KR102096347B1 - 효능과 열안정성이 강화된 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물은 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 상기 천연 추출물은 얼레지 추출물, 낭아초 추출물, 산수국 추출물, 개망초 추출물, 불로화 추출물, 돌콩 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연추출물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물에 의하는 경우 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 조성물로 우수한 피부 질환 개선 또는 피부 재생 촉진에 효과를 제공할 수 있다.

Description

효능과 열안정성이 강화된 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물{COMPOSITIONS CONTAINING EFFICACY AND THERMAL STABILITY ENHANCED EPIDERMAL GROWTH FACTOR PROTEIN AND NATURAL EXTRACTS FOR IMPROVING SKIN DISEASES AND SKIN REGENERATION}

본 발명은 효능과 열안정성이 강화된 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진에 우수한 효과가 있다고 알려진 EGF 단백질에 천연 추출물을 포함하여, 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진을 보다 향상시킨 조성물에 관한 것이다.

피부계는 인체 외부를 덮고 있는 기관으로 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로의 기능 등 다양한 기능을 가지고 있다. 이러한 피부는 가장 안쪽에서부터 피하지방층, 진피 및 표피의 세개층으로 구성되어 있다. 이중 피하지방층은 지방세포로 이루어져 있고, 피부층 가장 안쪽에 위치한다. 피하지방층 상부에 위치한 진피는 콜라겐 섬유와 탄력 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어져 있으며, 혈관, 신경, 땀샘 등이 있다. 가장 바깥쪽에 위치한 표피는 중층편평상피의 각질형성세포가 대부분을 차지하고 있다.

그런데, 이러한 피부 표면은 자외선, 건조한 날씨, 차가운 바람, 잘못된 세안습관과 같이 외부의 유해 환경으로인해 끊임없이 손상되고 있다. 이 때문에 피부를 구성하는 가장 바깥부부분인 외피세포는 끊임없이 벗겨져 제거되고, 그 밑에 자라나는 다른 세포들이 그 자리를 대신하는 과정이 계속 되고 있다.

현대인들의 피부에 대한 관심이 높아짐에 따라, 최근에는 이러한 피부 손상을 인위적으로 유도하기 위해, 화학 약품이나 레이저를 이용하여 피부의 일부를 다양한 정도로 벗겨내는 박피시술이 큰 인기를 얻었다. 박피시술은 새로운 표피의 생성을 유도하고, 진피의 콜라겐 섬유의 생성을 자극하는 시술로서, 이는 여드름, 흉터, 주름살, 색소성 병변, 넓어진 모공의 치료에 이용된다. 이러한 박피술은 인위적으로 피부에 창상을 발생시키는 경우인데, 창상이란 외부의 압력에 의하여 조직의 연속성이 파괴되는 모든 상태를 지칭한다.

피부에 창상이 발생할 시, 첫째로 진피가 재생되며 이와 동시에 표피가 재생된다. 좀 더 구체적으로, 피부에 상처가 나면 진피의 비만세포가 히스타민을 분비하여 혈관이 확장되고, 확장된 혈관으로 염증세포(백혈구, 혈소판 등)가 모여들게 된다. 모여든 염증세포 중 백혈구가 사이토카인을 분비하면 진피의 탄력을 유지시켜 주는 섬유아세포를 활성화시켜 콜라겐과 뮤코다당 등의 물질을 분비하게 한다. 이후, 상처에 의해 찢어진 표피는 세포 이동에 관련된 유전자를 활성화시키고 결과적으로는 표피가 재생된다.

이러한 창상 치유 과정을 조절하는 대표적인 물질 중의 하나로 성장 인자(growth factor)를 들 수 있는데, 이들은 창상 치유 과정 전반에 걸쳐 세포의 성장, 분화, 대사 등을 조절하고 창상 주변 환경을 조절한다. 성장인자 중에서도 표피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF)는 창상 치유에 있어 중요한 성장 인자이다.

상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF)는 1953년 미국의 코헨(S. Cohen)에 의해서 처음으로 발견되었다. 사람에게서 유래된 EGF는 53개의 아미노산으로 구성되어 있고 3개의 이황화물(Disulfide) 결합을 가지는 분자량 6,045 달톤(Dalton)의 폴리펩타이드로 포유류의 상피세포와 간엽(Messenchymal) 세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어, 피부 또는 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료제로 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 현재 이 EGF는 상처치료 및 위벽의 손상 시 이를 치료하는 치료제로 쓰이고 있고, 또한 당뇨병 환자에게 발생하기 쉬운 족부 궤양의 치료제로 각광을 받고 있다.

하지만 최근에 EGF를 가장 많이 쓰는 분야는 화장품 분야이다. 나이가 들어감에 따라 피부 등 각 조직에서 EGF를 포함한 성장인자들의 농도는 낮아지며, 세포의 재생 및 분열 기능이 약화되어 주름이 형성되고 탄력이 감소하는 등 노화가 진행된다. 보통 25세를 지난 피부는 성장인자가 감소해 신진대사나 세포의 재생 능력이 점점 늦어지면서 주름이 생겨나게 된다. 건강한 젊은이의 피부 재생 주기는 약 4주간이지만 25세를 지난 피부는 6주로 주기가 늦어져서 피부세포의 재생 능력이 떨어지고 각질층이 두꺼워지면서 피부의 노화 현상이 진행된다. EGF는 상피세포의 성장을 촉진하는 인자로서 세포막에 있는 EGF 수용체를 통하여 신호를 전달함으로써 포유류의 세포, 특히 상피 및 피부세포의 성장 및 분열을 유도하여 상피세포의 성장을 촉진하는 것으로 밝혀져 있다.

따라서 화장품을 이용하여 피부에 EGF를 적용하게 되면 상피세포 및 진피세포의 증식촉진, 진피 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 세포증식 촉진, 피부 손상부위의 혈관 신생촉진 및 기타 재생촉진인자의 분비유도, 피부 조직이 질서 있게 방향을 잡으며, 망을 형성하게 하는 물질인 피브로넥틴(Fibronectin)의 합성촉진, 상처부위 흉터의 최소화 등 피부재생에 핵심적 역할을 하여 연령과 함께 저하하는 피부 본래의 기능을 돕고 피부 세포의 새로운 세포 성장을 촉진할 수 있다. 이로 인해 EGF는 미국 화장품협회(CTFA)의 국제 화장품 원료집(ICID)에 등재되었을 뿐 아니라 식품 의약품 안정청에서도 최근 EGF를 화장품 원료로 승인함으로써 국내외에서 공식적으로 화장품의 원료로서 사용할 수 있게 되었다.

이로 인하여 많은 분야에서 이를 이용하려고 했으나 초기에는 줄기세포의 발생과정에서 유래되는 여러 가지 성장인자들 중 정제를 통하여 EGF를 얻어 순도와 활성이 낮고 저 생산성, 고비용 공정으로 생산되고 있어 높은 가격으로 인해 활용이 제한되어 있었다. 그러나, 최근 유전공학적 기법에 의하여 미생물로부터 인체의 EGF와 동일한 단백질을 생산하게 한 후 단백질 분리정제 기술을 이용하여 EGF만을 순수하게 분리하는 방법으로 저비용으로 대량생산이 가능하게 되었다.

하지만 생산된 EGF는 상대적으로 높은 온도와 수용액 안에 있을 때 민감하여 [0005] 일반 제품 상태나 유통환경에서 활성이 많이 떨어져 화장품 원료로 사용하기 위해서는 이를 안정화시킬 필요성이 제기되어 왔다. 따라서 기존의 EGF을 대신할 EGF 변이체를 만들어 활성은 유지하면서도 뛰어난 안정성을 가진 EGF가 필요한 실정이다. 현재 EGF 변이체에 대한 연구는 안정성보다는 더 높은 활성을 보이는 변이체 개발에 치중되어있다. 안정성을 높인 경우는 불안정한 아스파르트산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 분해 억제를 통한 EGF의 안정도를 증가시킨 방법이 있지만 후속 연구가 진행되지 않았으며(Nascimento, G. C. et al., Biochemistry. 29:9584-9591, 1990), 그 외에는 알부민 융합 상피세포성장인자, PEG-EGF 같은 EGF에 다른 물질을 붙임으로써 안정성을 증가시킨 경우가 있다(Park, J. W. et al., Biochem Biophys Res Commun. 366:769-774, 2008). 하지만 이러한 경우는 전체 단백질의 크기가 커져 피부에 흡수되기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 단백질의 크기 변화 없이 EGF 내에서의 아미노산 변화만으로 안정성을 증가시킨 EGF 변이체의 개발이 중요하다.

한편, 최근에는 천연물을 소재로 한 화장품이 인체안정성, 피부자극완화 등의 이유로 소비자에게 각광을 받고 있으며, 이에 따라 화장품 원료로서 천연물에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있는 실정이다.

KR 10-0110123 B1

본 발명의 목적은 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하여 피부 질환 개선 또는 피부 재생 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 아토피성 피부염, 알레르기,　피부　습진,　여드름, 건선, 가려움증 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 피부 질환의 개선을 위한 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 조성물을 이용하여 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하며, 상기 천연 추출물은 얼레지 추출물, 낭아초 추출물, 산수국 추출물, 개망초 추출물, 불로화 추출물, 돌콩 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물에 관한 것이다.

상기 피부 재생 촉진용 조성물은 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질을 포함하며, 상기 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질 100 중량부에 대하여 천연 추출물 10 내지 30 중량부를 포함할 수 있다.

상기 천연 추출물은 얼레지, 낭아초, 산수국, 개망초, 불로화, 돌콩 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 천연물을 물, 탄소수 1 내지 10의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물은 상기 식물추출물에 대하여 민들레 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 피부 질환은 아토피성 피부염, 알레르기,　피부　습진,　여드름, 건선, 가려움증 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 상기 조성물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 화장료 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다. 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 의미하며, 보다 구체적으로는, 플라스미드 벡터이다.

본 발명에서 "천연 추출물"은 천연물로부터 분리된 활성 성분을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물은 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함한다.

상기 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질은 서열번호 1로 표시되는 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 8번째 아미노산인 류신을 세린으로의 치환, 38번째 아미노산인 아이소류신을 세린 또는 시스테인으로의 치환, 및 46번째 아미노산인 아스파르트산을 시스테인으로의 치환된 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는, 상기 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 서열번호 2는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 8번째 아미노산인 류신을 세린으로 치환하고, 38번째 아미노산인 아이소류신을 시스테인으로 치환하고, 46번째 아미노산인 아스파르트산을 시스테인으로 치환한 아미노산 서열이다.

본 발명의 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질은 상기 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질을 코딩하는 유전자로 포함될 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열인 것을 특징으로 한다. 서열번호 4는 천연형 EGF 유전자의 염기서열을 표시한 서열번호 3에 있어서, 22번째 내지 24번째 염기서열인 CTG(류신의 코돈)를 AGC(세린의 코돈)으로 치환하고, 112번째 내지 114번째 염기서열인 ATC(아이소류신의 코돈)를 TGC(시스테인의 코돈)으로 치환하고, 136번째 내지 138번째 염기서열인 GAC(아스파르트산의 코돈)를 TGC(시스테인의 코돈)으로 치환한 염기서열이다.

본 발명의 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질은 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명은 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질은 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물로 포함될 수 있다.

형질 전환될 수 있는 숙주세포로 사용가능한 미생물은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 대장균(Escherichiacoli), 로도코커스(Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 시폴러버스(Syfolobus), 써모플라즈마(Thermoplasma), 써모프로테우스(Thermoproteus) 등의 다양한 미생물을 포함한다. 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)이지만, 대장균 XL1-blue, 대장균 JM109, 대장균 DH 시리즈, 대장균 TOP10 및 대장균 HB101 등을 예로 들 수 있고, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 돌연변이 EGF 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는데 있어서, 숙주세포의 형질전환에는 핵산을 세포 내로 도입하는 모든 방법이 포함되며, 숙주세포에 따라 적합한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

상기 천연 추출물은 얼레지 추출물, 낭아초 추출물, 산수국 추출물, 개망초 추출물, 불로화 추출물, 돌콩 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 얼레지 추출물, 돌콩 추출물 및 낭아초 추출물의 혼합물이지만, 상기 예시에 국한되지 않는다.

상기 천연 추출물은 얼레지, 낭아초, 산수국, 개망초, 불로화, 돌콩 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 천연물로부터 추출할 수 있다.

얼레지(Dog-tooth Violet, Erythronium japonicum)는 백합과에 속하는 여러해살이풀로, 가재무릇이라고도 한다. 상기 얼레지는 높은 지대의 비옥한 땅에서 주로 자라며, 산골짜기에서 자라는 것도 있고, 한국 및 일본 등지에 분포한다. 상기 얼레지의 잎은 달걀 모양 또는 타원형으로 녹색 바탕에 자주색 무늬가 있고 가장자리가 밋밋하며, 잎몸은 긴 타원형이고, 꽃잎은 바소꼴로, 6개이며 뒤로 말리고 자주색이고, 6개의 수술과 1개의 암술 이 있다. 또한, 상기 얼레지의 열매는 7월 내지 8월에 결실하며 삭과로 넓은 타원형 또는 구형이다. 상기 얼 레지는 야생화이지만, 최근 관상용으로 각광받고 있고, 민간의학에서 위장기능을 향상시키는 작용이 있어 구토 와 설사를 멎게하는 것으로 알려져 있고, 잎은 나물로 식용되어 왔다. 상기 얼레지 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 일 실시예로, 얼레지의 꽃, 잎, 가지, 뿌리, 열매 또는 껍질이나 이의 분쇄물, 바람직하게는 얼레지의 잎에 추출용매를 가함으로써 제조하거나 추출용매로 추출하여 제조한 조추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조된 것일 수 있다.

돌콩 (Glycine soja Siebold & Zucc.)은 콩과 (Zingiberaceae)에 속하는 덩굴성 1년초로 길이는 2m이며 전체에 갈색의 거친 털이 난다. 잎은 호생이고 잎자루는 길며 3출엽이다. 작은잎은 타원상 피침형으로 끝이 둔하고 길 이는 3-8cm이고 가장자리는 밋밋하며, 턱잎은 넓은 피침형이다. 꽃은 7~8월에 홍자색으로 피는데 총상꽃차례[總 狀花序]는 길이 2~5cm이다. 꽃받침은 종형이고 털이 있으며 5개로 갈라진다. 화관은 나비모양이다. 수술은 10개 로서 각각 2개로 갈라진다. 열매는 2~3cm로 털이 많고 콩꼬투리와 비슷하며, 종자는 타원형이거나 신장형 비슷하며 약간 편평하다 (이영노. 원색한국식물도감, (주)교학사, 403p, 1998). 돌콩은 이명으로 갱미두, 녹곽으로 불리며, 생약명으로는 야대두등(野大豆藤), 야료두(野料豆)로 불리운다 (안덕균, 한국본초도감, 교학사, 728p, 2000). 돌콩은 콩(Glycine max)의 기원종으로 여겨지고 있으며, 현재 식용 가능한 것으로 인정되고 있으나 실제 식용으로 이용되는 경우는 거의 없으며, 대부분 자연계에서 자생하고 있고 강한 유전자를 지니고 있어 콩의 유 전적 개량 연구 등을 위해 일부 재배되기도 한다.

낭아초는 낙엽 활엽반관목으로, 가지를 많이 쳐서 옆으로 자라며, 작은 가지에는 복모가 있고 가늘다. 높이는 2m 정도이다. 잎은 작은 잎이 5 내지 11개이고, 타원상 도란형, 타원형 또는 긴 타원형이며, 잎자루는 1 내지 3cm인, 홀수깃꼴겹잎이다. 가장 자리는 밋밋하고 잎끝이 둔하거나 오목하고, 잎밑은 둥글다. 뿌리 부위는 약용으로 쓰인다.

산수국(Hydrangea serrata)은 수국속(Hydrangea) 식물이고, 수국속은, 수국과(Hydrangeaceae)에 속하며, 약 23종의 목본성 관목으로 이루어진다. 서반구와 아시아 동부가 원산지이다. 한국에서 자라는 수국속 식물로는 산수국(H. serrata)과 등수국 등이 있다. 산수국과 등수국은 산이나 들에 자라며, 정원에 심는 종류들 은 수국과 그 품종들이다. 산수국은 한국 곳곳에서 볼 수 있으나 등수국은 울릉도와 제주도에서만 자란다. 이 밖에 나무수국과 미국수국 등을 외국에서 들여와 정원 등에 조경용으로 심고 있다.

산수국(Hydrangea serrata)은, 하이드란제 세라타 포 아큐미나타(S. et z.)윌슨(Hydrangea Serrata for. Acuminate (Siebold ＆ Zucc) Wilson), 하이드란제 세라타 포 부에제리 나카이(Hydrangea serrata for. buergeri Nakai.), 하이드란제 세라타 포 코리아나 티. 리(Hydrangea serrata for. coreana T. Lee) 및 하이드란제 세라타 포 퍼틸리스 나카이(Hydrangea serrata for. fertilis Nakai)를 포함한다.

개망초 (Erigeron annuus (L.) Pers.)는 국화과 개망초속의 두해살이풀로, 북아메리카가 원산이며 전 세계적으 로 분포한다. 북아메리카에만 173종의 개망초속 식물이 자생하고 있어 가장 다양성이 높은 식물속이다. 개망초 는 베타시토스테롤 (-sitosterol), 다이드제인 (daidzein), 아피제닌 (apigenin), 쿼세틴 (quercetin), 프로토 카테츄익산 (protocatechuic acid), 파이로메코닉산 (pyromeconic acid), 브레비스카핀 (breviscapine) 등의 생리활성물질을 함유하고 있어, 민간에서 개망초는 위장염, 소화불량, 전염성 간염, 혈뇨, 학질 및 말라리아 등 에 사용되어 왔다.

불로화(Ageratum houstonianum)는 국화과에 속하는 한해살이풀이다. 열대 아메리카 원산이다. 흔히 학명의 속명인 아게라툼이나 아게라덤이라 부르며, 멕시코엉겅퀴라고도 부른다. 원산지에서는 잡초로 취급되나, 정원에서 심어 기르기도 하며, 한국에서는 경인 지역에서 야생한다. 키는 30~60 센티미터 남짓이며, 줄기 전체에 끈끈한 털이 빽빽하게 난다. 잎은 마주나기도 하고 어긋나기도 하며 잎자루가 길고 심장 또는 달걀 모양이며 길이는 3~5 센티미터, 너비는 2~3 센티미터 정도이다. 잎의 밑 부분이 깊게 파여 있다. 꽃은 7~10월에 피는데 가지 끝　산방꽃차례에 파란색이거나 자주색, 흰색의 두상화로 핀다. 두화는 지름 1 센티미터 정도이며 꽃턱잎 조각은 선 모양 바소꼴인데 털이 많이 난다.

상기 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 침출법 및 환류 추출법 등 당업계의 통상적인 추출 방법일 수 있다. 구체적으로 세척 및 건조로 이물질이 제거된 천연물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 상기 용매들을 순차적으로 시료에 적용하여 추출한 추출물일 수도 있다.

상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72 시간 동안 방치될 수 있으며, 보다 구체적으로 24 내지 48시간 동안 방치될 수 있다.

추출 후, 추출물은 새로운 분획 용매를 순차적으로 적용하여 분획할 수 있다. 분획시 사용하는 분획 용매는 상기 용매는 물, 헥산, 부탄올, 에틸아세트산, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드이다. 추출물 또는 분획물을 얻은 후에는 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.

상기 피부 재생 촉진용 조성물은 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질을 포함하며, 상기 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질 100 중량부에 대하여 천연 추출물 10 내지 40 중량부를 포함하며, 바람직하게는 15 내지 20 중량부이지만, 상기 예시에 국한되지 않는다.

상기 천연 추출물을 상피세포 성장인자 단백질 100 중량부를 기준으로 10 중량부 미만으로 포함할 경우, 피부 질환 개선 효과가 미비한 문제가 있으며, 30 중량부를 초과할 경우, 피부 재생 촉진 효과가 미비한 문제가 있다.

바람직하게는 상기 천연 추출물은 얼레지 추출물, 돌콩 추출물 및 낭아초 추출물을 1:1:1 내지 1:2:1의 중량비율로 혼합된 혼합물이며, 상기 예시에 국한되지 않는다. 돌콩 추출물을 얼레지 추출물 및 낭아초 추출물의 중량 비율에 대하여 1 미만으로 포함할 경우, 피부 질환 개선 효과가 미비한 문제가 있으며, 2를 초과하여 포함할 경우, 화장료 조성물로 이용 시, 돌콩 추출물에 의해 과도한 피부 자극이 발생할 수 있다.

바람직하게 상기 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물은 상기 식물 추출물 100 중량부에 대하여 민들레 추출물 1 내지 50 중량부를 포함하는 것일 수 있다. 더 바람직하게는 상기 식물추출물 100 중량부에 대하여 민들레 추출물 5 내지 20 중량부를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 피부트러블의 진정 효과가 높아지고 피부 재생촉진 및 보습성이 향상될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른, 돌연변이 성장인자 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 조성물은 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

상기 피부 질환은 아토피성 피부염, 알레르기,　피부　습진,　여드름, 건선, 가려움증 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.

상기 화장료 조성물은, 기초화장품, 메이크업 화장품, 바디 화장품, 두발용 화장품, 두피용 화장품 또는 면도용 화장품의 용도로 제공될 수 있다. 상기 기초화장품의 예로는 크림, 화장수, 팩, 마사지 크림, 유액 등이 있으며, 상기 메이크업 화장품으로는 파운데이션, 메이크업 베이스, 립스틱, 아이새도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬 등이 있으며, 바디 화장품으로는, 비누, 액체 세정제, 입욕제, 선스크린 크림, 선 오일 등이 있으며, 두발용 화장품으로는 샴푸, 린스, 헤어 트리트먼트, 헤어 무쓰, 헤어 리퀴드, 포마드, 헤어 칼라제, 헤 어 블릿치제, 칼라 린스가 있으며, 두피용 화장품으로는 헤어 토닉, 스칼프 트리트먼트가 있으며, 면도용 화장 품으로는 애프터셰이브로션, 셰이빙 크림 등이 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물에는 통상 화장료에 배합되는 다른 성분이 더욱 포함될 수 있다. 보다 상세하게, 상기 통상 화장료에 배합되는 다른 성분은 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기안료 및 무기안 료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제 또는 정제수 등일 수 있다.

상기 유지 성분은 구체적으로 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지 또는 식물 유지 등일 수 있다.

상기 에스테르계 유지는 일 예로, 트리-2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리 스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리 놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스 테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이 소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리-2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤 프로판, 테트라-2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미 리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테 아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실,올 레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스 테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디 (카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글 리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소 스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴 리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트 산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산 아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥 실,아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산 콜레스 테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산 피트 스테릴, 올레인산피트스테릴, 1,2-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 1,2-스테알로일히드록시스테아르산 스테아릴 또는 1,2-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등일 수 있다.

상기 탄화 수소계 유지는 일 예로 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스 또는 와셀린 등일 수 있다.

상기 실리콘계 유지는 일 예로 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스 테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유 또는 아미노 변성 실리콘유 등일 수 있다. 상기 불소계 유지는 퍼플루오로폴리에테르 등일 수 있다.

상기 동물 유지 또는 식물 유지는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥 수수유, 유채유, 행인유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지, 마유, 밍크유, 오렌 지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린 또는 경화피마자유 등일 수 있다.

상기 계면활성제는 구체적으로 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 또는 양성 계면활성제일 수 있다.

상기 음이온성 계면 활성제는 일 예로, 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬 나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아 미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술 포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염 또는 퍼플루오로알킬인산에스테르 등일 수 있다. [0058] 상기 양이온성 계면 활성제는 일 예로, 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴 트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모 늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로 필아미드 또는 라놀린 유도체 제4급 암모늄염 등일 수 있다.

상기 양성 계면 활성제는 일 예로, 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형 또는 아미드아민형의 양성계면 활성제 등일 수 있다.

상기 안료는 유기안료, 무기안료 및 이들의 복합 안료 등일 수 있다.

상기 무기안료는 일 예로 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체 등일 수 있다.

상기 유기안료는 일 예로 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수 지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트 오렌지 및 이들의 복합체 등일 수 있다.

상기 유기 분체는 일 실시예로 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼 슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등 의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N- 엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경 화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파- 아미노카프릴산, 알파아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메 타크릴레이트, 폴리스티렌, 사불화에틸렌 등 일 수 있다.

본 발명은 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 조성물로 우수한 피부 질환 개선 또는 피부 재생 촉진에 효과를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 조성물로, 아토피성 피부염, 알레르기,　피부　습진,　여드름, 건선, 가려움증 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 피부 질환의 개선 및 피부 재생 촉진에 우수한 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예 1: 사람 EGF Cdna를 포함하는 pSSB-EGF 플라스미드의 구축]

1. 실험 재료

단백질 발현 벡터인 pET21a와 발현용 E.coli 균주로는 BL21(DE3), Rosetta(DE3)을 노바젠(Novagen)에서 구입하였으며 클로닝(Cloning)용 E.coli 균주는 Top10을 사용하였다. 유전자 재조합 시 사용된 제한효소는 모두 NEB(New England Biolabs)의 제품이며, 리가아제(ligase)는 로체(Roche)사의 T4 DNA ligase이다. PCR시 사용된 Ex taq DNA polymerase는 다카라(Takara)사의 제품이며 점 돌연변이에 사용된 pfuUltra™ HF DNA polymerase는 에질런트(Agilent)사의 제품이다. DNA gel extraction kit, plasmid mini prep kit는 (주)코스모진텍의 제품이다. 또한 프라이머(primer)들은 (주)코스모진텍에서 제작하였으며, DNA sequencing도 (주)코스모진텍에 의뢰하여 수행하였다.

2. 결과

사람 단핵세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 이용하여 하기의 염기서열을 가지는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 EGF를 코딩하는 DNA를 준비하였다. 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.

센스프라이머 5’-GCTGTTCATATGAACAGCGATAGCGAATGC -3’,

안티센스프라이머 3’-TAATAAAAGCTTTTATTAGCGCAGTTCCCACCA-5’.

증폭된 DNA절편 1 μg을 50 μl TE(pH8.0) 용액에 녹인 후 2단위의 Nde Ⅰ(NEB사)과 2단위의 Hind Ⅲ(NEB사)와 섞은 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 5’-말단에 Nde Ⅰ 제한효소 부위와 3’-말단에 Hind Ⅲ 제한효소 부위를 갖도록 하였다. DNA 정제 키트(GeneAll사)를 사용하여 DNA만을 정제한 후, 이 DNA 절편 20ng을 동일한 방법으로 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ 으로 각각 처리하여 준비한 20 ng의 pET21a(+) 플라스미드(노바젠사)와 함께 10 μl의 TE(pH8.0) 용액에 섞은 후, 1단위의 T4 DNA 리가제(NEB사)를 첨가하여 16℃에서 4시간 동안 반응시켜 접합시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pSSB-EGF 이라고 명명하였다.

[제조예 2: 사람 EGF의 대장균 형질 전환체의 제조 및 정제]

발현 플라스미드 pSSB-EGF로 e.coli BL21(DE3)에 heat shock으로 형질전환 시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는, 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB 배지(LB/ampicillin)에 접종하였다. 37 ℃에서 12시간 동안 배양한 후 100 % 글리세롤(glycerol)과 1:1로 섞어 -70 ℃에 스탁을 보관하였다.

상기에서 만든 스탁을 10 ml의 LB 배지(LB/ampicillin)에 접종한 후 12시간 이상 배양하였다. 그 후 500 ml의 LB 배지(LB/ampicillin)에 옮겨 600nm에서 흡광도가 O.D 0.4~0.5일 때 IPTG(isopropyl-1-thio-β-Dgalactopyranoside)를 최종농도가 0.5 mM이 되도록 넣었다. 37 ℃에서 4시간 동안 200 rpm 속도로 진탕 배양한 후 8000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 얻었다. 이 펠렛을 25 ml의 50 mM tris (pH 8.0) 완충액에 현탁 시킨 후 초음파 처리방법으로 세포를 파쇄하였다.

초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4 ℃에서 13000 rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 취해서 3차 증류수로 2회 세척하였다. 여기에 6 M guanidine-HCl, 50 mM tris (pH 8.0)에 1시간 가량 충분히 교반 시켰다. 이후 guanidine-HCl 제거를 위해 50 mM tris (pH 8.0)에서 6시간씩 2번 투석하여 13000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액과 펠렛을 구분하였다. 투석 후에 얻어진 상층액을 이용하여 브래드포드 방법을 이용하여 EGF를 정량하고 β-mercaptoethanol을 EGF 기준 4.5당량 처리하여 16 시간 이상 실온에서 리셔플링을 한다. 반응이 끝나면 0.2 μm 필터를 이용하여 필터링을 하고 여기에 염산을 이용하여 pH 3.0이하로 산성화시켰다. 이 용액을 HPLC(high performance liquid chromatography)와 ODS-AQ pack 칼럼을 이용하여 정제하였다. 이때 정제 조건은 0.1 % trifluoroacetic acid 용액 A와 90 %의 acetonitrile을 포함하는 0.1 % trifluoroacetic acid 용액 B를 0.6 ml/분의 속도로 0 % B에서 100 % B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 6 KDa 크기의 EGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이때 얻은 EGF의 양은 각각 0.3∼0.5 mg이었으며 순도는 98 % 이상이었다.

[제조예 3: pSSB-EGF 변이체 플라스미드의 구축]

천연형의 pSSB-EGF 플라스미드를 주형으로 pfuUltra™ HF DNA 중합효소를 이용하여 각각의 변이체들에 해당하는 두 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 pSSB-EGF 변이체 플라스미드들을 만들었다. 그리고 Dpn Ⅰ을 이용하여 주형이었던 천연형의 pSSB-EGF 플라스미드를 절단한 후 e.coli Top10에 heat shock으로 형질전환시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB배지(LB/ampicillin)에 접종하였다. 37 ℃에서 16시간 동안 배양한 후 DNA prep을 실시하고 얻어진 DNA를 시퀀싱(sequencing)을 통하여 pSSB-EGF 변이체 플라스미드를 확인하였다. 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

(1) 서열번호 1의 38번째 아이소류신의 코돈인 ATC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환

(2) 서열번호 1의 46번째 아스파르트산의 코돈인 GAC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환

[제조예 4: 천연 추출물의 제조]

1. 얼레지 추출물의 제조

건조된 얼레지에 20배 부피비의 4시간 동안 100℃에서 열수 추출하여 추출액을 제조한 뒤 상기 추출액을 여과지로 여과하고 감압하여 건조하여 얼레지 추출물(E1)을 제조하였다.

2. 기타 천연 추출물의 제조

상기 얼레지 추출물과 동일한 방법에 따라 돌콩 추출물(E2) 및 낭아초 추출물(E3)를 제조하였다.

3. 제 2 천연 추출물의 제조

상기 천연 추출물에 혼합사용하기 위하여 상기 얼레지 추출물과 동일한 방법으로 민들레 추출물(M)을 제조하였다.

[제조예 5: 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물의 제조]

하기 표 1에 나타낸 조성을 혼합하여 하기의 S1 내지 S3, T1 내지 T4 및 B1 내지 B5와 같은 피부 질환 개선 및 피부 재생 촉진용 조성물을 제조하였다.

	EGF 단백질	E1	E2	E3	M
S 1	100	5	5	5	-
S 2	100	5	10	5	-
S 3	100	10	20	10	-
T 1	100	5	10	5	0.5
T 2	100	5	10	5	1
T 3	100	5	10	5	4
T 4	100	5	10	5	5
B 1	100	-	-	-	-
B 2	100	5	-	5	-
B 3	100	5	15	5	-
B 4	100	15	15	15	-
B 5	100	3	3	3	-

(단위 중량부)

[실험예 1: 피지분비 억제 평가 실험]

상기 제조된 S 1 내지 3, T 1 내지 T 4, 및 B 1 내지 5의 피지분비 억제 효과를 평가하기 위해 무작위로 40명을 선출하여 피지테이프(sebotape)를 이용한 피지분비 억제 효과를 관찰하였다. 실험방법은 다음과 같다. 먼저 S 1 내지 3, T 1 내지 T 4, 및 B 1 내지 5의 피지분비 억제 효과를 평가하기 전에 실험에 사용될 부위인 이마 부위에서의 정상적인 피지분비 속도를 피지테이프를 이용하여 측정한 후, S 1 내지 2, T 1 내지 T 4, 및 B 1 내지 5를 3주간 바른 후 정상 피지분비 속도를 측정한 동일한 부위에서 피지테이프를 이용하여 피지분비 속도를 측정하였다. 피지테이프를 30분간 붙인 후 떼어내어 피지테이프에 분비된 피지의 양을 영상분석기를 이용하여 측정하였다. 판정은 피지분비 속도를 이용하여 판정하였으며, 피지분비 속도의 단위는 ㎎/㎠/min로 단위시간 및 단위면적당 분비되는 피지의 양을 의미한다. 그 결과는 표 2와 같다.

	S 1	S 2	S 3	T 1	T 2	T 3	T 4	B 1	B 2	B 3	B 4	B 5
피지분비 속도	12.10	11.70	14.20	11.81	10.15	10.24	12.00	18.45	17.66	19.27	19.50	16.10

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, S 1 내지 3은 B 1 내지 5에 비해 피지분비 속도를 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 이는 S 1 내지 3은 피지 분비 억제 효과가 있음을 의미한다고 할 것이다. 또한 T 1 내지 T 4를 참조하는 경우 T 2 및 T 4의 범위에서 상호 작용에 의한 상승효과로서 피지분비 억제 효과가 증가하는 것을 알 수 있다. 다만 T 1 및 T 4의 경우 혼합상승효과가 나타나지 않는다는 것을 알 수 있었다.

[실험예 2: 세포활성 시험]

S 1 내지 3의 세포활성 촉진효과를 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetra-zolium bromide) 시약을 이용하여 세포활성을 측정하였다. 인간유래의 섬유아세포를 배양하여 1Х10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 96웰 평판 배양기에 접종한 후, S 1 내지 3, T 1 내지 T 4 및 B 1 내지 5를 약 24시간 적용한 다음, MTT 시험을 수행하여 세포활성 촉진효과를 확인하였다. 시료를 희석한 vehicle (FBS serum 1% 함유 DMEM)과 비교하여 세포 활성능을 평가하였다. 음성대조군의 배지는 FBS serum 1% 함유 DMEM을 사용하였다. 세포활성의 결과는 하기 수학식 1에 의하여 선출하였으며, 결과를 표 3에 나타내었다.

[수학식 1]

세포활성(%)=(처리군의 반응 흡광도 - 대조군의 반응흡광도/대조군의 반응 흡광도)Х100

	세포활성(%)
S 1	11
S 2	12
S 3	7
T 1	13
T 2	15
T 3	16
T 4	12
B 1	2
B 2	1
B 3	-20
B 4	-10
B 5	-2
음성대조군(무처리)	0

(반복 시험수는 3회)표 3에 나타낸 바와 같이, S 1 내지 3의 경우 섬유 아세포에서 세포활성이 촉진되었는 바, S 1 내지 3은 우수한 세포활성 촉진 효과를 내는 것을 확인하였다.

나아가 T 1 내지 T 4의 결과를 참조하는 경우 T 2 및 T 3에 의하는 경우 세포활성 촉진효과가 향상된다는 사실을 알 수 있다. 반면, T 1 및 T 4에서는 이러한 상승효과가 나타나지 않았다. 따라서 상기 실험 결과를 종합하면 민들레 추출물의 경우 상기 천연추출물 100 중량부에 대하여 5 내지 20 중량부로 혼합사용되는 경우 상호 작용에 의한 상승효과로서 피지 분비를 억제할 뿐만 아니라 섬유 아세포의 세포 활성을 증진시킬 수 있으므로 피부 질환을 개선하고 피부 재생을 촉진시킬 수 있는 화장료 조성물 등으로 그 적용범위를 넓힐 수 있다는 장점을 가진다.

이상에서 본 발명의 바람직한 S에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (5)

1. 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 및 천연 추출물을 포함하는 피지분비 억제 및 세포활성 촉진용 조성물로,
   상기 천연 추출물은 얼레지 추출물, 낭아초 추출물 및 돌콩 추출물이며,
   상기 조성물은 민들레 추출물을 추가로 포함하며,
   상기 얼레지 추출물, 돌콩 추출물 및 낭아초 추출물은 1:1:1 내지 1:2:1의 중량비로 포함하며,
   상기 돌연변이 상피세포 성장인자 단백질은 상기 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질을 코딩하는 유전자로 포함하며,
   상기 EGF 유전자의 염기서열을 표시한 서열번호 3에 있어서,
   22번째 내지 24번째 염기서열인 CTG(류신의 코돈)를 AGC(세린의 코돈)으로 치환하고, 112번째 내지 114번째 염기서열인 ATC(아이소류신의 코돈)를 TGC(시스테인의 코돈)으로 치환하고, 136번째 내지 138번째 염기서열인 GAC(아스파르트산의 코돈)를 TGC(시스테인의 코돈)으로 치환한 것인
   피지분비 억제 및 세포활성 촉진용 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 천연 추출물은 물, 탄소수 1 내지 10의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출되는
   피지분비 억제 및 세포활성 촉진용 조성물.
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