과 또는 협업작용에 의하여 상기 각각의 식물의 단독 추출물에 비해 더욱 강력한 피부미백 및 피부주름 효능이 있음을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 화장료 조성물은 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물이 1 : 0.5-2.0 : 0.5-2.0 : 0.1-1.5 : 0.05-1.0 : 0.05-1.0의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.5-1.5 : 0.5-1.5 : 0.1-1.0 : 0.1-0.5 : 0.1-0.5의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.7-1.3 : 0.7-1.3 : 0.3-0.7 : 0.1-0.4 : 0.1-0.4의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.8-1.2 : 0.8-1.2 : 0.4-0.6 : 0.2-0.3 : 0.2-0.3의 중량비로 포함된 것일 수 있다. 각 추출물의 중량비가 상기 범위일 때 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물의 병용에 따른 상승효과를 극대화할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물은 효과적인 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효능을 제공하기에 바람직한 임의의 함량으로 조성물에 존재할 수 있다. 일 양태에 따르면, 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물은 5 내지 200 ㎍/mL, 바람직하게는 5 내지 100 ㎍/mL, 더욱 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/mL, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 ㎍/mL 농도로 포함될 수 있다. 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물의 함량이 상기 범위의 미만인 경우에는 상기 혼합 추출물에 의한 효과를 기대하기 어려우며, 상기 범위를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미미할 뿐만 아니라, 제형의 안정성이 저하되는 문제가 있다. 즉, 본 발명의 혼합 추출물이 조성물 내에 상기 범위로 포함됨으로써, 우수한 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과를 구현할 수 있고 제형 및 제품 안정성을 가지며 경제성 면에서도 최적의 함량으로 우수한 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 혼합 추출물 총 중량에 대하여 5 내지 15 중량부의 울금 추출물을 더 포함할 수 있다. 상기 울금 추출물이 상기 혼합 추출물 총 중량에 대하여 상기 중량비로 포함될 때, 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 더욱 좋아진다. 상기 혼합 추출물에 대한 울금 추출물의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 울금 추출물의 첨가로 인한 효과가 미미해지고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 울금 추출물의 첨가로 인해 증가하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 오히려 낮아지는 문제점이 있다. 상기 울금 추출물은 특별히 제한되지는 않으나 오이풀 추출물과 동일한 방법으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물의 제형은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장 연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더 및 메이크업 제거제로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물은 상기 오이풀 추출물 또는 오이풀 추출물 함유 혼합 추출물 이외에 피부학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 보습제는 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 솔비톨, 헥실렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 디글리세린, 1,2-헥산디올, 판테놀, 베타인, 스쿠알란, 바셀린, 유동파라핀 및 하이드롤라이즈드 밀 글루텐 중 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1-1: 오이풀 추출물의 제조 - 초음파 추출
오이풀의 뿌리(지유)를 잘 분쇄한 오이풀 분말을 준비하였다.
오이풀 분말과 70% 에탄올 수용액을 1 : 20의 중량비로 혼합한 후 80 ℃에서 초음파추출기(내추럴솔루션; 120 kHz/30 min)로 3 시간 동안 추출하여 오이풀 에탄올 초음파 추출물을 수득하였다. 상기 수득된 추출물은 여과 및 감압 농축을 거쳐 동결건조로 분말화하였다.
실시예 1-2: 오이풀 추출물의 제조 - 초음파 추출+자외선 조사
실시예 1-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 오이풀 분말을 자외선 처리를 위한 용기(350*255*40 ㎜)에 넣은 후 자외선 조사 장치(HD 2102.1, 2102.2, Delta OHM, 이탈리아)를 이용하여 용기 상단부에 자외선 UVB(300 nm)를 조사하였으며, 조사량이 100 mJ/㎡를 경과할 때마다 상기 용기를 뒤집어가며 혼합하였다. 이후, 총 자외선 UVB 조사량이 900 mJ/cm2이 되었을 때 자외선 조사를 중단하였다.
실시예 2-1: 오이풀 추출물의 제조 - 열수 추출
오이풀의 뿌리(지유)를 잘 분쇄한 오이풀 분말을 준비하였다.
오이풀 분말과 정제수를 1 : 20의 중량비로 혼합한 후 90 ℃에서 3시간 동안 추출하여 오이풀 열수 추출물을 수득하였다. 상기 수득된 추출물은 여과 및 감압 농축을 거쳐 동결건조로 분말화하였다.
실시예 2-2: 오이풀 추출물의 제조 - 열수 추출+자외선 조사
실시예 2-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 3-1: 오이풀 추출물 제조 - 발효 추출
오이풀의 뿌리(지유)를 잘 분쇄한 오이풀 분말을 준비하였다.
그리고, 한국미생물보존센터로부터 수득한 락토바실러스 람노서스 HK-9(기탁번호: KCCM11254P)를 55%의 MRS 배지와 0.5% L-Cysteine hydrochloride를 첨가하여 제조한 배지가 있는 진탕항온배양기에 넣고, 50~60 rpm, 37 ℃에서 48 시간 동안 전배양하였다.
2L 플라스크에 55% MRS 배지로 만든 유산균 배양 배지 1L 및 오이풀 분말 100g을 첨가하고, 상기 전배양된 3 × 109 cells/㎖ 농도의 락토바실러스 람노서스 HK-9 배양액을 5(v/v)% 접종한 후 37 ℃에서 48 시간 동안 발효하였다.
상기 발효물을 3,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 상등액을 취한 후 0.25 μM 여과지를 이용하여 여과하여 본 발명에 사용하였다.
실시예 3-2: 오이풀 추출물 제조 - 발효 추출+자외선 조사
실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 4-1: 오이풀 혼합 추출물의 제조 - 초음파 추출
실시예 1-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 추출물과 동일한 방법으로 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 각각 추가하여 제조한 후, 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 1 : 1 : 1 : 0.5 : 0.25 : 0.25의 중량비로 혼합하여 오이풀 혼합 추출물을 제조하였다.
실시예 4-2: 오이풀 혼합 추출물의 제조 - 초음파 추출+자외선 조사
실시예 4-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 5-1: 오이풀 혼합 추출물의 제조 - 열수 추출
실시예 1-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 추출물과 동일한 방법으로 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 각각 추가하여 제조한 후, 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 1 : 1 : 1 : 0.5 : 0.25 : 0.25의 중량비로 혼합하여 오이풀 혼합 추출물을 제조하였다.
실시예 5-2: 오이풀 혼합 추출물의 제조 - 열수 추출
실시예 5-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 6-1: 오이풀 혼합 추출물의 제조 - 발효 추출
실시예 1-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 추출물과 동일한 방법으로 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 각각 추가하여 제조한 후, 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 1 : 1 : 1 : 0.5 : 0.25 : 0.25의 중량비로 혼합하여 오이풀 혼합 추출물을 제조하였다.
실시예 6-2: 오이풀 혼합 추출물의 제조 - 발효 추출+자외선 조사
실시예 6-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 7-1: 오이풀 혼합 추출물(+울금)의 제조 - 초음파 추출
실시예 4-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 추출물과 동일한 방법으로 울금 추출물을 추가하여 제조한 후, 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물의 혼합 추출물 100 중량부에 대하여 10 중량부의 울금 추출물을 혼합하여 오이풀 혼합 추출물을 제조하였다.
실시예 7-2: 오이풀 혼합 추출물(+울금)의 제조 - 초음파 추출+자외선 조사
실시예 7-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 8-1: 오이풀 혼합 추출물(+울금)의 제조 - 열수 추출
실시예 5-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 추출물과 동일한 방법으로 울금 추출물을 추가하여 제조한 후, 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물의 혼합 추출물 100 중량부에 대하여 10 중량부의 울금 추출물을 혼합하여 오이풀 혼합 추출물을 제조하였다.
실시예 8-2: 오이풀 혼합 추출물(+울금)의 제조 - 열수 추출+자외선 조사
실시예 8-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 9-1: 오이풀 혼합 추출물(+울금)의 제조 - 발효 추출
실시예 6-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 추출물과 동일한 방법으로 울금 추출물을 추가하여 제조한 후, 상기 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물의 혼합 추출물 100 중량부에 대하여 10 중량부의 울금 추출물을 혼합하여 오이풀 혼합 추출물을 제조하였다.
실시예 9-2: 오이풀 혼합 추출물(+울금)의 제조 - 발효 추출+자외선 조사
실시예 9-1과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 오이풀 분말은 추출 전에 자외선 조사를 수행하여 오이풀 추출물을 제조하였다.
상기 자외선 조사는 실시예 1-2와 동일한 방법으로 실시하였다.
<시험예>
통계 처리
모든 통계 분석은 SPSS 버전 18.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었다. Duncan의 post-hoc test를 이용한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 실험군 간의 평균값의 차이(p <0.05)를 결정하였다. 하기 실험은 각각 적어도 3번 이상 반복하였으며, 각각의 실험데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시하였다.
시험예 1: MTT assay를 이용한 세포독성 평가
세포 독성은 MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)환원 방법을 이용하여 측정하였다.
배양된 HaCaT 세포를 DMEM 배지에 잘 혼합한 후 1x105 cells/mL로 조정한 다음, 24-well 배양판에 준비된 세포를 1 mL씩 첨가한 후 3-4일 배양하였다. 세포가 80% 정도 성장했을 때 우태아 혈청과 항생제를 첨가하지 않은 배지에 다양한 농도의 시료(50, 100, 200 및 500 ㎍/mL)로 처리한 후, 24시간 더 배양을 하고, 배양이 끝난 세포의 생존율은 MTT 환원 방법을 이용하여 측정하였다.
각 well에 MTT 용액(5 mg/mL)을 성장배지 부피의 10분의 1 가량 가한 후, 다시 37 ℃에서 4시간 더 배양하였다. 그리고, MTT를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 따라 나가지 않도록 조심하며 배지를 제거하고, 남아 있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후 DMSO를 이용하여 시료를 용해시킨 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 하기 수학식 1과 같이 계산한 후, 하기 표 1에 나타내었다.
[수학식 1]
세포 생존율(%) = (시료처리군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) × 100
구분 세포 생존율(%)
시료 처리농도(㎍/mL)
10 50 100 200 500
대조군 (무처리군) 100
실시예 1-1 113.1 132.3 116.5 99.7 94.9
실시예 1-2 121.2 141.4 123.1 110.3 98.6
실시예 2-1 108.6 124.5 110.2 101.2 95.4
실시예 3-1 108.7 126.1 109.9 102.4 95.8
실시예 4-1 115.5 136.4 112.7 103.4 96.3
실시예 5-1 105.7 123.5 106.3 98.7 89.5
실시예 6-1 102.1 120.7 108.4 101.6 93.4
실시예 7-1 109.4 126.8 107.6 103.2 95.6
실시예 8-1 102.6 122.1 101.7 97.6 91.2
실시예 9-1 115.2 137.5 111.0 105.1 94.5
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 시료는 인간 피부에 안전하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
시험예 2: 항산화 활성
2-1: DPPH 라디칼 소거능
시험물질을 증류수에 녹인 후, 다양한 농도로 희석한 시험액을 준비하였다.
96-well plate에 다양한 농도로 희석한 시험액 100 μL와 0.15 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액 100 μL을 넣고 혼합하여 실온에 30분간 반응시킨 후 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 유리 라디칼의 제거 활성을 나타냈으며, 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다. DPPH radical 소거능은 아래의 식으로 산출하였고, SC50값은 각 농도별 radical 소거능에 대한 검량선에서 radical 소거능이 50%가 되는 농도를 계산하여 하기 표 2에 나타내었다. 참고로, 양성대조군인 Ascorbic acid의 경우 DPPH 라디칼 소거능(%)이 6.25, 12.5 및 25 ㎍/mL 농도에서 각각 15.8±1.9%, 60.9±1.9% 및 83.4±0.8%이었고, SC50은 11.7±0.4 ㎍/mL이었다.
[수학식 2]
DPPH 라디칼 소거능(%) = (1-A/B) x 100
(A: 시료 첨가구의 흡광도, B: 무처리구의 흡광도)
구분 DPPH 라디칼 소거능(%) SC50
(㎍/mL)
시료 처리농도(㎍/mL)
7.8 15.6 31.2 62.5 125
대조군 (무처리군) 100
실시예 1 1-1 27.7±2.5 59.5±0.8 76.1±1.3 78.4±0.9 78.8±0.3 13.5±0.4
1-2 36.8±2.4 67.9±1.2 83.6±0.9 85.3±1.6 87.5±1.7 10.6±1.1
실시예 2 2-1 22.8±1.0 55.4±1.7 69.1±0.2 77.5±1.1 79.9±0.7 15.1±0.4
2-2 30.2±1.3 61.6±1.5 74.3±1.1 80.6±1.2 83.2±2.6 14.3±1.2
실시예 3 3-1 - - 6.9±0.6 31.9±1.3 65.3±0.9 92.4±3.6
3-2 9.2±2.3 14.6±0.9 21.6±1.4 45.3±2.1 77.5±1.3 65.2±2.7
실시예 4 4-1 42.2±1.2 63.6±3.1 81.2±0.6 83.9±3.5 85.4±2.4 8.8±1.3
4-2 50.1±0.6 70.3±2.2 86.6±3.1 89.4±2.6 91.6±1.0 7.8±0.2
실시예 5 5-1 37.3±3.6 58.9±0.6 75.8±2.3 81.7±2.9 86.1±1.2 14.8±2.2
5-2 45.2±1.4 64.3±3.5 80.7±1.9 84.1±0.8 90.4±1.3 8.6±0.3
실시예 6 6-1 19.6±1.2 36.5±1.5 47.6±3.1 70.8±3.2 77.2±2.9 32.4±1.4
6-2 26.5±1.7 47.3±1.4 53.4±2.7 77.6±2.6 86.3±3.2 30.1±0.6
실시예 7 7-1 48.2±3.6 69.8±4.0 86.3±2.4 89.6±1.2 92.7±2.3 8.0±0.7
7-2 53.6±1.5 74.3±2.8 89.1±0.3 91.4±1.9 93.6±1.1 7.5±3.2
실시예 8 8-1 43.1±2.9 64.1±2.3 78.6±1.2 85.2±1.6 89.6±2.6 8.7±1.1
8-2 48.3±2.2 69.4±2.0 83.4±0.7 89.2±1.2 91.4±2.1 8.0±1.3
실시예 9 9-1 25.4±0.6 44.8±0.8 61.7±2.2 75.3±1.8 81.1±2.0 16.9±2.3
9-2 31.9±1.7 50.7±0.3 67.2±1.8 80.2±0.6 85.4±1.5 15.5±2.1
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 추출물이 우수한 항산화 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3: 미백 효과
3-1: 티로시나제 활성 저해능
Tyrosine을 수산화 (hydroxylation)하여 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)로 변화하는 tyrosinase의 tyrosine hydroxylase 활성 저해능을 평가하였다. 시험물질을 증류수로 녹이고 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5)에 희석하여 다양한 농도의 시험액을 각각 준비하였다. 96-well plate에 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) 170 μL, 다양한 농도로 희석한 시험액 10 μL, 2000 unit/mL mushroom tyrosinase 10 μL 및 1.5 mM L-tyrosine 10 μL를 순차적으로 넣은 후 혼합하여 37℃에서 15분 동안 반응시킨 후 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 공시험액의 흡광도는 시험액 대신 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5)를 넣어 동일한 방법으로 반응하여 측정하였다. 티로시나제 효소 활성 억제율은 아래의 식으로 산출하여 하기 표 3에 나타내었다.
[수학식 3]
효소 활성 억제율 (%) = {(A-B)/A} x 100
(A: 공시험액의 반응 후 흡광도, B: 시험액의 반응 후 흡광도)
구분 티로시나제 활성 억제율(%)
시료 처리농도(㎍/mL)
5 10 15 20
대조군 (무처리군) 100
실시예 1 1-1 73.3±3.0 61.1±0.5 93.5±1.3 98.5±1.3
1-2 77.4±1.5 65.2±1.3 96.2±1.0 98.7±0.5
실시예 2 2-1 62.9±4.2 61.6±1.2 87.6±0.6 97.7±1.0
2-2 67.5±2.6 66.2±0.7 90.4±1.1 98.3±1.2
실시예 3 3-1 - - - 25.2±0.6
3-2 3.7±0.2 6.8±0.4 11.5±0.5 32.1±2.4
실시예 4 4-1 79.5±2.3 72.2±1.5 96.3±2.7 99.6±0.5
4-2 83.6±1.2 75.4±0.8 97.5±1.9 99.5±0.1
실시예 5 5-1 67.5±2.0 65.3±0.7 91.1±0.5 98.5±0.6
5-2 71.2±1.9 69.5±1.3 94.5±0.8 99.4±0.3
실시예 6 6-1 14.3±1.3 19.5±2.2 27.7±2.6 45.6±1.9
6-2 18.5±1.9 25.6±0.9 33.4±1.2 52.8±2.1
실시예 7 7-1 83.4±1.7 75.4±1.2 97.5±0.8 99.7±0.2
7-2 87.2±1.6 81.5±2.7 98.1±0.5 99.2±0.1
실시예 8 8-1 71.6±1.0 69.5±2.1 93.4±0.7 98.8±0.2
8-2 74.5±1.1 72.7±0.8 95.1±0.6 99.1±0.4
실시예 9 9-1 19.3±0.6 25.3±1.7 33.3±0.2 51.4±2.1
9-2 24.2±0.4 29.4±0.6 37.8±2.1 56.3±3.0
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 추출물의 티로시나제 억제 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
3-2: 멜라민 합성 저해능
B16F10 세포 배양
생쥐에서 유래한 흑색종 세포인 B16F10 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco-Invitrogen, carlabad, CA, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 세포배양액을 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
B16F10 세포에서 생성된 melanin 함량 측정
B16F10 세포를 5 × 104 cells/well이 되도록 12-well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 100 nM α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH, Sigma-Aldrich) 및 다양한 농도의 시험물질을 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환하여 세포를 배양하였다. 72시간 동안 세포를 배양한 후 세포 단층을 PBS로 세척한 후 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA를 처리하여 세포를 회수하였고, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 pellet을 얻었다. 획득한 pellet에 10% dimethylsulfoxide (DMSO)를 함유된 1 N NaOH를 넣어 60℃에서 용해시킨 후 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 합성 melanin을 이용한 검량선으로부터 melanin의 양을 산출하였고, BCA protein assay kit (Thermo Scientific)을 사용하여 단백질을 측정하여 melanin 생성량을 단백질 양으로 표준화한 후 α-MSH 만을 처리한 군의 값을 100으로 하여 상대적인 값으로 나타내었다. 이때 양성대조군은 α-MSH 100 nM만을 처리한 시험군이고, 비교군은 TGF-β1 10 ng/mL를 처리한 시험군이다. 참고로, α-MSH 및 시료를 모두 처리하지 않은 무처리군의 멜라닌 함량은 61.1±8.8%로 측정되었다.
구분 멜라닌 함량 (% of control)
시료 처리농도(㎍/mL)
5 10 20 50
양성대조군 100
TGF-β1 75.6±4.7
실시예 1 1-1 74.9±2.4 82.7±6.2 80.2±1.5 56.0±2.7
1-2 71.3±1.5 77.6±2.1 74.1±0.7 53.2±1.6
실시예 2 2-1 89.3±2.1 80.3±3.4 86.8±2.7 68.6±2.5
2-2 86.2±1.3 76.5±2.7 81.5±2.4 65.3±2.1
실시예 3 3-1 86.5±2.5 80.0±2.9 80.0±2.4 88.4±8.1
3-2 83.1±1.2 77.1±0.8 75.6±0.3 86.1±1.6
실시예 4 4-1 70.4±0.6 78.2±2.7 75.1±1.2 52.3±1.5
4-2 66.5±1.3 72.3±1.1 71.6±2.9 49.6±2.2
실시예 5 5-1 85.2±2.6 77.3±2.0 83.1±2.6 62.3±3.1
5-2 81.9±2.1 72.1±1.3 78.2±1.5 61.4±1.3
실시예 6 6-1 82.1±0.2 76.2±1.8 75.3±0.7 77.1±0.3
6-2 79.6±2.3 75.4±1.5 72.6±0.1 72.6±0.4
실시예 7 7-1 68.1±1.2 74.3±1.4 71.6±0.9 50.1±1.0
7-2 67.2±0.6 71.6±0.8 67.4±1.8 46.5±2.6
실시예 8 8-1 83.2±1.3 74.2±1.4 78.6±1.7 60.2±2.2
8-2 80.5±2.0 72.6±0.8 74.5±0.2 57.3±1.5
실시예 9 9-1 78.0±0.6 73.5±0.4 73.7±0.9 78.4±2.1
9-2 77.4±0.4 71.3±1.2 69.6±0.7 73.1±1.6
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 추출물의 멜라닌 합성 억제 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
시험예 4: 피부주름 개선 효과
4-1: 타입 1 프로콜라겐 단백질의 합성 촉진
HS68 세포 배양
인간에서 유래한 피부 섬유아세포인 HS68 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. HS68 세포는 DMEM 배지 (Welgene)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포배양액 (complete DMEM 배양액)을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 trypsin-2.65 mM EDTA를 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
HS68 세포가 생성 분비한 타입 1 프로콜라겐 함량 측정
HS68 세포를 1 × 105 cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 시험물질을 다양한 농도로 함유한 serum-free 세포배양액으로 교환하여 세포를 24시간 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 세포배양액을 수거하여 Procollagen Type I C-Peptide (PIP) EIA Kit (Takara)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 함량을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다. 이때 비교군은 TGF-β1 10 ng/mL를 처리한 시험군이다. 참고로, 시료를 처리하지 않은 무처리군의 타입 1 프로콜라겐 함량은 280.0±0.4 ng/mL로 측정되었다.
구분 타입 1 프로콜라겐 함량 (ng/mL)
시료 처리농도(㎍/mL)
5 10 20 50 100
TGF-β1 497.0±6.0
실시예 1 1-1 386.6±22.7 304.1±20.7 140.8±15.9 60.4±0.7 62.9±5.1
1-2 394±11.0 326.1±12.6 145.4±9.7 64.8±8.9 65.1±6.5
실시예 2 2-1 279.5±4.6 273.7±7.9 189.5±7.3 92.5±10.4 52.9±5.8
2-2 283.7±13.8 279.3±3.4 195.4±6.7 95.8±9.1 57.5±1.9
실시예 3 3-1 346.2±12.4 367.0±15.0 315.8±14.8 300.0±5.4 222.0±4.0
3-2 352.1±10.8 378.6±11.6 327.9±9.2 305.9±1.6 227.5±6.2
실시예 4 4-1 423.6±2.3 349.2±10.4 186.4±11.5 105.9±10.1 112.6±4.7
4-2 430.8±11.2 362.5±11.0 203.7±13.6 126.1±12.7 139.5±6.3
실시예 5 5-1 316.2±10.5 328.6±12.4 215.4±9.5 123.2±10.2 76.6±8.1
5-2 331.4±5.1 356.1±10.1 234.8±11.3 142.8±9.9 97.2±10.8
실시예 6 6-1 364.8±13.5 396.4±11.0 352.8±16.1 338.1±7.6 264.1±7.3
6-2 381.6±15.4 415.2±6.1 376.2±10.4 352.8±9.2 281.6±6.6
실시예 7 7-1 452.1±1.6 379.3±16.4 259.6±13.7 147.5±10.6 166.7±8.9
7-2 471.9±11.8 390.5±10.8 292.5±15.8 166.2±12.7 181.6±11.1
실시예 8 8-1 332.1±12.0 341.1±11.9 231.8±14.6 153.8±10.1 96.4±10.5
8-2 351.6±10.4 356.0±10.6 254.6±9.7 172.9±6.4 116.2±5.7
실시예 9 9-1 361.5±10.9 421.6±12.6 335.3±12.3 329.4±10.2 272.1±10.5
9-2 372.6±12.5 442.5±13.4 359.2±10.7 348.1±9.7 293.2±9.4
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 추출물이 타입 1 프로콜라겐의 생성을 촉진시키는 작용을 통해 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
4-2: MMP-1 단백질의 합성 저해
HS68 세포를 1 × 105 cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 시험물질을 다양한 농도로 함유한 serum-free 세포배양액으로 교환하여 세포를 24시간 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 세포배양액을 수거하여 Human MMP-1 ELISA Kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 MMP-1 함량을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다. 참고로, 시료를 처리하지 않은 무처리군의 MMP-1 함량은 4.21±0.10 ng/mL로 측정되었다.
구분 MMP-1 함량 (ng/mL)
시료 처리농도(㎍/mL)
5 10 20 50 100
TGF-β1 2.80±0.33
실시예 1 1-1 3.56±0.19 2.47±0.22 2.17±0.12 2.01±0.24 1.81±0.09
1-2 3.46±0.06 2.41±0.18 2.09±0.21 1.99±0.08 1.80±0.04
실시예 2 2-1 2.69±0.36 1.68±0.35 0.73±0.14 0.39±0.04 0.34±0.02
2-2 2.61±0.24 1.63±0.21 0.71±0.06 0.35±0.02 0.30±0.04
실시예 3 3-1 3.10±0.22 2.14±0.07 0.96±0.11 0.54±0.07 0.34±0.02
3-2 2.98±0.16 2.10±0.10 0.92±0.05 0.49±0.02 0.31±0.06
실시예 4 4-1 3.15±0.12 2.08±0.11 1.82±0.08 1.64±0.05 1.45±0.03
4-2 3.10±0.05 2.02±0.02 1.79±0.11 1.60±0.02 1.41±0.12
실시예 5 5-1 2.50±0.21 1.47±0.29 0.59±0.13 0.28±0.03 0.25±0.04
5-2 2.46±0.15 1.42±0.12 0.54±0.04 0.25±0.05 0.21±0.03
실시예 6 6-1 2.86±0.21 2.02±0.09 0.79±0.05 0.46±0.07 0.28±0.04
6-2 2.69±0.14 1.98±0.20 0.75±0.02 0.42±0.01 0.26±0.03
실시예 7 7-1 3.02±0.09 1.96±0.15 1.70±0.04 1.53±0.07 1.38±0.02
7-2 2.97±0.10 1.92±0.03 1.66±0.10 1.50±0.09 1.34±0.07
실시예 8 8-1 2.41±0.13 1.33±0.21 0.49±0.12 0.22±0.05 0.19±0.01
8-2 2.37±0.22 1.29±0.16 0.45±0.09 0.19±0.06 0.17±0.01
실시예 9 9-1 2.71±0.19 1.89±0.13 0.71±0.08 0.39±0.06 0.22±0.02
9-2 2.67±0.11 1.84±0.08 0.67±0.12 0.35±0.03 0.19±0.01
상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 추출물이 MMP-1 발현을 억제하는 작용을 통해 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
시험예 5: 인체 첩포 시험
인체 첩포시험은 헬싱키 선언에 근거한 윤리규정 및 식품의약품안전처 화장품 인체적용시험가이드라인에 따라 실시되었으며, Frosch & Kligman이 고안한 방법(J. Am. Acad. Dermatol, 1(1) 35 (1979))을 응용하여 특정 피부질환 및 알레르기가 없는 20세 ~ 60세의 건강한 여성 피험자 32명(평균연령 41.34±8.06세)을 대상으로 실시하였다. 먼저, 첩포 부위를 70% ethanol로 소독한 후 실시예 1 내지 9의 시료(200 ㎍/mL) 20 ㎕가 적용된 Van der Bend (Van der Bend, Netherlands)를 첩포하였다. 48 h 후 첩포를 제거하고 skin marker (Chemotechnique Diagnostics AB, Sweden)로 시험 부위를 표시하였으며, 20 min, 24 h 후에 각 시험 부위의 반응도를 평가하였다. 일차 피부자극 시험(Skin Primary irritation Test)의 평가 기준은 하기 표 7에 제시한 PCPC Guidelines의 판정 기준에 따랐으며, 2회에 걸쳐 평가한 피부 반응의 정도(평균 반응도)를 하기 수학식 4에 따라 점수화하였다.
반응도 임상 증상(반응)
0 무반응
1 희미한 또는 가벼운 홍반
2 보통의 홍반; 및 첩포 경계에서 가까스로 감지할 수 있는 부종 및/또는 구진 형성
3 보통의 홍반; 및 첩포 부위 전반에 퍼진 부종
4 심한 홍반; 및 심한 부종; 또는 수포 발생
5 첩포 부위를 넘어서서 심각한 반응이 퍼짐
[수학식 4]
평균반응도 = [{(반응도 × 반응이 나타난 피검자수)/(총피검자수 × 최고점수(5점))} × 100] × 1/2
인체 피부에서의 피부 자극 정도를 평가하기 위하여 액상 상태의 실시예 1 내지 9의 시료 20 μL를 각각 32명의 피험자에 첩포하여 인체 첩포 시험을 실시하고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
구분 반응이 나타난 피검자수(명) 반응도
24 시간 48 시간 평균
음성 대조군 0 0.0 0.0 0.0
실시예 1-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 1-2 0 0.0 0.0 0.0
실시예 2-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 3-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 4-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 5-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 6-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 7-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 7-2 0 0.0 0.0 0.0
실시예 8-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 8-2 0 0.0 0.0 0.0
실시예 9-1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 9-2 0 0.0 0.0 0.0
상기 표 8을 살펴보면, 본 발명의 실시예에 따른 시료를 첩포하여 피부 자극 정도를 평가한 결과 32명의 피험자가 모두 반응 등급이 0.0으로서 음성 반응을 나타냈으므로, 본 발명의 조성물은 인체 피부 일차 자극 측면에서 무자극 물질로 판단된다.
하기 본 발명의 오이풀 추출물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예> 화장품의 제조
제조예 1: 유연화장수(스킨)
본 발명의 오이풀 추출물을 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 표 9에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량(중량%)
실시예 1-2의 오이풀 추출물 50 ㎍/mL
글리세린 6.0
1,3-부틸렌글라이콜 3.0
피이지1500 1.0
알란토인 0.1
DL-판테놀 0.3
EDTA-2Na 0.02
벤조페논-9 0.04
소듐하이알루로네이트 5.0
에탄올 10.0
폴리소르베이트20 0.2
방부제, 향, 색소 미량
증류수 잔량
합계 100
제조예 2: 영양화장수(로션)
본 발명의 오이풀 추출물을 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 10에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량(중량%)
실시예 1-2의 오이풀 추출물 50 ㎍/mL
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 1.2
토코페릴아세테이트 3.0
유동 파라핀 5.0
스쿠알란 3.0
마카다미너트오일 2.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄세스퀴올레이트 1.0
카르복시비닐폴리머 1.0
방부제, 향, 색소 미량
증류수 잔량
합계 100
제조예 3: 영양크림
본 발명의 오이풀 추출물을 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 영양크림을 제조하기 위해 하기 표 11에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량(중량%)
실시예 1-2의 오이풀 추출물 50 ㎍/mL
친유형 모노스테아린산글리세린 1.5
세테아릴 알코올 1.5
스테아린산 1.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.6
이소스테아릴이소스테아레이트 5.0
스쿠알란 5.0
광물유 35.0
디메치콘 0.5
하이드록시에칠셀룰로오스 0.12
글리세린 6.0
트리에탄올아민 0.7
방부제, 향, 색소 미량
증류수 잔량
합계 100
제조예 4: 마스크 팩용 유액
본 발명의 오이풀 추출물을 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 마스크팩용 유액을 제조하기 위해 하기 표 12에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량(중량%)
실시예 1-2의 오이풀 추출물 50 ㎍/mL
폴리비닐알코올 15.0
셀룰로오스 검 0.15
글리세린 3.0
PEG 1500 2.0
사이클로덱스트린 0.15
DL-판테놀 0.4
알란토인 0.1
글리시리진산모노암모늄 0.3
니코틴아마이드 0.5
에탄올 6.0
PEG 40 경화 피마자유 0.3
방부제, 향, 색소 미량
증류수 잔량
합계 100
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (7)

  1. 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 열수 추출물, 초음파 추출물 또는 락토바실러스속 유산균 발효물의 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 오이풀에 자외선 UVB를 350 ~ 1000 mJ/cm2로 조사한 후 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 추출물을 5 내지 200 ㎍/mL 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 오이풀 추출물, 겨우살이 추출물, 비타민나무열매 추출물, 오미자 추출물, 토마토 추출물 및 메밀 추출물이 1 : 0.5-2.0 : 0.5-2.0 : 0.1-1.5 : 0.05-1.0 : 0.05-1.0의 중량비로 포함된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 추출물 총 중량에 대하여 5 내지 15 중량부의 울금 추출물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
KR1020200171821A 2020-12-10 2020-12-10 오이풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물 KR102632084B1 (ko)

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