KR20050038381A

KR20050038381A - 금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR20050038381A
Application number: KR1020030073715A
Authority: KR
Inventors: 표형배; 이범천; 이동환; 김진화; 박성민; 장영학; 윤여표
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2003-10-22
Filing date: 2003-10-22
Publication date: 2005-04-27
Also published as: KR100552269B1

Abstract

본 발명은 금등화 또는 비자 추출물 중 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 능소화과(Bignoniaceae)의 낙엽성 덩굴 식물인 금등화 추출물 또는 주목과(Taxaceae)의 상록교목인 비자나무의 종자인 비자 추출물을 활성성분으로 0.001~30.0중량%, 바람직하게는 0.01~5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화효과와 피부 노화방지 효과 및 미백효과와 자외선에 의한 피부손상 완화효과, 자극완화 효과가 우수한 피부외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 금등화 및 비자 추출물은 항산화능 뿐만 아니라 인간 섬유아세포 활성효과, 피부 잔주름 개선효과, 미백효과, 자외선에 의한 피부손상 완화 효과 및 자극 완화 효과가 있어 이 물질을 이용하여 각종 기능성 화장료를 제조할 수 있다.

Description

금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물{A cosmetic composition containing extract of Campsis grandiflora and/or Torreya nucifera seed}

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐(collagen), 히아루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로, 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 기질 금속단백질 분해효소(Matrix Metalloprotease; MMP)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현량 및 활성을 조절하고자 하였다.

다음으로, 색소침착에 의한 피부 변화이다. 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분, 또는 전체적인 색소침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포상태와 혈액순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소침착이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라조이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로서, 이 멜라닌의 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다.

멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라닌형성세포의 멜라노좀에서 티로시나제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌 (dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색 (eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 각질세포의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 각질세포의 핵 주변에 축적된다.

멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 각질세포로의 이동은 부분적으로 호르몬과 자외선 등에 영향을 받고 일차적으로는 유전적인 영향을 크게 받는다. 그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다.

이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 낮으므로 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체 레벨과 유사한 흑색종 세포 배양에 의한 저해효과 평가가 요구되고 있는 실정이다. 또한 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 화장품에서는 그 사용이 금지 또는 제한되고 있다. 코직산과 아스크르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 상기 성분들을 소량 함유한 화장료는 실온에서 수 주일동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다.

이러한 피부의 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐만 아니라, 최근 천연재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 능소화과(Bignoniaceae)의 낙엽성 덩굴 식물인 금등화 및 주목과(Taxaceae)의 상록교목인 비자나무를 선정하고 이들로부터 추출물을 제조하여, 피부 항산화 효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 완화효과, 미백효과, 자외선에 의한 피부손상 완화효과 및 피부자극완화 효과를 측정한 결과 우수하므로 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

금등화는 쌍떡잎식물 통화식물목 능소화과의 낙엽성 덩굴식물로서 학명은 Campsis grandiflora이며, 능소화라고도 한다. 중국이 원산지이며 가지에 흡착근이 있어 벽에 붙어서 올라가고 길이가 10m에 달한다. 잎은 마주나고 홀수 1회 깃꼴겹잎이다. 작은 잎은 7~9개로 달걀 모양 또는 달걀 모양의 바소꼴이고 길이가 3~6cm이며 끝이 점차 뾰족해지고 가장자리에는 톱니와 더불어 털이 있다. 꽃은 8~9월에 피고 가지 끝에 원추꽃차례를 이루며 5~15개가 달린다. 꽃의 지름은 6~8cm이고, 색은 귤색인데, 안쪽은 주황색이다. 꽃받침은 길이가 3cm이고 5개로 갈라지며, 갈라진 조각은 바소 모양이고 끝이 뾰족하다. 화관은 깔때기와 비슷한 종 모양이다. 열매는 삭과이고 네모지며 2개로 갈라지고 10월에 익는다. 중부 지방 이남의 절에서 심어 왔으며 관상용으로도 심는다. 한방에서는 대소변불리, 피부소양, 좌창, 무월경, 미열, 복통, 혈열 등에 사용하였다.

비자나무는 나자식물 구과목 주목과의 상록교목으로서 학명은 Torreya nucifera이다. 유사종으로는 개비자나무(Cephalotaxus koreana Nakai) , 눈개비자나무(Cephalotaxus koreana var. nana Nak.) 가 있다.

한국과 일본에 분포하며, 토심이 깊고 비옥 적윤한 사질양토에서 자란다. 자웅이주의 상록침엽교목으로 난형 수피는 회갈색이며 줄기가 사방으로 퍼지고 노목의 것은 얕게 갈라져 떨어진다. 잎은 통상 길이 25mm, 폭 3mm이며 깃털 모양으로 배열되고 혁질이며 선형 예첨두로서 털이 없고 표면은 짙은 녹색, 뒷면은 갈색이지만 중륵과 가장자리는 녹색이며 중륵이 뒷면에만 나타난다. 뒤쪽의 주엽맥 양쪽으로 황백색의 기공선이 있다. 엽병은 길이 3mm이고 6~7년 만에 떨어진다. 종자는 핵과(核果)로서 이듬해 10월에 검붉게 익는데, 길이 2~3㎝, 지름 1~2㎝의 타원상이다. 종자의 외종피를 벗겨 말린 것을 비자(榧子) Torreyae Semen이라 한다. 예로부터 목재가 탄력이 좋아 건축재, 가구재, 조각재로 많이 쓰였으며, 기념수, 공원수, 분재로도 이용 가능하며, 종자만을 비자라고 하고 구충제로 약용한다. 식용(술안주, 강정), 채유용으로도 이용된다.

본 발명은 여러 천연물들 중 능소화과의 낙엽성 덩굴 식물인 금등화 추출물 또는 주목과의 상록교목인 비자나무의 종자인 비자 추출물을 피부외용제의 원료로서의 효능을 확인하고, 그 사용 방법을 개발하고, 이 원료를 사용함으로써 소정의 기능성을 갖는 피부외용제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 항산화효과, 콜라겐 합성 효과, 피부 잔주름 방지효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용시 자외선 조사 등에 의한 미백효과와 자외선에 의한 피부손상 완화효과, 염증매개 물질에 의한 피부 자극 완화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 금등화, 비자 추출물의 피부개선 효과를 확인하고 이들을 이용하여 피부외용제를 제조하였다.

본 발명은 금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 금등화 추출물 또는 비자 추출물은 조성물 전체에 대해서 0.001~30.0중량% 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 또는 헥산 중에서 선택된 1종 이상을 사용하여 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물은 항산화, 노화방지, 주름완화, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 및 자극완화 기능을 지니는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형의 화장료 조성물 또는 연고 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 금등화 추출물 제조

세절하여 음건한 금등화를 95%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 0.001-30.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분산/용해하여 금등화 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 비자 추출물 제조

음건한 비자를 95%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 0.001-30.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분산/용해 비자추출물을 제조하였다.

실시예 3: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1, 2에서 수득한 금등화 추출물과 비자 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 다른 항산화제 즉, 레티놀(retinol)과 BHT(Butylated Hydroxytoluene)를 비교샘플로 하였으며, NBT법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표1과 같다.

억제율(%) =〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

결과는 표 1과 같이 0.1% 농도에서 시험한 시료 모두에서 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 금등화 추출물은 레티놀과 BHT과 유사한 우수한 항산화력을 가지고 있음이 확인되었으며, 비자 추출물은 0.1% 농도에서 레티놀 및 BHT보다 우수한 항산화 효과를 나타냈다.

시료명	처리 농도(%)	항산화효과(%)
금등화 추출물(실시예 1)	0.1	92
비자 추출물(실시예 2)	0.1	98
레티놀	0.1	93
BHT	0.1	90

실시예 4: DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1, 2에서 수득한 금등화 추출물 및 비자 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물과 비타민 E와 같은 항산화제를 비교샘플로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl) 프리라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 프리라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15ml에 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

④ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2와 같다.

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

결과는 표 2와 같이 비자 추출물은 0.01% 농도에서 레티놀과 BHT과 유사한 우수한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었으며, 금등화 추출물은 0.01% 농도에서 레티놀 및 BHT보다 매우 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다.

시료명	처리 농도 (%)	항산화효과(%)
금등화 추출물(실시예 1)	0.01	82
비자 추출물(실시예 2)	0.01	30
레티놀(Retinol )	0.01	20
BHT	0.01	23

실시예 5: MMP-1 효소활성 저해효과 측정

기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성은 생화학적 모델에서 측정하였는데 이는 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접합된 콜라겐과 젤라틴의 이용을 기초로 한다(EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트, 몰큘라프루브). 클로스트리디움 히스토리티컴으로부터 정제된 콜라게나제를 상기 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트 내에 공급하였다. 돼지 피부로부터 정제하고 플로오레세인에 접합된 DQ-콜라겐과 0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂ 및 0.2mM 나트륨 아지드(pH 7.6)로 이루어지는 반응 완충액은 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트(분자 프로브스)를 이용하였다. 금등화와 비자 추출물은 상기 반응 완충액 내에 용해시켰다. 이는 4; 2; 0.4; 0.2; 0.1%(w/v)에서 테스트하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25ug/ml의 DQ-콜라겐 및 0.1U/ml의 콜라게나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분 동안 항온처리하였다.

각각의 실험조건에서 콜라게나제와 DQ-콜라겐 혼합물에 상응하는 대조용 혼합물(control)도 동일하게 항온처리하였다. 또한 각각의 실험 조건에서 블랭크(Blank), 이하 '효소 비함유 블랭크'이라 칭하는 샘플은 DQ-콜라겐의 존재 및 콜라게나제의 부재하에서 항온처리하였다. 각각의 실험은 3회 수행하였다.

15분, 45분, 120분 경과 후 DQ-콜라겐의 분해에 상응하는 신호는 형광측정기(여기:485nm, 방출:505nm)로 측정하였다. '효소 비함유 블랭크' 형광값을 기준으로 하여 각각의 샘플의 형광값을 측정하였다. 결과는 샘플 당 형광 단위 및 대조군에 대한 변이율(%)로 나타냈다.

결론적으로 선택된 실험조건하에서 0.04 내지 4%(V/V)에서 테스트된 금등화 추출물 및 비자 추출물은 투여량 의존성으로 항콜라게나제/젤라티나제 활성을 보유하였다.

결과는 표 3에 나타내었다. 비자 추출물은 0.04% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 80%를 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과 보다 우수하였으며, 금등화 추출물도 0.04%에서 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 45%를 억제하여 녹차추출물과 유사한 정도의 억제활성을 나타내었다.

실험샘플	처리농도(%, V/V)	저해율(%)
금등화 추출물(실시예 1)	0.02%	26
금등화 추출물(실시예 1)	0.04%	45
비자 추출물(실시예 2)	0.02%	55
비자 추출물(실시예 2)	0.04%	80
레티놀	0.02%	0
레티놀	0.04%	5
녹차추출물	0.02%	52
녹차추출물	0.04%	56

실시예 6: 자외선 조사에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실시예는 실시예 1내지 2에서 수득한 금등화와 비자 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고, UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅한다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/ml -nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 금등화 추출물 및 비자 추출물은 20% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수한 결과이다.

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-	-
금등화 추출물(실시예 1)	0.1	25
비자 추출물(실시예 2)	0.1	21
레티놀	0.1	18

실시예 7: B16F1 멜라닌형성세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

본 실시예는 실시예 1, 2에서 수득한 금등화 추출물 및 비자 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌형성세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백효과를 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라닌형성세포는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라닌형성세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라닌형성세포의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라닌형성세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 X 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌형성세포의 멜라닌 생성저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율 (%) = [(A-B)/A]X100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라닌형성세포의 멜라닌 생성 억제효과를 시험추출물의 IC₅₀값은 0.08%로 나타났으며, 비자 추출물의 IC₅₀값은 0.1%로 나타나, 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다(표 5).

시료명	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해효과(IC₅₀)
금등화 추출물(실시예 1)	0.1	0.08%
비자 추출물(실시예 2)	0.1	0.1%
하이드로퀴논	0.1	0.03%
알부틴	0.1	0.2%
상백피 추출물	0.1	5%
유용성 감초 추출물	0.1	0.03%

실시예 8: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실시예는 실시예 1, 2에서 수득한 금등화 추출물 및 비자 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포 (fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1X10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 금등화 추출물 및 비자 추출물을 처리한 후 24시간동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 4에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 5에 의하여 계산하였다.

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

실험결과 금등화 추출물은 자외선에 의한 세포 독성을 0.013% 농도에서 26% 억제하며, 비자 추출물은 0.013% 농도에서 59%의 세포독성을 완화하여, 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험을 통해 자외선에 의한 세포손상을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 6).

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
금등화 추출물(실시예 1)	0.013	26
금등화 추출물(실시예 1)	0.025	27
비자 추출물(실시예 2)	0.13	59
비자 추출물(실시예 2)	0.025	72

실시예 9: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실시예는 실시예 1, 2에서 수득한 금등화 추출물 및 비자 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 금등화 추출물 및 비자 추출물을 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 금등화 추출물 및 비자 추출물의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 6에 의해 계산하였다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

실험결과 금등화 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.013% 농도에서 58% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 7).

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
금등화 추출물(실시예 1)	0.013	58
금등화 추출물(실시예 1)	0.025	80
비자 추출물(실시예 2)	0.13	5
비자 추출물(실시예 2)	0.025	7

실시예 10, 11 및 비교예 1

본 실시예는 실시예 1, 2에서 수득한 금등화 추출물 및 비자 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부탄력 개선효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 8에 나타낸 바와 같다. 우선 표 8에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 10, 11 및 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 10, 11에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 3개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부탄력 개선효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 9에 Cutometer SEM 575의 △R8값으로 기재하였는데 R8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 8에서 나타난 바와 같이 금등화 추출물 및 비자 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 10	실시예 11	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8	8
	스테아린산	2	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2	2
나	금등화 추출물(실시예1)	1	-	-
	비자 추출물(실시예2)	-	1	-
	프로필렌글리콜	5	5	5
	적량	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R8)
실시예 8	0.21
실시예 9	0.26
비교예 1	0.12

n=20, p＜0.05

실시예 12 내지 13 및 비교예 2

본 실시예는 실시예 1, 2에서 수득한 금등화 추출물 및 비자 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 2dhk 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타낸 바와 같다. 우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 12, 13, 비교예 2)을 제조한다. 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 12, 13에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(△L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

미백효능 평가기준 :

-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화,

0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선

표 11에서 나타낸 바와 같이 금등화 추출물 및 비자 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 12	실시예 13	비교예 12
가	스테아릴 알콜	8	8	8
	스테아린산	2	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2	2
나	금등화 추출물(실시예1)	1	-	-
	비자 추출물(실시예2)	-	1	-
	프로필렌글리콜	5	5	5
	적량	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

	피부색의 밝기 변화( L)			숙련자의 객관적 평가			피검자의 주관적 평가
	실시예12	실시예13	비교예2	실시예12	실시예13	비교예2	실시예12	실시예13	비교예2
평균값	5.32	4.82	2.03	2.9	2.3	1.9	2.7	2.2	1.7

이하 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 1, 2에서 수득한 금등화 추출물 및 비자 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 14 내지 19에서 제조하였다. 이들 금등화 추출물 및 비자 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과 및 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화 기능 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다. 이들 금등화 추출물 및 비자 추출물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형에 첨가하여 화장료를 제조할 수 있으며, 이는 당업자가 속한 기술분야에서 용이하게 적용할 수 있으며, 본 발명의 내용이 여기에 한정되지는 않는다.

실시예 14: 실시예 1에서 수득한 금등화 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 금등화 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 15: 실시예 2에서 수득한 비자 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 2에서 수득한 비자 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 16: 실시예 1에서 수득한 금등화 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 금등화 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 17: 실시예 2에서 수득한 비자 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 2에서 수득한 비자 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 18: 실시예 1에서 수득한 금등화 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 금등화 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

실시예 19: 실시예 2에서 수득한 비자 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 2에서 수득한 비자 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 추출물은 항산화 효과와 MMP 저해 효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 잔주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한, 금등화 및 비자 추출물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과등의 미백작용을 나타내었다.

따라서, 이러한 금등화 및 비자 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 항산화 효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 항염증, 미백 등 우수한 피부 외용제 효과를 가짐을 알 수 있다.

Claims

금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 금등화 추출물 또는 비자 추출물은 조성물 전체에 대해서 0.001~30.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는, 금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 또는 헥산 중에서 선택된 1종 이상을 사용하여 것을 특징으로 하는, 금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는, 금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 항산화, 노화방지, 주름완화, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 및 자극완화 기능을 지니는 것을 특징으로 하는, 금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형의 화장료 조성물 또는 연고 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 금등화 추출물 또는 비자 추출물로부터 선택된 1종 이상을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물.