KR101815340B1 - 불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물{A COMPOSITION COMPRISING Ageratum houstonianum EXTRACT}

본 발명은 불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

과거에는 여성들이 사용하는 제품이라고 생각되던 화장품은 오늘날에는 단순한 아름다움의 표현 도구만이 아닌생활용품으로 남녀노소를 불문하고 사용하고 있으며, 산업의 발전에 따라 화장품에 대한 고급화와 다양화의 요구가 증대됨에 따라, 특별한 효과나 효능을 기대하는 ‘기능성’ 제품에 대한 관심도가 높아지고 있는 실정이다.

우리나라에서 현재 인정되고 있는 기능성 화장품은 피부의 미백에 도움을 주는 미백제품, 피부의 주름개선에 도움을 주는 주름개선 제품 및 피부를 곱게 태워주가나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 자외선 차단 제품이 있다. 일반적으로 이러한 기능성 화장품은 미용 효과뿐만 아니라 신체의 구조나 기능에 영향을 주고, 예방 및 치료 작용을 하는 화장품으로 해석되고 있다. 특히, 최근에는 화장품 전체 매출에서 기능성 화장품의 매출비중이 현저하게 증가하면서, 인체에 미치는 새로운 효능 성분을 모색하고, 이를 피부에 효율적으로 이용하고자 하는 연구가 활발히 이루어지고 있다.

사람의 피부는 표피층(epidermis)과 진피층(dermis) 및 피하지방 조직의 3개 층으로 크게 구분되며,유해미생물, 물리적 손상, 자외선 등과 같은 외부환경에 의한 물리적 자극 또는 화학적 자극으로부터 인체를 보호하는 1차적인 보호장벽의 역할을 수행한다. 또한, 피부는 인체에 필요한 각종 생리 활성 물질을 운반하는 역할을 할 뿐만 아니라, 인체의 약 65% 내지 70%에 해당하는 수분이 체외로 증발되는 것을 조절한다.

상기 표피층은 외부로부터 각질층, 과립층, 유극층 및 기저층의 순서로 구분되는데, 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고, 각질세포 사이의 세포간 지질들은 세라마이드, 콜레스테롤 또는 지방산 등과 같은 지질혼합체로 Intercellular lamellae 구조를 이루고 상기 각질세포 사이에서 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다. 상기 표피층을 구성하는 세포로는 케라티노사이트, 랑겔한스 세포, 머켈 세포 등의 다양한 세포들이 있으며, 이 중에서 대부분을 차지하는 세포가 케라티노사이트이다. 상기 케라티노사이트(keratinocyte) 즉, 각질형성세포는 기저층에서 세포 증식활동을 하고 과립층을 지나면서 케라틴을 비롯한 세포 구성성분들을 합성을 하게 되며 최종적으로 피부 각질층에 도달한다.

상기 각질층(stratum corneum)은 약 10% 내지 20%의 수분을 함유하고 인체의 최외각에 존재함으로써, 체외로의 수분 증발을 억제하여 피부 내 수분량을 적절하게 유지시키는 한편, 외부로부터의 물질의 과잉 침투를 차단하여 피부의 방어기능을 수행한다.

상기 각질층의 표면은 피지선에서 나온 피지와 땀샘에서 나온 땀으로 만들어진 얇은 천연 보호막으로 감싸져 있어서 수분의 증발을 예방할 수 있다. 예를 들어, 각질층의 수분 함량이 10% 이하로 떨어지면, 건성 피부 증세가 나타나 피부가 갈라지거나 거칠어진다.

이러한 각질층을 구성하고 있는 각질세포에는 수용성 성분인 고농도의 자연보습인자(Natural Moisturizing Factor, NMF)가 존재하여 피부가 탄력과 유연성을 유지하도록 작용함은 물론 적절한 수분을 유지할 수 있도록 돕는데, 예를 들면 아미노산과 같은 물질은 수용성 성분일 뿐 아니라, 효과적으로 수분과 결합하여 피부에서 수분이 건조되는 것을 억제한다.

상기 피부장벽 기능을 좌우하는 각질층의 방어기능을 약화시키는 요인은 내적요인과 외적인 요인으로 구분될 수 있다. 상기 내적 요인으로는 질병, 유전적인 결함 또는 노화 등이 있으며, 상기 외적 요인으로는 비누나 세제의 잦은 사용, 자외선, 악조건의 온·습도 환경에서의 장기 노출 또는 좋지 않은 식습관 등이 있다. 이러한 요인에 의한 각질층의 손상은 피부 질환으로 연결되며, 각질층의 주요 지질성분인 세라마이드의 부족은 피부건조증, 건선염 또는 아토피성 피부염 등과 같은 다양한 질환으로 이어지게 된다.

상기 각질세포는 기저층으로부터 피부 최외각층인 상기 각질층까지 28일을 주기로 하여 사라지고 다시 만들어지는 과정을 거치면서 피부의 건강을 유지시켜 준다.

상기 각질층에 도착한 세포들은 각질(keratin)이 되어 납작하게 죽은 세포들로서 하루에 수백만 개의 죽은 각질세포가 피부에서 떨어져 나가고 새 각질 세포로 교체된다. 상기 납작하게 된 각질 세포는 마치 벽돌을 쌓아 놓은 듯 층층이 단단하게 연결되어 있어 각질층을 강하게 만드는 동시에, 자유로운 움직임으로 설명되는 유연성을 획득하고 방어벽으로서 기능을 나타내는 것이다.

상기 각질세포는 차례차례로 계속해서 만들어지고, 최외층의 오래된 각질세포가 때로 이탈해가기 때문에 표피는 일정한 두께를 유지한다. 이렇게 통상적으로 새로운 세포층으로 바뀌어 가는 것을 턴오버(turnover)라고 하며,부위나 나이에 따라 다르지만 정상적인 피부에서 이 표피의 턴오버는 대략 28일간이라고 보고되고 있다.

그러나, 이러한 각화 과정이 순조롭지 못하면 비정상적인 각질 세포가 생성되고 피부 표면에 쌓여, 각질층이 두꺼워지고 피부가 거칠어지며, 피부가 칙칙해져 화장을 잘 안 받게 된다든지 또는 생기 없어 보이게 된다.

따라서, 여성들은 이러한 현상을 극복하고자 노력하고 있으며, 더불어 화장품 업체들은 피부의 칙칙함을 해소하고자 노폐 각질의 박리와 보습을 이용한 여러 가지 화장품을 출시하고 있다.

상기 각질 제거의 방법으로는 물리적인 방법과 생리적인 방법이 있는데, 물리적인 방법을 통한 각질 제거용 화장품으로 가장 대표적인 품목은 팩 제품이다. 상기 팩 제품은 일반적으로 타입에 따라 필 오프(peel off) 팩과 워시 오프(wash off) 팩으로 나뉠 수 있다. 상기 필 오프 타입은 팩 제품을 얼굴에 바르고 일정 기간이 경과하여 피막이 건조되면 떼어내는 형태를 말하며, 워시 오프 타입은 팩 제품을 얼굴에 바르고 난 후 물에 씻어내는 형태의 제품을 말한다. 각질 제거 효과는 강한 피막을 형성하여 각질을 뜯어내는 형태의 제품인 필 오프 타입의 제품이 훨씬 우수하지만 피부 자극 등의 문제점이 있고, 워시 오프 타입의 제품은 자극의 문제점은 없으나 각질 제거 효과에 대한 소비자의 만족도가 매우 떨어진다. 이외에도 물리적인 마찰로 각질을 제거하도록 하는 스크럽제 함유 제품 등이 있는데, 이들은 뜯어내는 팩 제품에 비하여 자극도는 떨어지지만 역시 피부 자극의 문제점이 있다.

한편, 피부 노화는 피부가 햇빛, 추위, 바람, 환경 오염물질과 같은 외인성 자극에 지속적으로 노출됐을 때 발생하는 현상이며, 이중 자외선에 의한 영향이 가장 크다. 특히, 최근 환경오염으로 인해 자외선을 차단해 주는 오존층이 약화되면서 피부에 직접 조사되는 생활자외선의 양은 날로 급속히 증가하고 있는 실정이다.

상기 자외선은 파장의 길이에 따라 크게 3가지 즉, 자외선 A(UVA), 자외선 B(UVB) 및 자외선 C(UVC) 나눌 수 있다. 상기 자외선 C는 공기층의 오존층에 완전히 흡수되어 지표면에 도달하지 못하므로, 대기중의 자외선은 자외선 A 및 자외선 B로 구성된다.

상기 자외선 A는 표피 내에서의 흡수가 적고 자외선 B 보다 좀더 깊숙이 침투할 수 있으며, 주로 혈관의 손상과 진피 내 세포침윤을 일으키고, 멜라닌 형성을 촉진하는 등 피부 노화 및 피부 자극을 유발하는 반면, 자외선 B는 짧은 시간 동안 과도하게 노출되면 피부의 표피까지 침투되어 홍반, 주근깨 또는 부종 등을 유발한다.

최근에는 환경오염으로 인한 오존층의 파괴로 지표에 도달하는 자외선 양이 많아 피부의 질환에 자외선이 미치는 영향에 대한 보고가 증가되고 있는 추세이다. 환경적인 문제로 인한 자외선의 영향은 1차적으로는 자외선 B에 의한 것으로 급성노출 시에는 홍반, 열, 부종 또는 통증 등이 일어나고, 그 다음에 표피가 비후되는 현상이 나타나며, 만성적으로 노출되면 피부의 노화와 육종형성이 유발된다.

한편, 모공이란 피지선에서 분비되는 유분이 피부 표면으로 흘러나오는 작은 구멍으로, 털이 자라나는 입구를 말한다. 피부에는 cm² 당 100개 내지 120개의 모공이 존재하며, 사람의 얼굴엔 약 2만개의 모공이 있다. 일반적으로 모공의 지름은 약 0.02 mm내지 0.05 mm로 매우 작아 보통 눈에 잘 띄지 않으나 나이, 계절, 여성의 생리주기, 임신 또는 스트레스 등에 의해 피지 분비가 과다해지면 눈에 띌 만큼 커져 보기 흉해지기도 한다.

모공이 넓은 피부는 깨끗해 보이지 않을 뿐만 아니라 무엇보다 항상 얼굴이 번들거려 지저분하게 보인다.또한, 모공이 열려 있으면 모낭 내로 세균이 침입하기 쉬워져 피부 트러블을 일으키기 쉽게 된다. 이에 따라 많은 이들이 모공축소에 큰 관심을 가지게 되어 화장품을 이용한 모공의 관리가 중요하게 되었다.

모공이 확장되는 원인에는 피지 과다 분비, 피부 노화 또는 모공 속 노폐물 축적 등이 있다. 우선 피지 과다분비의 경우, 피지 분비가 많아지게 되면 많아진 피지를 배출하기 위해 모공이 커지게 되며, 피지가 모공을 통과하는 과정에서 장애가 생기게 되면 모공은 점점 더 커지게 된다. 사춘기 이후 본격적으로 피지 분비가 늘어나면 피지가 나오는 길인 모공은 넓어지게 되며, 피지가 과도하게 분비되면 모공이 피지 분비량을 따라가지 못해 막히고 이로 인해 여드름의 원인이 된다.

상기 과도한 피지 분비는 자외선과 깊은 관계가 있다. 상기 자외선은 피지 분비 촉진 작용을 하는 것으로 보고 되고 있다. 일 예로, 자외선 양이 많은 여름철에는 금방 세안을 해도 곧 얼굴이 번들거리나, 자외선 양이 비교적 적은 겨울에는 지성 피부라도 번들거리는 것이 덜하게 된다. 일반적으로 지성 피부 또는 여드름 피부인 사람들은 피지의 분비가 많으므로 점차 모공이 늘어나게 된다.

또한, 일반적으로 20대 후반부터 모공이 커지게 되는데, 이는 피부가 나이 들면서 케라티노사이트와 섬유아세포(fibroblast)의 활성이 감소하게 되고, 콜라겐 합성능력 및 엘라스틴 합성능력의 감소되기 때문이다.

상기 콜라겐 합성능력 및 엘라스틴 합성능력의 감소로 인해, 수분보유능력이 감소하면서, 피부의 탄력이 감소하고, 피부의 탄력이 떨어지면서 모공 벽을 지지하던 콜라겐과 탄력섬유가 점차 감소하고, 모공을 조여주는 힘이 떨어지기 때문에 최종적으로 모공이 늘어나게 된다.

상기한 바와 같이, 모공이 넓어지면 그 속으로 세균들이 침입하기 쉬워지므로 여드름과 같은 피부 트러블이 일어나기 쉬워진다. 또한, 화장이 잘 받지 않을 뿐만 아니라 칙칙하고 지저분하게 보이고, 미세한 먼지나 화장찌꺼기 등 노폐물이 끼어 큰 모공이 더욱 두드러져 보이므로 깨끗한 피부를 가지지 못하고 얼굴이 지저분해지는 결과를 얻게 된다.

화장품은 의약품과는 달리 일상 생활에서 매일 또는 장기간에 걸쳐 연속하여 이용하는 것이기 때문에, 여러 가지 조건을 염두에 두어 사용상 안전해야 하고 부작용은 허용되지 않아야 한다. 따라서, 기존 화학제품을 사용하던 기능성 화장품 분야의 경우에도, 이러한 화장품의 특성을 고려하여 안전성이 보장되는 천연 식물 유래 물질로 기능성 성분을 대체하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

일 예로, 자외선에 의한 피부 손상 방지를 목적으로 사용되고 있는 자외선 차단제의 경우, 최근 끈적이고 번들거려 사용감이 나쁘며 분자형태로 피부에 흡수될 수 있어 피부자극을 유발하는 화학적 자외선차단제의 단점과 무거운 사용감과 백화 현상을 유발하여 미용적으로 적절하지 못하다는 물리적 자외선차단제의 단점을 극복하기 위해, 무기물이나 고분자 입자 표면에 무기차단제인 이산화티탄을 흡착시키거나 입자 내부에 유기차단제를 함유하는 형태 또는 이산화티탄이나 산화아연과 같은 무기물을 초미립자로 제조하여 기존 무기차단제의 단점을 보완하고 고효율의 차단효과를 갖는 형태가 제안되고 있다. 그러나, 이러한 화학 물질을 재료로 한 유기 자외선차단제 또는 무기 자외선차단제는 그 부작용이 문제가 되고 있다. 이러한 이유로, 인체에 전혀 무해한 천연 자외선차단제에 관심이 증대되고 있다.

상기와 같은 피부 보호와 관련된 천연 물질 유래 화장료 조성물에 대한 연구는 현재까지 다양하게 제안되고 있는 실정이다. 일 예로, 모공과 관련된 피부 트러블을 개선하는 방법으로 수렴제로서 홍경천 추출물을 이용하여 모공을 수축시키는 방법(대한민국 공개특허 제1997-0070601호) 이 제시되었고, 허브 추출물을 화장료에 적용시켜 피지 분비를 억제하여 모공수축의 효과를 얻는 방법(대한민국 공개특허 제 2003-0034474호)이 제시되었으며,인삼 추출물 및 풍란 추출물을 화장료에 적용시켜 각질을 제거하는 방법(대한민국 공개특허 제2010-0041233호)이 제시되었고, 매실 추출물을 화장료에 적용시켜 피부 각질을 제거하고 피부 보습효과를 얻는 방법(대한민국 등록특허 제0845723호)이 제시되었다.

한편 불로화(不老花)는 Ageratum houstonianum이라는 학명을 가진 국화과 등골나무아재비속의 일년생 풀이다. 잡초로 취급하기도 하고 관상용으로 보기도 하는 풀인데 도 1에서 보는 꽃이 봄부터 가을까지 오래 핀다고 해서 불로화라고 불린다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 신규한 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 불로화 추출물은 불로화 알코올 추출물인 것이 바람직하고, 메탄올 추출물인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 항산화 활성을 가지는 것이 바람직하고, 보습 활성을 가지는 것이 바람직하며, 주름개선 활성과 피부노화 억제 활성 및 피부 염증 억제 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부염증 및 피부 노화 억제용 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 불로화에 알코올을 처리하여 얻어진 용액을 통하여 불로화 추출물을 확보하는 단계를 포함하는 본 발명의 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 불로화의 메탄올 추출물에 대한 항산화효능, 보습효능, 주름개선효능, 피부노화효능을 시험한 결과 대조군에 비해서 우수한 효능을 보였기 때문에 기능성화장품으로서 효능을 가진다고 판단하였다.

본 발명에서 외용제란 일반적으로 외용에 사용하는 조성물 전반을 포괄하는 개념이고, 예를 들어, 기초 화장료,메이크업 화장료, 모발용 화장료 등 각종 화장료를 포함하는 화장료 조성물이나 연고제 등의 다양한 의약품 내지 의약외품 등으로 폭넓게 적용 가능한 것을 말하며, 바람직하게는 화장료 조성물, 더욱 바람직하게는 기능성 화장료 조성물 또는 기능성 화장품일 수 있다.

상기 외용제에는 유효성분 외에 사용용도 및 외용제 조성물의 성질에 따라 통상 외용제에 배합되고 있는 성분,일예로 보습제, 자외선 흡수제, 비타민류, 동식물 추출성분, 소화제, 미백제, 혈관확장제, 수렴제, 청량제, 호르몬제 등을 추가로 배합한 것일 수 있다.

상기 외용제의 제형은 사용용도 및 외용제 조성물의 성질에 따라 적절한 형태를 취할 수 있으며, 일예로 수용액계, 가용화계, 유화계, 유액계, 겔계, 페이스트계, 연고계, 에어졸계, 물-기름 2층계, 물-기름-분말 3층계일 수 있으며, 상기 제형에 의해 본 발명의 외용제의 제형 및 형태가 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 외용제는 유효성분 즉, 불로화 추출물 조성물을 피부조직으로 침투 또는 이행시키기 위해서 필요한 기제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 유효성분은 외용제 총 중량을 기준으로 0.01 내지 30 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하기로는 0.05 내지 20 중량%일 수 있으나, 함량은 제형 또는 외용제에 함유되는 유효성분 외의 성분의 함량에 따라 적절히 조절할 수 있다.

상기 본 발명의 일 예인, 상기 불로화 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보효용 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에, 통상의 화장품에 사용가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 향료, 색소, 살균제,산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 부형제, 희석제, 무기염류 및 합성 고분자 물질 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은, 기초화장품, 메이크업 화장품, 바디 화장품, 두발용 화장품, 두피용 화장품 또는 면도용 화장품의 용도로 제공될 수 있다. 상기 기초화장품의 예로는 크림, 화장수, 팩, 마사지 크림, 유액 등이 있으며, 상기 메이크업 화장품으로는 파운데이션, 메이크업 베이스, 립스틱, 아이새도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬 등이 있으며, 바디 화장품으로는, 비누, 액체 세정제, 입욕제, 선스크린 크림, 선 오일 등이 있으며, 두발용 화장품으로는 샴푸, 린스, 헤어 트리트먼트, 헤어 무쓰, 헤어 리퀴드, 포마드, 헤어 칼라제, 헤어 블릿치제, 칼라 린스가 있으며, 두피용 화장품으로는 헤어 토닉, 스칼프 트리트먼트가 있으며, 면도용 화장품으로는 애프터셰이브로션, 셰이빙 크림 등이 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물에는 통상 화장료에 배합되는 다른 성분이 더욱 포함될 수 있다. 보다 상세하게, 상기 통상 화장료에 배합되는 다른 성분은 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기안료 및 무기안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소,향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제 또는 정제수 등일 수 있다.

상기 유지 성분은 구체적으로 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지 또는 식물 유지 등일 수 있다.

상기 에스테르계 유지는 일 예로, 트리-2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리-2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라-2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실,올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴,네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실,아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산 콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산 피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 1,2-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 1,2-스테알로일히드록시스테아르산 스테아릴 또는 1,2-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등일 수 있다.

상기 탄화 수소계 유지는 일 예로 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀,유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스 또는 와셀린 등일 수 있다.

상기 실리콘계 유지는 일 예로 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산,데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유 또는 아미노 변성 실리콘유 등일 수 있다.

상기 불소계 유지는 퍼플루오로폴리에테르 등일 수 있다.

상기 동물 유지 또는 식물 유지는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유,소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지, 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린 또는 경화피마자유 등일 수 있다.

상기 계면활성제는 구체적으로 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 또는 양성 계면활성제일 수 있다.

상기 음이온성 계면 활성제는 일 예로, 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염 또는 퍼플루오로알킬인산에스테르 등일 수 있다.

상기 양이온성 계면 활성제는 일 예로, 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄,브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드 또는 라놀린 유도체 제4급 암모늄염 등일 수 있다.

상기 양성 계면 활성제는 일 예로, 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형,아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형 또는 아미드아민형의 양성계면 활성제 등일 수 있다.

상기 안료는 유기안료, 무기안료 및 이들의 복합 안료 등일 수 있다.

상기 무기안료는 일 예로 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이,벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄,산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체 등일 수 있다.

상기 유기안료는 일 예로 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트 오렌지 및 이들의 복합체 등일 수 있다.

상기 유기 분체는 일 예로 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염;N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 사불화에틸렌 등일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 공지된 자외선 차단제를 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 자외선 차단제는 유기 자외선 차단제 및/또는 무기 자외선 차단제일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다.

또 본 발명은 불로화 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 및 피부 노화 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 염증성싸이토카인 TNFα에 의한 NF-kB 인산화 반응을 감소시키는 것이 바람직하고, TNFα에 의한 매트릭스 메탈로프로테인아제(MMP)-9 mRNA 발현을 감소시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다물.

본 발명의 약학 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율,치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 불로화 추출물 및 이의 분획물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 불로화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있으므로, 피부 노화, 예를 들면, 피부 위축, 콜라겐 손실, 탄성 섬유 손실, 결합 조직 손실, 셀룰라이트, 주름 형성 등의 예방 또는 개선을 목적으로 상기 불로화 추출물 또는 이의 분획물을 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류,소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 불로화 추출물 또는 이의 분획물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴,스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 불로화 추출물 또는 이의 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 불로화 추출물 또는 이의 분획물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 불로화 추출물 또는 이의 분획물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 불로화 추출물은 염증성싸이토카인 TNFα에 의한 NF-kB 활성을 억제시켜 피부 염증 반응을 억제시키며, TNFα에 의한 MMP-9 유전자 발현을 감소시켜 피부의 콜라겐 분해를 저해시켜 화장료 및 의약품 등에 사용될 수 있다.

도 1은 불로화에 대한 사진;
도 2는 불로화 추출물의 항산화효능을 나타낸 그림;
도 3은 불로화 추출물의 보습효능을 나타낸 그림;
도 4는 불로화 추출물의 주름개선효능을 나타낸 그림;
도 5는 불로화 추출물의 피부 염증 억제 효능을 나타낸 그림;
도 6은 불로화 추출물의 NF-kB 전사 활성 억제 효능을 나타낸 그림;이며
도 7은 불로화 추출물의 피부 노화 억제 효능을 나타낸 그림이다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1. 불로화 추출물의 확보

꽃이 핀 불로화를 음지에서 건조시킨 후 분쇄하여 메탄올로 침지하였다. 3일간 침지한 불로화 메탄올 용액을 여과한 후 거른 용액을 감압증류하여 잔류물을 모으고 이것을 다시 동결건조시켜서 불로화 메탄올 추출물을 확보하였다.

실시예 2. 불로화 추출물의 항산화효능

항산화 활성을 측정하기 위하여 DPPH (2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl)를 이용하였다. 준비된 Tris-HCl(100mM, pH7.4-7.5) 1ml에 미리 준비된 시료(1mM) 100ul와 0.2mM의 DPPH를 첨가하여 10초간 교반하고 20초 동안 방치 후 30초 동안 간격을 두고 약 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 항산화 활성을 위한 표준물질은 비타민-C를 이용하였으며 자외선 분광기(UV spectrophotometer)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 0.1% 비타민-C가 40%의 DPPH 소거능을 보였고, 불로화 추출물은 10ppm 이하에서는 비타민-C보다는 약하나 50ppm 이상의 농도에서는 0.1% 비타민-C보다 더 좋은 항산화 효능을 보였다. 항산화효능은 에이징을 억제하는 것으로 알려져 있기 때문에 불로화 추출물은 항노화효능을 보인다고 판단하였다.

실시예 3. 불로화 추출물의 보습효능

아쿠아포린은 막 단백질의 일종으로 수분통로 역할을 담당하는 것으로 알?? 있다 (Proc. Nadl. Acad. Sci. USA 91:6255 (1994). 최초의 아쿠아포린은 1991년 피터 아그레에 의해서 정확하게 규명되었고 이로 인해 아그레는 2003년 노벨상을 수상하였다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Dec 15;88(24):11110). 아쿠아포린 패밀리는 여러 종류가 알려졌으나 이들 중 아쿠아포린-3가 수분 통로에 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있어서 아쿠아포린-3를 활성화시키는 물질에 대한 연구가 활발하다. 즉, 아쿠아포린-3를 활성화시키는 물질은 피부의 보습기능과 연관이 있기 때문이다 (Journal of Investigative Dermatology 131:865 (2011). 아쿠아포린-3의 활성효능을 시험하는 방법은 여러 가지가 있으나 보편적으로 reverse transcription-PCR (RT-PCR) 방법이 사용된다. normal human epidermal keratinicytes (Kurabo, Osaka, Japan)를 DMEM (Invitrogen) 배지에 배양하였다. RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 RNA를 isolation하였다. cDNA는 total RNA로부터 Quantitect SYBR green RT-PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 reverse transcript하였다. 자세한 실험방법은 이미 발표된 논문 방법을 따랐다 (Journal of Investigative Dermatology 131:865 (2011). 아무 것도 처리하지 않은 경우에 발현된 아쿠아포린-3 레벨을 1로 할 때 불로화 추출물 10ppm 농도로 처리한 경우는 2.5배 아쿠아포린-3 발현이 증가되었다. 따라서 불로화 추출물은 보습효능이 있다고 판단하였다.

실시예 4. 불로화 추출물의 주름개선효능

피부노화는 주름형성으로 나타나게 된다. 콜라겐은 피부조직에서 extracellular matrix fibrillar 분자로서 세포외 물질의 약 80를 구성하고 있다. 따라서 피부 탄력과 팽팽함에 기여하게 된다. 20여 종 이상의 콜라겐이 알?? 있는데 이들 중 type I 콜라겐은 피부에서 가장 많은 형태로 알려져 있다. 콜라겐은 프로콜라겐의 절단으로부터 만들어져서 생성된다. procollagen type-I C-peptide의 증가는 콜라겐 형성으로 이어지기 때문에 주름개선효능 측정에 procollagen type-I C-peptide 양의 증가 여부가 주름개선효능 시험에 널리 사용되고 있다. ELISA를 이용한 측정방법이 널리 이용되고 있다. 본 실험에서는 Procollagen Type I C-Peptide (PIP) EIA Kit (Takara)를 사용하였고 자세한 실험방법은 제조사의 매뉴얼을 따랐다. 불로화 추출물을 10ppm 처리한 결과가 처리하지 않은 경우에 비해서 1.5배 procollagen type-I C-peptide가 증가한 결과를 얻었기 때문에 불로화 추출물은 주름개선효능이 있다고 판단하였다.

실시예 5. 불로화 추출물의 피부 염증 억제 효능

피부는 표피(epidermis)와 진피(dermis)로 구성되어 있다, 표피에는 각질형성세포와 멜라닌 세포가 있으며, 진피에는 섬유모세포(fibroblast)가 있어 교원섬유와 탄력섬유(elastin) 등의 결합조직을 생성시켜 피부의 탄력을 유지시켜 준다, 피부 노화가 진행되면 염증세포가 증가되고, 진피의 대표적 교원섬유인 콜라겐, collagen)의 감소 현상이 두드러지게 나타난다. 진피의 교원섬유를 분해시키는 대표적 단백분해효수는 MMP(matrix metalloprotease)이며, 현재 약 26개 종류가 발견되어 있다. 이중에서 피부 노화에 직접적으로 영향을 주는 MMP는 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9으로 잘 알려져 있다 (Aging Res Rev 2002;1:705-20)(J Invest Dermatol 2000;115:177-82).

자외선에 지속적으로 노출되면 섬유모세포(fibroblasts)와 염증탐식세포(macrophages), 단핵구(monocytes), 각질세포(keratinocytes) 등에서 대표적 염증성 싸이토카인인 TNFα(tumor necrosis factor alpha)가 분비되어 (J Invest Dermatol 2009;129:994-1001), 콜라겐 합성이 억제되고 (J immunol 1996;156:4354-62), 전사인자 NF-kB 활성이 증가되어 MMP-9 효소 유전자 발현이 증가됨으로써 (Biol Pharm Bull 2011;34:890-3), 콜라겐 등의 피부 결체조직 분해가 촉진되어 피부 노화 과정이 촉진된다 (Climacteric 2013;16:514-21).

본 발명에서는 불로화 추출물에 의한 피부 염증 억제 효과를 조사하기 위하여 불로화 추출물이 염증성싸이토카인 TNFα에 의해 증가되는 NF-kB 인산화 억제효과를 면역블롯법으로 조사하였다. 사람 각질세포주 HaCaT 세포를 ATTC(American Type Culture Collection)로부터 구입하여 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies), Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies) 포함한 DMEM/F12(Invitrogen Life Technologies) 배양액을 2일에 한 번씩 100-mm 세포배양접시에 1 x 10⁶의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 불로화 추출물에 의한 NF-kB 활성 억제 효과를 분석하기 위하여, HaCaT 세포에 TNFα (sigma에서 구입)를 10 ng/ml 농도로 단독 처리하거나, TNFα 처리 30분전에 불로화 추출물을 처리하였다. TNFα 처리하고 60분 경과 후에 세포를 수확하여, 20mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 10㎍/㎕ Leupeptin, 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유하는 완충용액으로 세포를 용해시킨 후, 고속원심분리하여 세포 용해액만을 수확하였다. 동량의 단백질이 포함되도록 제조된 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포에 존재하는 단백질들을 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 폴리스틸렌 막(polystyrene membrane)으로 옮긴 후 serine-536 잔기가 인산화된 NF-kB (Ser 536)만을 인지하는 일차 항체(Cell Signaling Technology 회사에서 구입)와 대조군으로서 단백질 발현이 변화되지 않는 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 인지하는 일차항체(Santa Cruz technology 회사에서 구입)를 각각 5시간 반응 시킨 후, 일차항체를 인지하는 이차항체(Cell Signaling Technology 회사에서 구입)를 1시간 동안 반응시켰다. 화학형광감지 시스템(chemiluminescence)(Amersham Pharmacia Biotechnology에서 구입)을 이용하여 단백질 변화량을 분석하였다.

그 결과 도 5 (불로화 추출물의 피부 염증 억제 효과를 조사한 것이다. 피부각질세포에서 염증성 싸이토카인 TNFα를 처리하고 불로화 추출물이 다양한 염증 매개인자들의 유전자 발현을 촉진하는 NF-kB 활성 인산화를 억제시키는 효과를 면역블롯법을 이용하여 조사)에 나타난바와 같이 10 ng/mL TNFα를 HaCaT 세포에 처리하면 대조단백질인 GAPDH의 양은 변하지 않았지만, p65/NFkB 단백질의 serine-536 잔기에서 인산화 형태가 증가되었다. 이와 같은 결과는 TNFα가 NF-kB 활성을 증가시킨다는 것을 의미한다. 불로화 추출물과 TNFα를 병행 처리하면 TNFα에 의한 NF-kB의 인산화 증가가 감소되었다. 이러한 결과는 불로화 추출물이 염증성싸이토카인 TNFα에 의한 NF-kB 인산화 반응을 감소시켜 피부 염증 반응을 억제시키는 것으로 생각할 수 있다.

실시예 6. 불로화 추출물의 NF - kB 전사 활성 억제 효능

불로화 추출물에 의한 NF-kB 인산화 억제가 NF-kB의 전사활성능에 영향을 주는지 관찰하기 위하여 루시퍼라아제 리포터 실험법(luciferase reporter assay)을 이용하였다. 전사인자 NF-kB가 활성되면 루시퍼라제 (Luciferase) 유전자가 발현되어 루시퍼라제 효소 활성이 증가되므로, 루시퍼라제 효소 활성 변화는 NF-kB의 전사능 변화를 의미하는 것이다. 상기의 HaCaT 세포에 NF-kB 결합 서열을 함유하는 0.5 ㎍의 리포터 플라스미드 (pNFkB-Luc)를 퓨진6 (Fugene6)를 이용하여 세포내로 주입(transfection)시킨 후, 48 시간 후에 10 ng/mL TNFα 단독 또는 10 ng/mL TNFα와 불로화 추출물을 병행 처리하였다. 세포를 12시간 더 배양한 후 수확하여 세포를 용해시킨 후, 세포 용액 단백질에 기질인 루시페린(luciferin)을 50㎕ 첨가하여 발광되는 루시페린 형광을 측정하였다. 루시페린 형광은 Promega 회사에서 구입한 Dual-Glo Luciferase Assay System을 이용하여 측정하였다. 도 6 (불로화 추출물에 의해 염증성 싸이토카인 TNFα 자극에 의해 증가되는 NF-kB의 전사활성 억제 효과를 루시퍼라제 리포터 측정법으로 조사)에 나타난 바와 같이 TNFα는 루시퍼라제 효소 활성을 약 2.5배 증가시켰다. 이와 같은 결과는 TNFα에 의해 N-FkB의 전사활성이 증가 된다는 것을 의미하는 것이다. 이때, 본 발명의 불로화 추출물을 TNFα와 병행 처리해주면 TNFα에 의해 증가되는 루시페라제 활성이 감소 되는 것이 관찰되었다. 따라서 본 발명의 불로화 추출물은 TNFα에 의해 활성되는 NF-kB 활성을 억제시킴으로써 피부 염증반응을 억제시키는 것으로 생각할 수 있다.

실시예 7. 불로화 추출물의 피부 노화 억제 효능

전사인자 NF-kB 전사 활성이 증가되면 MMP-9 효소 유전자 발현이 증가되어 (Biol Pharm Bull 2011;34:890-3), 직접적으로 콜라겐 등의 피부 결체조직이 분해되고 피부 노화 과정이 촉진된다 (Climacteric 2013;16:514-21). 본 발명의 불로화 추출물이 MMP-9 단백분해효소 유전자 발현을 억제시키는지 알아보기위하여, real-time PCR법을 이용하여 조사하였다. 상기의 HaCaT 세포에 TNFα 단독 또는 TNFα와 불로화 추출물을 병행처리한 후 24 시간 후에 세포를 수확하여 Trizol RNA extraction kit (QIAGEN 회사에서 구입)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA 0.5 ㎍을 역전사반응으로 1차 가닥(first strand) cDNA를 합성하고 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-RAD회사에서 구입)를 이용하여 이중나선 cDNA를 합성하였다. 이중나선 cDNA 0.0125㎍ 으로 PCR을 이용하여RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 후 TaqMan-iQ supermix kit (Bio-Rad 회사에서 구입)를 이용하여 PCR을 수행하였다. MMP-9 mRNA 측정을 위한 TaqMan probe 염기서열은 5′-FAM-cctccaaccaccaccacaccgcagc-BHQ-1-3′ 이었으며, normalize용 대조군으로써 사용한 GAPDH mRNA 측정을 위하여 사용한 TaqMan probe 염기서열은 5′-Yakima Yellow cgtcgccagcccagccacgc-BHQ-1-3′ 이었다.

도 7(불로화 추출물이 염증성 싸이토카인 TNFα 자극에 의해 증가되는 콜라겐 분해 효소인 MMP-9 유전자 발현을 억제시키는 효과를 Real-time PCR법을 이용하여 조사)에 나타난 바와 같이 TNFα를 HaCaT 세포에 처리하면 MMP-9 mRNA는 약 144배 증가하였다. 그러나, 불로화 추출물을 TNFα 자극 30분전에 처리해주면 TNFα에 의한 MMP-9 mRNA 발현이 현저하게 감소되었다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 아쿠아포린-3 발현을 증가시키는 불로화(Ageratum houstonianum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 불로화 추출물은 불로화 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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