KR101207560B1 - 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 빗죽이나무(Cleyera japonica) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 빗죽이나무 추출물을 유효 성분으로 화장료 조성물을 제공하며, 본 발명에 따른 빗죽이나무 추출물은 항산화효과, MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성효과, 멜라닌 생성억제효과, 염증성 사이토카인 발현억제효과, 항염효과, 피부 자극 완화효과, 보습효과, 주름개선 효과 및 항균효과가 있어 각종 기능성 화장료의 유효성분으로 사용될 수 있다.

Description

빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising the extract of Cleyera japonica as active ingredient}

본 발명은 빗죽이나무 추출물을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리?화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화 (intrinsic aging)와 광노화 (photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 자유라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로는 피부의 주요 구성 물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부 노화 현상이 생겨나는 것이다.

특히, 단백질의 산화는 피부의 결합 조직인 콜라겐 (collagen), 히아루론산 (hyaluronic acid), 엘라스틴 (elastin), 프로테오글리칸 (proteoglycan), 피브로넥틴 (fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증 반응과 피부의 탄력에 지장을 주고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역 기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로, 신체의 대사 과정 중 발생하는 자유라디칼이나 자외선 조사, 염증 반응에 의해 매개되어 발생하는 자유라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진 대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

노화에는 이러한 자유라디칼 뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소 (Matrix Metalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다.

그러므로, 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포 내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현량 및 활성을 조절하고자 하였다.

한편, 색소 침착에 의한 피부 변화가 생긴다. 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은, 부분 또는 전체적인 색소 침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강 상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소 침착이다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라노이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데, 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로서, 이 멜라닌의 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다.

멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대 흡수 파장이 없고 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성 산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성 산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조 내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다.

멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라닌 형성 세포의 멜라노좀에서 티로시나아제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌 (dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화 과정을 거쳐 갈색 (pheomelanin), 흑색 (eumelanin)의 중합체로 형성된다.

이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포 내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 각질 세포의 식세포 작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 각질 세포의 핵 주변에 축적된다.

멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 각질 세포로의 이동은 부분적으로 호르몬과 자외선 등에 영향을 받고 일차적으로는 유전적인 영향을 크게 받는다. 그 밖에 티로시나아제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 사이토카인 (cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다.

이미 아스코르빈산 (일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논 (일본특개평-192062), 코직산 (일본특개소 56-7710), 알부틴 (일본특개평 4-93150) 및 일부의 추출물 등이 티로시나아제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 낮으므로 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 상기한 물질들은 그 티로시나아제 억제 효과가 입증되었으나 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서, 생체 레벨과 유사한 흑색종 세포 배양에 의한 저해효과 평가가 요구되고 있는 실정이다.

또한, 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 화장품에서는 그 사용이 금지 또는 제한되고 있다. 코직산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 상기 성분들을 소량 함유한 화장료는 실온에서 수 주일동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다.

일반적으로 피부와 관련된 많은 제품에 사용되는 기능성 물질들은 피부에 유효한 효과를 나타내는 동시에, 피부 자극의 원인이 되기도 한다. 다양한 원료가 사용되는 화장품은 자극이나 염증을 유발할 수 있는 물질을 함유하고 있어서 개인 관리 제품(Personal care products)을 사용하는 사람 중 10% 이상이 피부에 대한 부작용을 호소하고 있으며, 최근에는 자신의 피부가 민감하다고 느끼는 소비자가 증가하는 추세에 있다. 일반소비자에 대한 의식 조사에서 자신이 민감 피부라고 회답한 비율이 30-40% 이상이며, 이것은 계속 증가 경향을 보이고 있다. 더구나, 최근의 화장품 개발 경향은 피부에 실질적인 효과(real effect)를 줄 수 있는 기능성 화장품 (cosmeceutical)에 치중되고 있어서 화장품 등의 개인 관리 제품의 사용으로 인한 피부 부작용은 점점 증가할 것으로 보여진다. 일반적으로 화장품을 만들기 위해서는 다양한 원료들이 사용되며 통상적으로는 20종에서 50여종까지의 원료를 사용하게 된다. 이들은 방부제, 계면활성제, 자외선 차단제, 미백제 등 화장료의 보존, 유지 및 기능을 부여하기 위하여 필수 불가결하게 첨가되는 성분들로 실제로 제품 사용 시에 일부에서 피부 자극을 유발하기도 한다. 이들 원료들은 피부 자극 검사를 통하여 그 안전성이 입증되었으나 제품에 적용됨으로써 피부에 염증, 가려움(itching), 따끔거림(stinging) 및 화끈거림(burning) 등의 자극감과 홍반(erythema) 및 부종(edema) 등의 자극을 일으킬 수 있다. 특히, 환경오염이 심각해지고 오존층 파괴에 따른 자외선 조사량 증가, 생활공간의 건조화, 개인의 알레르기 체질, 스트레스, 화학유해 물질의 증가 등으로 인해 피부는 쉽게 손상을 받게 된다.

현재까지 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질들은 여러 가지가 있으나 일부 원료들은 화장료에는 사용할 수 없는 물질이거나 사용량이 제한되어 있기도하며, 또한 안정화시키기 어렵거나 용해도가 좋지 않아 실제 제품 적용 시 실질적인 효과를 거두기가 어려운 문제점을 가지고 있다.

이와 같은 맥락으로, 여드름 유발균에 대한 억제효과가 있는 항생물질인 에리스로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline), 신다마이신(cindamycine)과 같은 약제는 내성이 생긴다는 문제점과 함께 화장품으로서의 이용이 불가능하다는 문제가 있기 때문에, 미생물이 생산하는 항균물질은 광범위한 미생물에 대한 저해능력을 가지면서 고등생물에 대한 선택 독성이 낮다는 특성을 이용한 항균물질을 개발하려는 다양한 연구들이 이루어져왔다.

이러한 여러가지 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학 물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐만 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발 가치가 한층 늘어나고 있다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 장미과식물인 빗죽이나무(긴빗죽이, 참빗죽이, 꼭지빗죽이)를 선정하고 이로부터 추출물을 제조하여, 피부 항산화효과, MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성효과, 멜라닌 생성억제효과, 염증성 사이토카인 발현억제효과, 항염효과, 피부 자극 완화효과, 보습효과, 항균효과 및 주름개선 효과를 측정한 결과, 그 효능이 매우 우수하므로 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명의 목적은 빗죽이나무 추출물을 함유하여 항산화효과, MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성효과, 멜라닌 생성억제효과, 염증성 사이토카인 발현억제효과, 항염효과, 피부 자극 완화효과, 보습효과, 항균효과 및 주름개선 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 빗죽이나무 추출물을 용매 추출법, 초임계 추출법, 초음파 추출법, 발효법 또는 포제법을 이용하여 빗죽이나무 추출물의 효능 및 효과를 극대화한 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 사람의 피부에 적용시 항산화효과, MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성효과, 멜라닌 생성억제효과, 염증성 사이토카인 발현억제효과, 항염효과, 피부 자극 완화효과, 보습효과, 항균효과 및 주름개선 효과를 얻는 화장 방법을 제공하는데 있다.

따라서, 상기와 같은 본 발명의 목적은 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

본 발명의 다른 목적은 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 빗죽이나무 추출물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 빗죽이나무 추출물은 (a) 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용한 용매 추출법, (b) 초음파 추출법, (c) 초임계 추출법, (d) 발효법 또는 (e) 포제법으로 얻어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 사람의 피부에 적용하여, 피부 주름 개선 효과, 피부 미백 효과, 항염 효과, 항균 효과, 피부 보습개선 효과 또는 자극완화 효과를 얻는 것을 특징으로 하는 화장 방법에 의해 달성된다.

본 발명에 따른 빗죽이나무 추출물은 피부 항산화 효과(실험예 1), MMP-1 생성 억제 효과(실험예 2), 콜라겐 합성 증진 효과(실험예 3), 멜라닌 생성 억제 효과(실험예 4), 염증성 사이토카인 발현 억제 효과(실험예 5), 항염 효과(실험예 6), 자극완화 효과(실험예 7), 보습 효과(실험예 8),주름개선 효과(실험예 9) 및 항균 효과(실험예 10)를 갖는다.

또한, 본 발명에 따르면, 빗죽이나무 추출물을 용매 추출법, 초음파 추출법, 초임계 추출법, 발효법 또는 포제법을 통해 항산화 효과, MMP-1 생성억제 효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 멜라닌 생성억제 효과 및 염증성사이토카인 발현 억제, 항염, 피부자극 완화, 보습, 주름개선 및 항균 효과 등을 더욱 증진시켜준다.

본 발명의 화장료 조성물 중 유효 성분으로 사용되는 빗죽이나무(Cleyera japonica)는 장미과에 속하는 나무로 우리나라 중부 이남에서 장생하며 제주도에서 흔하게 볼 수 있다. 줄기는 밑에서 옆으로 자라며 몇 개의 수간이 올라온다. 어린가지는 백색 털과 타원형의 피목이 있다. 잎은 길이 5~10 cm로 둥근형으로 호생, 가장자리에 잘고 예리한 톱니가 있다. 꽃은 5월에 백색으로 피며 지름 3~5 cm로 꽃잎과 꽃받침이 5장씩인 산방화서이다. 뿌리가 이질과 설사에 효과가 있다고 알려져 있고 성분에 대한 구체적인 성분에 대해서는 알려진 것이 없다.

본 발명에 있어서, 빗죽이나무 추출물은 빗죽이나무의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 잎, 줄기, 가지, 껍질 또는 뿌리로부터 얻은 추출물이고, 보다 바람직하게는 잎, 가지, 껍질 또는 뿌리로부터 얻은 추출물이며, 가장 바람직하게는 가지 또는 껍질로부터 얻은 추출물을 의미한다.

또한, 본 발명의 빗죽이나무 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 추출 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법, (c) 초음파 추출법, (d) 발효법 또는 (e) 포제법을 이용하여 추출한다.

본 발명에서 추출 용매를 이용한 용매 추출법을 이용한 빗죽이나무 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 수용액 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 것이다.

한편, 본 발명의 빗죽이나무 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 빗죽이나무 추출물의 제조 방법은 다음과 같다. 먼저 빗죽이나무의 가지 또는 껍질을 정제수로 세척한 후 건조하고 입자의 크기가 300메시 이하가 되도록 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 건조 중량의 1?10배의 물, 탄소수 1?4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 또는 1,3 부틸렌 글리콜 등을 가한다. 그 후 냉각 콘덴서가 장치되어 유효성분이 증발되는 것을 방지한 상태에서 40?100℃에서 3?20시간 가열하여 추출하거나, 4?40℃에서 1?15일간 추출하고 회전 감압 증발기로 완전히 건조시켜 제조한다. 이때 1,3 부틸렌 글리콜의 경우에는 회전 감압 증발기를 이용하여 건조시키기 어려우므로 직접 위의 조건에서 추출한 후 건조 감량이 1%(w/w)되도록 30℃~60℃ 열풍건조기에서 건조하여 본 발명의 화장료에 이용한다.

또한, 본 발명의 빗죽이나무 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 빗죽이나무 추출물에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결 건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출법은 초임계 유체추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205).

이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다.

지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다.

본 발명의 초임계추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다.

이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.

추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.

초임계 추출법에 의한 빗죽이나무 추출물의 제조방법의 일례로서, 빗죽이나무의 가지 또는 껍질을 정제수로 세척한 후 건조하고 300메시 이하의 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 시료를 초임계 추출용기에 놓고 액체 크로마토그래피 펌프를 이용하여, 순수한 이산화탄소를 적당한 온도 및 압력에서 초임계 상태로 만들어 흘려보내면서 빗죽이나무 추출물을 시험관에 받는다.

초임계 추출 시에 이산화탄소는 35 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 약 60℃의 온도에서, 100 내지 500 기압, 바람직하게는 200 내지 400 기압, 더욱 바람직하게는 약 300 기압의 압력 하에 초임계 상태로 만들어주는 것이 좋다.

또한 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다.

초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.

추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결건조하는 통상의 빗죽이나무 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 빗죽이나무 추출물의 초음파 추출법은 빗죽이나무의 가지, 껍질 또는 파쇄된 빗죽이나무의 가지, 껍질을 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르 및 이들의 혼합물로부터 선택된 추출 용매에 넣은 후, 초음파 추출기(슈퍼노닉, 미합중국)를 이용하여 25KHz의 강도로 30℃에서 약 1 내지 6시간 동안 추출하는 것이며, 상기 초음파 추출 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명의 빗죽이나무 추출물은 미생물을 이용한 통상적인 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 이때 이용할 수 있는 미생물은 효모균, 유산균, 바실러스속 균 및 이의 혼합물로 이루어지는 군중에서 선택되는 균으로 20 내지 40 ℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 7을 유지하면서, 1 내지 7일간 발효시킨다.

본 발명의 빗죽이나무를 발효시키는데 사용되는 효모균은, 진핵미생물(핵과 세포질이 핵막에 의하여 나누어져 있는 생물)에 속하며, 세포벽, 세포막, 핵, 사립체, 과립 등 세포 소기관을 갖추고 있다. 성의 구별이 없는 이들은 주로 budding(출아법)으로 번식하는데, 분리된 많은 효모들 중에는 발효능이 없는 것, budding 대신 fission(분열) 혹은 bud-fission 방법으로 증식하는 것, 자낭포자(ascospore)가 아닌 사출포자(ballistospore)를 형성하거나 포자(spore)형성이 관찰되지 않는 것 등 다양한 그룹의 효모도 존재한다. 크기는 보통 5~10㎛로 세균의 5-10배 크기이며, 적정 pH는 4.5-5.5이나 1-10에서도 생존한다. pH 1에서 12시간 생존하는 효모는 박테리아보다 산에 강하므로 배지의 조건을 pH 3.5 내지 pH 3.8 정도로 맞추면 박테리아의 오염을 어느 정도 억제할 수 있다.

효모균은 균종에 따라서 조금씩 차이가 있으나, 대부분 20~25℃에서 잘 자란다. 보통은 50℃이상에서는 사멸한다고 하지만 그 온도 이상에서 합성이 되지 않는 성장요소를 배지에 직접 첨가해 줌으로써 어느 정도는 극복이 가능하다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우 40℃ 이상에서 사멸하지만 배지에 올레산(oleic acid)과 에르고스테롤(ergosterol)을 첨가해 줌으로써 이를 방지할 수 있다. 효모 균체 자체는 단세포 식물로서 단백질과 미량 광물질을 다량 함유하고 있다. 따라서, 본 발명의 빗죽이나무를 발효시키는데 사용하기에 바람직한 효모는 사카로마이세스 세레비시애이다.

또한 본 발명에서 빗죽이나무를 발효시키는데 사용되는 유산균은, 포도당 또는 유당과 같은 탄수화물을 분해하여 유산(젖산)이나 초산과 같은 유기산을 생성하는 인체에 매우 유익한 미생물의 일종이다. 일반적으로, 유산균이 당으로부터 유산을 만드는 것을 발효라 하며, 이러한 발효과정을 거쳐서 발효식품이 만들어 진다. 본 발명에서 사용될 수 있는 유산균은 바람직하게는 락토바실러스, 스트렙토코커스, 비피도 박테리움, 류코노스톡, 페디오 코커스, 락토 코커스 및 이들의 혼합물을 포함하며, 가장 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus)이다. 락토바실러스 중에서도 본 발명의 녹두를 발효시키는데 사용하기에 가장 바람직한 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이다.

또한 본 발명에서 빗죽이나무를 발효시키는데 사용된 발효균으로 바실러스(Bacillus)균을 사용할 수 있으며, 바실러스는 포자 형성균으로, 토양이나 물속에 서식하며 대부분 유기물 분해와 관련되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 바실러스는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 폴리퍼멘티커스, 바실러스 메센테리커스 및 이들의 혼합물을 포함하며, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로서 이 균은 고초균으로도 알려져 있는데, 포도당과 같은 다양한 당류, 전분 등을 혐기적으로 대사하여, 메주나 청국장과 같은 발효 식품 제조에 이용되기도 하는 유기물 분해 미생물이다.

본 발명의 빗죽이나무를 이용한 발효액은 다음의 단계로 제조될 수 있다:

a) 빗죽이나무의 가지 또는 껍질 부위를 분말로 만드는 단계;

b) 상기 단계 a)에서 제조된 빗죽이의 가지 또는 껍질 부위의 분말을 정제수에 희석한 후 효모균, 유산균, 바실러스균 또는 이의 혼합물을 이용하여 발효시키는 단계;

c) 상기 단계 b)의 발효에 의해 얻은 발효액을 여과하여 저온 숙성하고, 다시 여과하여 빗죽이나무 발효액을 제조하는 단계.

상기 빗죽이나무 발효액의 제조 단계에서, 상기 단계 a)의 빗죽이나무 가지 또는 껍질 부위의 분말은 100 내지 500 메쉬 크기 이하로 제조될 수 있으며, 이에 한정될 필요는 없다.

또한 상기 단계 b)의 발효는 빗죽이나무의 분말과 정제수를 1:10으로 혼합한 후 121℃에서 멸균시킨 후 유산균(Lactobacillus sp), 효모균(Sacharomyces sp) 및/또는 바실러스균(Bacillus sp)을 접종하여 배양함으로써 달성된다. 발효 단계에서 사용된 빗죽이나무 분말은 총 배양액 1L를 기준으로, 1 내지 50g의 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 발효단계에 사용된 효모균, 유산균 또는 바실러스균은 총 배양액 1L 기준으로, 1 X 10⁴ 내지 1 X 10⁵ 세포수의 양으로 접종되는 것이 바람직하며, 각 균주의 성상에 따라 통상적인 조건 및 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건에서 배양될 수 있다. 또한, 발효균의 배양을 더욱 활성화시키기 위하여 추가적인 탄소원 및/또는 pH 조절제가 첨가될 수도 있다. 이때 적합한 배양조건은 30?37℃, pH 5?7의 호기 또는 통상혐기적인 조건에서 바람직하게는 약 1 내지 15일간 배양되며, 더욱 바람직하게는 1 내지 7일간 배양된다.

상기 단계 c)는 단계 b)에서 얻은 발효액을 1차 여과한 후 그 여과액을 저온숙성하는 단계로서, 이때 여과는 0.25 내지 0.45μm 크기의 여과막으로 여과하여, 여분의 빗죽이나무 분말 알갱이 및 발효균을 제거할 수 있다. 1차 여과막으로 분리된 여과액은 저온 숙성하여 안정화 시킬 수 있으며, 1차 여과막에 비해 더 세밀한 여과막으로 2차 여과한 후 농축하여 보관할 수 있으며, 이 농축물을 적절히 희석하여 사용한다. 이때 상기 여과-숙성-여과-농축의 과정은 보다 유효한 효과가 있는 빗죽이나무 발효액을 얻기 위한 공정단계로서, 저온 숙성과정은 0-4 ℃의 온도 범위에서 5 내지 10일 동안 이루어지는 것이 바람직하며, 잔여 균의 확실한 제거를 위하여 2차 여과막의 크기는 0.25μm 이하인 것이 바람직하다.

보다 바람직한 구현예에 따르면, 빗죽이나무 분말을 300 메쉬 크기 이하로 분말화한 뒤 배양액에 10 g/L 첨가하고, 효모균, 유산균, 바실러스균 또는 이의 혼합물을 50,000 cfu/L로 첨가하여 각각 효모는 30℃, 유산균은 37℃, 바실러스균은 37℃, 혼합균의 경우 경우에 따라 30℃ 및 37℃에서 선택하여, pH 5-7, 바람직하게는 약 pH 5.5로 호기적 또는 통성 혐기적인 조건으로 발효조에서 약 1일 내지 7일간 배양하여 발효시킨다. 배양 후 상기 발효액은 0.45μm의 여과막을 이용하여 1차 여과한 다음 이 여과액에 10일간 저온 숙성시킨 후 0.25μm 막으로 2차 여과하여 농축한 뒤 본 발명의 빗죽이나무 추출물을 제조한다. 사용하기 전에 최종 고형분의 농도를 10g/L가 되게 유지한다.

또한, 본 발명의 빗죽이나무 추출물은 포제법을 이용하여 얻어낸 추출물도 포함한다. 포제란 한방이론에 근거하여 약재를 가공 처리함으로써 약재 본래의 성질을 변화시키는 제약 기술이다. 주로 찌거나, 삶거나, 불에 볶거나, 불에 굽거나 달구는 공정 또는 이들이 혼합된 공정의 방법을 말한다. 처리 조건은 삶는 경우 온도 60 내지 100℃, 30분 내지 6시간이고, 찌는 경우 120 내지 180℃, 10분 내지 2시간이고, 굽는 경우 80 내지 100℃, 10분 내지 2시간에서 용이하게 선정한다. 가장 바람직하게는 찌는 과정을 수행하며, 90℃에서 1시간 동안 처리한 후 음건한다.

본 발명에서는 빗죽이나무를 쪄서 건조시킨 후 이를 이용하여 추출물을 제조하였으며, 가장 바람직하게는 포제법으로 얻은 추출물을 추가로 70%에탄올을 이용하여 추출한다. 또한 포제법을 이용한 추출물은 용매 추출법 뿐만 아니라, 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 초음파 추출법에 의한 추출 방법으로 추출하거나 미생물을 이용하여 발효시킬 수 있다.

본 발명의 빗죽이나무 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 빗죽이나무 추출물은 활성산소를 소거하고, MMP-1의 생성 억제 및 콜라겐의 생합성 증진하고, 멜라닌 세포의 멜라닌 생성을 억제하며, 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 항염, 항균 및 피부 자극을 완화하고 주름을 개선하며, 피부에 보습을 부여할 수 있는 유효량의 빗죽이나무 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 빗죽이나무 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 ~ 30.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 빗죽이나무 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 피부 개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부 개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

따라서, 이러한 다양한 기능을 가진 빗죽이나무 추출물을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 피부 항산화 효과(실험예 1), MMP-1 생성 억제 효과(실험예 2), 콜라겐 합성 증진 효과(실험예 3), 멜라닌 생성 억제 효과(실험예 4), 염증성 사이토카인 발현 억제 효과(실험예 5), 항염 효과(실험예 6), 자극완화 효과(실험예 7), 보습 효과(실험예 8),주름 개선 효과(실험예 9) 및 항균 효과(실험예 10)가 뛰어나다.

따라서, 이러한 다양한 기능을 가진 빗죽이나무 추출물을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 항산화 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 미백효과, 항염 효과, 항균 효과, 피부 보습개선 효과 또는 자극 완화 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 사람의 피부에 적용하여 항산화 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 미백 효과, 항염 효과, 항균 효과, 피부 보습개선 효과 또는 자극완화 효과를 얻는 것을 특징으로 하는 화장방법을 제공한다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 한번 또는 여러번 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 빗죽이나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 이용하는 화장방법을 수행하면, 피부 항산화 효과, MMP-1 생성 억제 효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 멜라닌 생성 억제 효과, 염증성 사이토카인 발현 억제 효과, 항염 효과, 항균 효과와 보습효과, 자극완화 효과 및 피부 주름개선 효과를 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1: 빗죽이나무의 용매 추출물 제조

정제수로 세척하고 건조시킨 빗죽이나무 가지 및 껍질 부위 200 g을 분말화한 후 300 메시 시브를 이용하여 미세하게 만들었다. 이에 물과 에탄올의 비율을 3:7로 조정한 70% (V/V) 에탄올 수용액 1000 ml을 가하여 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #2 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50 ℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조한 후 본 발명의 실험에 적용하였다.

제조예 2~3. 빗죽이나무의 초임계 유체 추출물 및 초음파 추출물 제조

제조예 2~3은 다음의 추출방법의 차이를 제외하고는, 상기 제조예 1과 같은 방법으로 빗죽이나무 추출물을 얻었다. 또한, 제조예 2~3은 통상적인 초임계 추출법(약 60℃의 온도에서 약 300 기압의 압력 하에 초임계 상태에서 공용매로서 올리브오일을 이용하여 추출함)으로 추출하여 초임계 추출물을 얻었다(제조예 2). 초음파(슈퍼노닉 초음파기기를 이용하여 25KHz의 강도로 30℃에서 약 2시간 동안 추출)를 이용한 추출을 통해 추출물을 얻었다(제조예 3). 단, 제조예 2의 경우에는 공용매로 에탄올를 사용하였으며 제조예 3에서는 공용매로서 정제수를 사용하였다.

제조예 4. 빗죽이나무의 효모균 발효 추출물 제조

정제수로 세척하고 건조시킨 빗죽이나무 가지 및 껍질 부위를 분말화한 후 300메시 시브를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 효모 배양액(Potato Dextrose Broth, 아큐메디아 , 미합중국)에 첨가하였다. 발효에 사용한 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였으며, 배양액 당 50,000 cfu/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 30℃, pH 5～7로 유지하며 배양하였다. 배양이 완료된 빗죽이나무 발효액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25μM 여과지를 이용하여 최종 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 여과 숙성액을 다시 0.25μM의 여과기를 이용하여 여과하여 본 발명에 사용하였으며, 편의상 이 발효 여과액을 빗죽이나무 효모균 발효 추출물이라 칭하였다. 이하 실험에 사용된 빗죽이나무 효모균 발효 추출물은 최종농도가 1g/100mL가 되게 유지하여 사용하였다.

제조예 5. 빗죽이나무의 유산균 발효 추출물 제조

정제수로 세척하고 건조시킨 빗죽이나무 가지 및 껍질 부위를 분말화한 후 300메시 시브를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 유산균 배양배지(Lactobacillus MRS Broth, 디프코, 미합중국)에 첨가하여 혼합한 후 121℃에서 멸균시킨 뒤 유산균을 접종하였다.

발효에 사용한 유산균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 사용하였으며, 배양액 당 50,000 cfu/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 3일간, 37℃, pH 5～7로 유지하며 배양하였다. 배양이 완료된 빗죽이나무 발효액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25μM 여과지를 이용하여 최종여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 여과 숙성액을 다시 0.25μM의 여과기를 이용하여 여과하여 본 발명에 사용하였으며, 편의상 이 발효 여과액을 빗죽이나무 유산균 발효 추출물이라 칭하였다. 이하 실험에 사용된 빗죽이나무 유산균 발효 추출물은 최종농도가 1g/100mL가 되게 유지하여 사용하였다.

제조예 6. 빗죽이나무의 바실러스균 발효 추출물의 제조

정제수로 세척하고 건조시킨 빗죽이나무 가지 및 껍질 부위를 분말화한 후 300메시 시브를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 바실러스 배양배지에 첨가하였다.

발효에 사용한 바실러스 균주는 바실러스 서브틸리스(고초균; Bacillus subtilis)를 사용하였으며, 배양액 당 50,000 cfu/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 3일간, 37℃, pH 5～7로 유지하며 배양하였다. 배양이 완료된 빗죽이나무 발효액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25 μM 여과지를 이용하여 최종여과 하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 여과 숙성액을 다시 0.25μM의 여과기를 이용하여 여과하여 본 발명에 사용하였으며, 편의상 이 발효 여과액을 빗죽이나무 바실러스균 발효 추출물이라 칭하였다. 또한, 이 방법에 의한 추출 수율은 221.6g/1kg이었다. 이하 실험에 사용된 빗죽이나무 바실러스균 발효 추출물은 최종농도가 1g/100mL가 되게 유지하여 사용하였다.

제조예 7. 빗죽이나무의 포제법 추출물의 제조

빗죽이나무의 포제법 추출물을 얻기 위해 본 발명의 실시예에서는 쪄서 건조시키는 공정으로 처리하였다. 즉, 정제수로 세척하고 건조시킨 빗죽이나무의 전초를 분말화한 후 300메시 시브를 이용하여 미세하게 만든 후, 찌는 온도 90℃, 1시간 조건으로 실시한 후 음건하였다. 이렇게 하여 만든 빗죽이나무의 포제법 추출물은 추가로 70% 에탄올을 이용하여 추출하였다.

실험예 1: DPPH 법을 이용한 항산화 효과 측정

본 실험예 1을 제조예 1 내지 7에서 수득한 빗죽이나무 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH법을 이용하여 항산화 효과(자유라디칼 소거율)를 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl) 자유라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 효과를 측정한다. 피검 물질(빗죽이나무 추출물)에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율(%)을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 자유라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1 mM 용액으로서 61.88 mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1 mM DPPH 용액 0.15 ml에 시료 용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 시료 용액의 블랭크 (Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.

④ 공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하고 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

자유라디칼 소거율(%)의 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기의 표 1과 같다.

St : 시료의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시료	처리 농도(%)	자유라디칼 소거율(%)
		제조예 1	제조예 2	제조예 3	제조예 4	제조예 5	제조예 6	제조예 7
빗죽이나무 추출물	0.0001	11.1	27.1	13.2	15.2	12.1	14.5	11.2
	0.0005	32.3	36.4	29.5	35.4	30.3	40.7	27.4
	0.001	59.5	64.2	54.9	66.4	60.3	60.4	45.2
	0.005	87.1	85.2	84.2	89.9	86.5	88.8	78.4
	0.010	93.5	90.3	91.4	92.3	91.9	90.6	90.9
Vit-C	0.05	89.9

표 1에 나타낸 바와 같이, DPPH에 의한 자유라디칼 소거실험에서 본 발명에 따른 빗죽이나무 추출물은 농도 의존적으로 항산화효과가 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며, 빗죽이나무 추출물은 0.01% 농도에서 자유라디칼 소거율(항산화 효과)이 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C의 항산화 효과보다 더욱 우수한 항산화 효과를 갖고 있음이 확인되었다.

실험예 2. 빗죽이나무 추출물의 MMP -1 생성 억제 효과

제조예 1 내지 7에서 수득한 빗죽이나무 추출물이 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과를 측정하였다.

인간 정상 피부 세포인 섬유아세포 (한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1× 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1 내지 7의 빗죽이나무 추출물을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 빗죽이나무 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다.

배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 2에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

시료명	처리 농도	MMP-1 생성 억제율(%)
		제조예 1	제조예 2	제조예 3	제조예 4	제조예 5	제조예 6	제조예 7
빗죽이나무 추출물	10ppm	13.14	15.23	23.45	12.1	17.56	27.1	15.2
	50ppm	29.12	33.12	47.25	30.3	30.32	36.4	35.4
	100ppm	45.23	48.88	62.98	60.3	46.21	64.2	66.4
	500ppm	85.26	89.54	87.32	86.5	86.9	85.2	89.9
	1000ppm	88.25	92.31	93.69	91.9	92.66	90.3	92.3
TGF-β	200nM	75.3

상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 빗죽이나무 추출물은 농도 의존적으로 MMP-1의 생성을 억제(MMP-1 활성 억제)시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히 제조예 3에 의해서 제조된 빗죽이나무 초음파 추출물이 다른 추출방법으로 제조된 빗죽이 나무 추출물(제조예 1, 2, 4, 5, 6, 7)에 비해 가장 효과가 좋은 것을 확인 하였다. MMP-1 생성 억제효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(200nM)와 본원발명의 빗죽이나무 추출물의 농도(500ppm) 차이를 감안해도, 여러 종류의 물질이 혼합된 추출물 수준에서 상기와 같은 정도의 MMP-1 억제율을 나타낸 것은 본원발명의 빗죽이나무 추출물은 MMP-1 생성 억제 효과가 있다는 것을 보여준다.

실험예 3. 빗죽이나무 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과

인간 정상 상피 세포인 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 1 x 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 제조예 1 내지 7에 의해 제조된 빗죽이나무 추출물을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 빗죽이나무 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 측정하여 ng/㎖ 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 수학식 3에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

시료명	처리 농도	콜라겐 생합성 증가율(%)
		제조예 1	제조예 2	제조예 3	제조예 4	제조예 5	제조예 6	제조예 7
빗죽이나무 추출물	1ppm	12.10	31.24	13.10	11.410	13.50	18.10	13.10
	5ppm	33.4	51.12	33.89	32.89	33.00	36.89	33.82
	10ppm	51.50	85.87	60.59	65.59	65.00	55.59	57.54
	50ppm	82.20	108.50	85.64	81.64	83.50	75.64	82.65
	100ppm	113.50	141.35	109.98	101.98	100.95	90.98	93.98
TGF-β	200nM	175.23

표 3에 따르면, 본 발명의 제조예 1 내지 7에 의해 제조된 빗죽이나무 추출물의 콜라겐 생합성율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 제조예 2에 의해 제조된 빗죽이나무의 초임계 추출물이 효과가 다른 추출 방법으로 제조된 빗죽이나무의 추출물(제조예 1, 2, 4, 5, 6, 7)보다 효과가 더 좋은 것을 확인 하였다.

실험예 4: 빗죽이나무 추출물의 B16F1 멜라닌형성세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과

본 실험예 4는 상기 제조예 1 내지 7 에서 수득한 빗죽이나무 추출물의 미백 효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다. 본 실험예 4에 사용된 B16F1 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다.

이 세포의 인공 배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색 색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라닌 형성 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 X 10⁵ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 제조예 1에 따른 빗죽이나무 추출물을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율을 (%)은 하기 수학식 4에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 표 4에 기재하였다.

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

시료명	처리 농도 (%)	멜라닌 생성 저해율 (%)
		제조예 1	제조예 2	제조예 3	제조예 4	제조예 5	제조예 6	제조예 7
빗죽이나무 추출물	0.01	23.51	11.51	22.33	12.31	21.60	12.32	12.65
	0.05	47.25	33.25	39.21	29.23	45.52	45.41	34.54
	0.1	65.21	55.21	58.33	38.36	60.32	68.53	54.23
	0.5	75.23	65.44	66.23	56.24	70.45	76.63	65.75
하이드로퀴논	50ppm	71.54
알부틴	200ppm	66.18

상기 표 4의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 제조예 1 내지 7에 의해 제조된 정제된 빗죽이나무 추출물은 농도 의존적으로 B16F1 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해하는 것을 알 수 있었다.

실험예 5: 빗죽이나무 추출물의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과

본 실험예 5는 제조예 1 내지 7 에서 수득한 빗죽이나무 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 평가하기 위한 것으로서, 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포 (Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5 X 10⁴개씩 넣고 24 시간 동안 부착시켰다.

각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B (UVB) 램프 (Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지 (DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다.

여기에 평가하고자 하는 빗죽이나무 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 빗죽이나무 추출물의, 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소 면역 분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, 염증성 사이토카인 (IL-1α)의 발현 억제율(%)은 하기 수학식 5에 의해 계산하였고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

시료명	처리 농도	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
		제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	제조예7
빗죽이나무 추출물	10ppm	12.10	23.99	13.99	21.21	13.01	12.32	14.12
	50ppm	23.40	35.78	25.78	32.32	24.58	32.64	21.65
	100ppm	31.50	61.33	31.33	45.54	31.00	41.34	23.56
	500ppm	42.20	67.65	47.65	65.65	45.60	54.32	54.75
	1000ppm	53.50	78.99	58.99	76.54	56.30	64.54	60.12
인도메타신	1000ppm	61.23

표 5에 따르면, 제조예 2에 의해 제조된 빗죽이나무의 초임계 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 1000ppm 농도에서 78.99%을 억제하는 것을 알 수 있었다. 제조예 1에 의해 제조된 빗죽이나무 추출물에 비해 제조예 2에 의해 제조된 빗죽이나무 추출물이 약 1.47 ~ 1.98배 IL-1α의 발현 억제율이 더 우수한 것을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 빗죽이나무 추출물은 염증성사이토카인 발현 억제물질인 인도메타신의 억제효과와 비교했을 때, 1,000ppm 농도에서 제조예 1, 3, 5, 7의 염증성 사이토카인의 발현억제율에는 미치지 못했으나, 근사치 우수한 효과를 나타내었으며, 제조예 2, 4, 6의 경우는 1,000ppm 농도에서 인도메타신 보다 높은 염증성 사이토카인 발현율을 보임을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 빗죽이나무 추출물은 자외선 조사에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

실시예 1 : 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조

빗죽이나무 추출물을 포함하는 화장료는 제조예 1 내지 제조예 7의 빗죽이나무 추출물을 각각 포함하는 화장료(실시예 1 내지 실시예 7)를 제조하였다. 이때 효능의 비교를 위해 빗죽이나무 추출물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교예 1), 보습제로서 글리세린 및 소르비톨을 포함하는 화장료 조성물(비교예 2) 및 빗죽이나무 추출물 대신에 아데노신을 포함하는 화장료 조성물(비교예 3)을 하기 표 6에 나타내었다. 대조군으로 추출물 또는 보습제 대신 정제수를 포함하는 화장료를 이용하여 효과를 측정하였다.

성분	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	실시예 6	실시예 7	비교예 1	비교예 2	비교예 3	대조군
제조예 1	5.0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
제조예 2	-	5.0	-	-	-	-	-	-	-	-	-
제조예 3	-	-	5.0	-	-	-	-	-	-	-	-
제조예 4	-	-	-	5.0	-	-	-	-	-	-	-
제조예 5	-	-	-	-	5.0	-	-	-	-	-	-
제조예 6	-	-	-	-	-	5.0	-	-	-	-	-
제조예 7				-	-	-	5.0	-	-	-	-
글리세린	-	-	-	-	-	-	-	5.0	5.0	-	-
1,3 부틸렌글리콜	-	-	-	-	-	-	-	5.0	-	-	-
소르비톨	-	-	-	-	-	-	-	-	5.0	-	-
아데노신										5.0
EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
세토스테아릴 알코올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
글리세릴 스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
마이크로 크리스탈린	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7
스쿠알	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
유동파라핀	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
폴리솔베이트	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2
솔비탄 스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
토코페릴 아세테이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
사이클로메치콘	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
BHT	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
향,방부제	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100

실험예 6: 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 항염증 효과(귀 부종 실험)

상기 표 6의 실시예 1 내지 실시예 7 에 따른 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 비교예 1에 따른 화장료 조성물을 이용하여 항염증 효과를 측정하였다.

건강한 쥐 18마리를 대상으로 하고 1개 실험군 당 3개 그룹으로 나누어 1개 그룹 당 2마리씩 실험하였다. 1개 그룹 내의 2마리 쥐의 양쪽 귀를 에탄올로 잘 닦아준 다음, 1마리 쥐에는 상기 실험군을, 나머지 1마리 쥐에는 대조군(정제수)을 각각 4 ㎕ 발라주었다. 1시간 경과 후에 1개 그룹 내의 2마리 쥐 모두의 왼쪽 귀에는 아세톤 20 ㎕를 발라주고, 오른쪽 귀에는 염증유발 양성 대조 물질인 아라키돈산을 발라주었다. 다시 1 시간 경과 후 마이크로미터를 이용하여 양쪽 귀의 두께를 2회씩 반복 측정하여 평균치를 구한 후, 하기 수학식 6에 따라 항염증 효과를 계산하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

A = 실험군에서 부풀은 두께

B = 대조군에서 부풀은 두께

제품	부풀은 정도		항염증 효과
	증가된 두께	대조군과의 차이
실시예1	1.88	0.99	34.50%
실시예2	1.77	1.10	38.32%
실시예3	1.77	1.10	38.32%
실시예4	1.48	1.39	48.43%
실시예5	1.68	1.19	41.46%
실시예6	1.87	1.00	34.84%
실시예7	1.74	1.07	37.28%
비교예1	2.84	0.03	1.04%
대조군	2.87	-	-

상기 표 7의 항염증 효과 측정결과를 통해, 본 발명의 빗죽이나무 추출물을 함유한 실시예 1 내지 실시예 7의 화장료 조성물은, 빗죽이나무 추출물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3부틸렌글리콜을 포함하는 비교예 1의 화장료 조성물과 비교하였을 때 월등히 우수한 항염 효과(약 33.5배 내지 46.56배)를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

실험예 7: 빗죽이나무 추출물의 피부 자극 완화 효과

본 발명의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 자극성을 알아보기 위하여, 건강한 성인 남,여 30명을 대상으로 양팔 하박부에 5 × 20 ㎝ 부위에 실시예 1 내지 3, 비교예 1 및 대조예의 화장료 100 중량부에 각각 자극원으로서 0.3% 락트산 수용액으로 pH를 5.5로 조정한 것 약 0.1g 을 24시간 동안 첩포한 후, 제거하고 1시간 및 24시간이 경과한 다음, 하기의 판정 기준에 의하여 육안으로 피부 상태 변화를 판독하였고, 자극율(%)은 다음 수학식 7에 따라 계산하였다. 대조예로는 0.3% 락트산 수용액(v/w)을 사용하였다. 실험 결과는 하기의 표 8에 나타나 있다.

판정기준

- : 홍반이나 특이한 현상 없음

+- : 주위보다 약간 붉어짐

+ : 주위보다 현저히 붉어짐

++ : 주위보다 심하게 붉어지고 부풀음

시료	판정결과				자극율 (%)
	++	+	+-	-
실시예1+락틱산 0.3%	-	4	6	20	15.5%
실시예2+락틱산 0.3%	-	2	4	24	8.89%
실시예3+락틱산 0.3%	-	1	5	24	7.78%
실시예4+락틱산 0.3%	-	2	4	24	8.89%
실시예5+락틱산 0.3%	-	2	3	25	7.77%
실시예6+락틱산 0.3%	-	2	4	24	8.89%
실시예7+락틱산 0.3%	-	2	4	24	8.89%
비교예1+락틱산 0.3%	3	15	11	1	56.66%
대조예+락틱산0.3%	7	15	8	-	65.55%

상기 표 8의 피부 자극 완화 실험 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물(실시예 1 내지 7)은 대조예 및 보습제로서 글리세린 및 1,3부틸렌글리콜 또는 소르비톨을 포함하는 비교예 1과 비교했을 때 피부자극원에 의한 자극율이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다.

실험예 8 : 빗죽이나무 추출물의 보습 효과

상기 실시예 1 내지 7 및 비교예 1, 2의 화장료 조성물에 대한 임상 보습 효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 125 명을 무작위로 25 명씩 5개 그룹 (A, B, C, D 및 E)으로 나눈 후, A, B, C 그룹에는 실시예 1 내지 7의 화장료 조성물을, D 그룹에는 각각 빗죽이나무 추출물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교예1), 보습제로서 글리세린 및 소르비톨을 포함하는 화장료 조성물(비교예2)의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 안면에 도포하게 하였다. 보습 효과는 실사용 시험 시작 후부터 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneometer CM 820 (Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 실험 결과는 하기 표 9에 나타내었다.

빗죽이나무 추출물의 피부 보습 효과

구분	사용전	사용 2주 후	사용 4주 후
실시예1	23.5	38.6	45.7
실시예2	23.2	36.4	43.6
실시예3	23.2	37.8	47.4
실시예4	23.2	37.8	45.4
실시예5	23.5	38.6	42.7
실시예6	23.2	36.4	46.9
실시예7	23.5	38.6	44.7
비교예1	24.5	35.9	40.8
비교예2	22.8	36.5	37.9

상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 일반 다른 보습제를 함유한 화장료(비교예 1, 2)와 비교하여도 본 발명의 빗죽이나무 추출물 함유한 화장료(실시예 1 내지 7)의 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 9. 빗죽이나무 추출물의 피부 주름 개선효과

본 발명의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료의 피부 주름 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

즉, 임상실험은 상기 표 6에 따른, 제조예 2의 빗죽이나무 추출물을 함유하고 있는 실시예 2의 화장료 조성물, 빗죽이나무 추출물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3부틸렌글리콜을 포함하는 비교예 1의 화장료 조성물과, 빗죽이나무 추출물 대신에 주름개선 효과가 있는 것으로 알려진 아데노신을 포함하는 비교예 3의 화장료 조성물을 이용하여 사람을 대상으로 화장료의 사용으로 인한 피부 주름 개선 효과를 확인 및 비교 평가하였다.

실험자 (20세 - 35세의 여성) 60명의 여성을 대상으로 실험군을 각각 20명씩 빗죽이나무 추출물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교예1) 처리군, 빗죽이나무 추출물 대신에 주름 개선 성분으로서 아데노신 5.0%(v/v)를 포함하는 화장료 조성물(비교예 3) 처리군, 빗죽이나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물(실시예 2)의 실험군의 세 그룹으로 나누고, 얼굴 양쪽면을 사용하여 6주 후의 주름 개선 효과를 육안으로 평가하여 주름 개선 정도를 확인하였다. 이 평가를 토대한 주름 개선 효과 결과는 하기의 표 10에 나타내었다.

빗죽이나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 주름 개선 효과 (육안 평가)

	주름 개선 효과			유효율(%)
	우수	약간	없음
실시예 2 (빗죽이나무 추출물)	24	4	2	85.0
비교예 1 (보습제)	3	4	23	25.0
비교예 3 (아데노신)	17	7	6	80.0

상기 표 10의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 빗죽이나무 추출물을 함유한 실시예 2의 화장료 조성물은 보습제를 함유하는 비교예 1에 비하여 약 3.4배 높은 주름개선 효과를 보여주었다.

또한, 빗죽이나무 추출물 대신 주름 개선 효과가 있는 것으로 알려진 아데노신을 함유하는 비교예 3의 화장료보다도 우수한 주름개선 효과가 나타나, 빗죽이나무 추출물의 우수한 주름 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 10: 빗죽이나무 추출물의 항균 효과

빗죽이나무 추출물의 항균 효과를 알아보기 위해, 하기 표 11의 조성으로 제조예 1, 2 및 4의 빗죽이나무 추출물을 다양한 함량비로 함유하는 실시예 8-16의 화장료, 빗죽이나무 추출물 대신에 방부제로 메칠파라벤과 이미다졸리디닐우레아를 함유하는 비교예 4의 화장료 및 빗죽이나무 추출물 대신 정제수를 함유한 대조군의 화장료를 제조하였다.

성분	실시예									비교예	대조군
	8	9	10	11	12	13	14	15	16	4
	함량 (단위:중량%)
제조예 1	0.5	1.0	2.0	-	-	-	-	-	-	-	-
제조예 2	-	-	-	0.5	1.0	2.0				-	-
제조예 4	-	-	-	-	-	-	0.5	1.0	2.0	-	-
메칠파라벤	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.2	-
이미다졸리디닐 우레아	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.2	-
글리세린	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
부틸렌글리콜	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
프로필렌글리콜	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
폴리소르베이트60	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
글리세릴 스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
밀납	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
마카데미아넛오일	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
향료	미량	미량	미량	미량	미량	미량	미량	미량	미량	미량	미량
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100

상기 표 11의 실시예 및 합성 항균제를 포함하는 비교예 4의 화장료를 이용하여 박테리아 및 곰팡이에 대한 항균 효과를 측정하였다.

먼저 박테리아에 대한 항균력 측정을 위해, 상기 실시예 8 내지 16의 화장료 및 비교예 4 및 대조군의 화장료 20-30 g에 대장균(Escherichia coli ; ATCC 8739), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa ; ATCC9027) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus ; ATCC6538)의 혼합 균액을 시료당 초기 농도가 10⁷ cfu/g 되도록 첨가 혼합하였다. 이들을 30-32℃ 항온조에서 4주간 배양하면서 1, 7, 14, 21 및 28일 간격으로 각 화장료를 1 g씩 취하여 생균수를 측정하였다.

또한 곰팡이에 대한 항균효과를 측정하기 위해 칸디다 알비칸스(Candida albicans ; ATCC10231), 페니실리움 씨트리눔(Penicillium citrinum ; KCTC2123) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger ; ATCC16404)의 혼합 균액을 시료당 10⁷cfu/g이 되도록 첨가 혼합한 후 25℃ 항온조에서 배양하면서 7일 간격으로 변취 유무와 시료표면의 균사 및 포자발생 유무를 관찰하여, 그 결과를 하기의 표 12에 나타내었다.

화장료	박테리아(cfu/g)						곰팡이*
	초기균수	1일차	7일차	14일차	21일차	28일차
실시예 8	1x107	2.5x104	4000	2000	1000	<500	-
실시예 9	1x107	8.4x104	2000	1000	500	<200	-
실시예 10	1x107	4.5x104	200	<100	<100	<100	-
실시예 11	1x107	4.1x104	500	250	<250	<250	-
실시예 12	1x107	8.5x104	300	200	200	<200	-
실시예 13	1x107	9.4x104	150	<100	<100	<100	-
실시예 14	1x107	7.0x103	<100	<100	<100	<100	-
실시예 15	1x107	2.5x103	<100	<100	<100	<100	-
실시예 16	1x107	9.8x103	<100	<100	<100	<100	-
비교예 4	1x107	4.0x106	300	<100	<100	<100	-
대조군	1x107	5.5x107	3x107	>1x108	>1x108	>1x108	+++

- : 8주간 변취 및 균사와 포자 발생이 없고 양호

+ :４주 이내에 기벽이나 뚜껑에 곰팡이 발생

++ :４주 이내에 변취 및 표면 일부에 곰팡이 발생

+++ :　4주 이내에 변취 및 표면 전체에 곰팡이 발생

상기 표 12에서 보는 바와 같이, 방부제를 사용하지 않은 대조군의 화장료 조성물은 4주 이내에 변취 및 표면 전체에 곰팡이가 발생하고, 1일만 지나도 박테리아 균이 현저하게 증가하는 것을 알 수 있다. 그러나, 본 발명의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 실시예 8 내지 실시예 16의 화장료 조성물은 박테리아 및 곰팡이에 대해 농도-의존적으로 항균효과를 나타내었으며, 약 28일이 경과한 후에는 2.0%(w/v)의 함량으로 사용(실시예 10, 13, 16에 해당)했을 때 방부제인 메칠파라벤과 이미다졸리디닐우레아를 혼합한 화장료(비교예 4)와 유사하거나 더 우수한 방부력이 확보되었고, 배양일 전체로 판단했을 때에도 본 발명의 빗죽이나무 추출물을 2.0% 이상의 함량으로 사용했을 때 합성방부제인 메칠파라벤과 이미다졸리디닐우레아를 혼합한 화장료(비교예 4)에 비해 훨씬 우수한 방부력이 확보됨을 알 수 있었다.

특히 빗죽이나무 효모균 발효 추출물(제조예 4)을 포함하는 화장료인 실시예 14 내지 16의 경우 1일차부터 강력한 항균효과를 확인 할 수 있었다. 이러한 사실로부터 본 발명의 빗죽이나무 효모균 발효 추출물은 일반 용매추출방법으로 얻은 추출물보다 발효추출물의 항균력이 더 우수함을 알 수 있었다.

상기 실험예를 근거로 빗죽이나무 추출물을 함유하는 여러 가용화 제형과 유화 제형의 화장료 조성을 제시한다. 아래와 같은 제형예에서 이를 상세히 설명하지만 본 발명의 조성물이 하기 예에만 한정되는 것은 아니다.

제형예 1

상기 제조예 1의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 중 유연화장수의 제형예는 다음 표 13과 같다.

유연화장수

성분	함량(중량%)
빗죽이나무 추출물	0.5
1,3-부틸렌글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

제형예 2

상기 제조예 1의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 중 영양화장수의 제형예는 다음 표 14와 같다.

영양화장수

성분	함량(중량%)
빗죽이나무 추출물	0.6
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트60	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

제형예 3

상기 제조예 1의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 중 영양크림의 제형예는 다음 표 15와 같다.

영양크림

성분	제형예
	함량(중량%)
빗죽이나무 추출물	1.0
글리세린	4.0
바셀린	3.5
트리에탄올아민	2.1
유동파라핀	5.3
스쿠알란	3.0
밀납	2.6
토코페릴아세테이트	5.4
폴리솔베이트 60	3.2
카르복실비닐폴리머	1.0
솔비탄세스퀴올레이트	3.1
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

제형예 4

상기 제조예 1의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 중 마사지 크림의 제형예는 다음 표 16과 같다.

마사지 크림

성분	함량(중량%)
빗죽이나무 추출물	0.5
글리세린	4.0
바셀린	3.5
트리에탄올아민	0.5
유동파라핀	24.0
스쿠알란	3.0
밀납	2.1
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	2.4
카르복실비닐폴리머	1.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.3
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

제형예 5

상기 제조예 1의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 중 팩의 제형예는 다음 표 17과 같다.

팩

성 분	함량(중량%)
빗죽이나무 추출물	1.0
에틸알코올	3.0
EDTA-2Na	0.02
프로필렌 글리콜	5.1
글리셀린	4.5
카보폴	1.0
폴리옥사이드	0.1
방부제	미량
향	미량
정제수	잔량
계	100

제형예 6

상기 제조예 1의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 중 에센스의 제형예는 다음 표 18과 같다.

에센스

성 분	함량 (중량%)
빗죽이나무 추출물	0.1
글리세린	10.0
베타인	5.0
PEG-1500	2.0
알란토인	0.1
DL- 판테놀	0.3
EDTA	0.02
벤조페논-9	0.04
하이드록시에틸 셀룰로즈	0.1
소듐 히알로루로네이트	8.0
카르복시비닐 폴리머	0.2
트리에탄올 아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
옥틸도데칸올	0.3
에탄올	6.0
보존제, 향료, 안료	미량
증류수	잔량
계	100

제형예 7

상기 제조예 1의 빗죽이나무 추출물을 함유하는 화장료 중 비누의 제형예는 다음 표 19와 같다.

비누

성 분	함량 (중량%)
빗죽이나무 추출물	0.5
야자 오일 지방산	1.5
이산화티탄	0.5
글리세린	0.5
EDTA-2Na	0.15
향료	0.7
안료	적량
비누 칩 베이스 (수분 15wt% 함유)	잔량
계	100

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
2. 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
3. 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습용 화장료 조성물.
4. 빗죽이나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빗죽이나무 추출물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빗죽이나무 추출물은 (a) 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용한 용매 추출법, (b) 초음파 추출법, (c) 초임계 추출법, (d) 발효법 또는 (e) 포제법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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