KR20230119344A - 발효균을 이용한 참당귀 추출물 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 참당귀를 에탄올 추출하는 단계; 및 상기 에탄올 추출물에 바실러스 속 균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하고, 상기 바실러스 속 균은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 또는 바실러스 서브틸리스 중에서 선택되는 것인, 데커신 함량이 증가된 참당귀 추출물의 제조방법, 이에 따라 제조된 참당귀 추출물 및 상기 참당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 발효균을 이용한 참당귀 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 참당귀를 에탄올 추출하는 단계; 및 상기 에탄올 추출물에 바실러스 속 균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하고, 상기 바실러스 속 균은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 또는 바실러스 서브틸리스 중에서 선택되는 것인, 데커신 함량이 증가된 참당귀 추출물의 제조방법, 상기 방법에 따라 제조된 참당귀 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
천연물 의약품이란 자연계에서 얻어지는 식물, 동물, 광물 및 미생물과 이들의 대사산물을 일컫는데, 생약(crude drug), 생약제제(herbal medicine) 등을 불린다. 천연물 의약품 연구는 과거부터 꾸준히 진행되어왔으나, 특히 최근 친환경, 자연유래 성분에 대한 선호도가 높아지며 각광받고 있다.
한편, 한방에서 당귀는 산형과(미나리과)에 속하는 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리를 건조한 것으로서 동양에서는 예로부터 보혈제의 대표적인 생약으로 사용하였다. 동의학에 따르면 당귀의 효능을 크게 보혈조경, 활혈지통, 윤장 세 가지로 표현한다. 보혈조경이란 부족한 피를 보충하고 월경 이상을 조절하는 작용이며, 활혈지통이란 피를 활발하게 순환시켜 통증을 멈추게 하는 작용이고, 윤장이란 대장을 윤택하게 하여 부드럽게 하는 작용이다. 당귀는 고혈압, 빈혈, 어혈에 사용하며 그 밖에도 진정제, 진통제, 강장제로 사용된다. 특히 월경 조절이나 임산부의 출산 전후에는 자궁을 튼튼하게 해주는 작용을 하여 부인병에 널리 사용된다.
참당귀는 데커신(decursin), 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate), 노다케닌(nodakenin), 이소임페라토닌(isoimperatonin)을 포함한 여러 종류의 쿠마린(coumarin) 성분과 필수 지방, 폴리아세틸렌(polyacetylene) 등이 포함되어 있다. 이 중 주가 되는 활성 성분은 피라노쿠마린(pyranocoumarin) 계열의 데커신과 데커시놀 안젤레이트로, 다양한 질병의 치료나 예방 목적으로 사용되고 있는 참당귀의 약리효과는 이들 성분과 관련하여 꾸준히 보고되고 있다.
데커신(3-methyl-but-2-enoic acid 2,2-dimethyl-8-oxo-3,4-dihydro-2H,8H-pyrano[3,2-g]chromen-3-yl ester)은 하기와 같은 화학식을 가진다. 데커신은 항종양, 박테리아 억제, 혈액순환 개선, 당뇨 개선, 대사효소 억제, 항염증, 항산화, 조직재생, 인지 개선 증진 효과 등 다양한 생체 효능이 보고되어 왔다. 데커신은 특히 화장품의 유효성분으로 관심을 받고 있는데, 우수한 항산화 효과로 활성산소로부터 피부를 보호하여 피부의 노화, 주름 등을 예방할 수 있으며, 혈액순환을 증진시켜 피부에 영양분을 공급하기 용이하도록 하며, 항염증 및 항균작용, 피부색소형성 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다.
이러한 효능에 따라, 참당귀로부터 데커신 등 유용한 생리 활성 성분의 함량이 높은 추출물 또는 분획물을 제조하기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 예를 들어, 대한민국 등록특허공보 제10-1898387호에는 참당귀를 주정에 가온 추출 후 남은 참당귀 주정추출박을 물 가온 추출하여 건조분말을 얻은 다음, 이를 주정에 교반추출, 여과하여 남은 고형분을 건조하여 참당귀다당추출분말을 얻는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 참당귀다당추출물의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2018-0079967호에는 당귀 분말을 에틸아세테이트에 장시간 환류 후 냉각/여과한 여과물을 에테아세테이트로 세척/농축한 다음 메탄올을 넣고 냉각하여 수산화나트륨과 첨가하고 교반, 메틸렌클로라이드와 물을 넣고 냉각 후 산 처리하여, 메틸렌클로라이드 층을 분리, 메탄올:t-부틸메틸에테르의 부피비 1:2 혼합액에 교반하여 재결정시키는 단계를 포함하는 데커시놀의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1819450호에는 참당귀를 에탄올에 냉침(冷浸) 후 가온 추출하여 분리된 여액에서 침전물을 제거하고 상등액을 분리 농축한 다음, 컬럼 크로마토그래피에 산성화된 에탄올로 상기 참당귀 추출액을 분리해내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출액의 정제방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0059197호에는 참당귀를 산소가 제거된 고온고압에서 물 추출하고 여과하여 남은 고형분을 에탄올 추출, 농축하는 추출방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출 농축물을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0060709호에는 초임계 추출 방법으로 당귀를 추출 후 컬럼크로마토그래피로 데커신을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 데커신의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1056352호에는 당귀의 열수추출물에 고전압 펄스 전기장 가하는 당귀 추출방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0749233호에는 참당귀를 에탄올 및 알칼리화제에 가온하여 추출하는 방법에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출물의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0775741호에는 건조 당귀를 에탄올에 가온 추출하여 얻은 여액을 진공 농축 후 에탄올에 가온 재용해 후 저온 방치하여 탄수화물의 결정을 형성시킨 후 필터로 여과하여 여액을 얻고, 이를 진공농축하는 단계로 구성되는 당귀 추출물의 제조방법이 개시되어 있다.
이렇게 다양한 기존의 참당귀의 데커신 등 함유 추출물 또는 분획물의 제조방법은, 그 공정과 요구되는 설비가 복잡하다는 문제가 있다. 본 발명의 발명자들은 기존에 비해 좀더 간단하면서도 참당귀 추출물의 데커신의 함량을 높일 수 있는 제조방법을 찾고자 하였으며, 참당귀의 에탄올 추출물에 바실러스 속 균, 그 중에서도 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 EMD17 또는 바실러스 서브틸리스 9-3 균주를 접종하여 발효시키면 추출물의 데커신 함량이 증가됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 참당귀 추출물의 유효성분, 특히 데커신의 함량을 증가시킬 수 있는 방법과, 이러한 제조방법으로 제조된 참당귀 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면은 참당귀를 에탄올 추출하는 단계; 및 상기 에탄올 추출물에 바실러스 속 균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하고, 상기 바실러스 속 균은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 또는 바실러스 서브틸리스 중에서 선택되는 것인, 데커신 함량이 증가된 참당귀 추출물의 제조방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 참당귀는 건조된 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 참당귀는 참당귀의 뿌리 부분인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 에탄올은 30 내지 70 부피%의 에탄올인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 추출하는 단계 후에, 상기 에탄올 추출물을 건조 분말화 한 후 상기 바실러스 속 균이 접종되는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 바실러스 속 균은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 EMD17 균주 또는 바실러스 서브틸리스 9-3 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발효는 5일 내지 7일 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발효는 25 내지 35℃에서 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면은 전술한 제조방법으로 제조된 참당귀 추출물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 참당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 참당귀 추출물의 제조방법은 간단한 공정을 통해 데커신 함량이 증가된 참당귀 추출물을 수득할 수 있도록 할 수 있다. 이를 통해, 피부 광노화, 주름, 또는 색소침착의 방지 또는 개선, 항균, 항염증 등의 효과를 기대할 수 있는 참당귀 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 참당귀 에탄올 추출물의 성분을 분석한 결과이다.
도 2는 참당귀 에탄올 추출물에 Bacillus subtilis 9-3 균주를 접종하고 2, 4, 6일 후 얻은 추출물의 성분을 분석한 결과이다.
도 3은 참당귀 에탄올 추출물에 서로 다른 바실러스 속 균주를 접종하고 6일 후 얻은 추출물의 성분을 분석한 결과이다.
도 2는 참당귀 에탄올 추출물에 Bacillus subtilis 9-3 균주를 접종하고 2, 4, 6일 후 얻은 추출물의 성분을 분석한 결과이다.
도 3은 참당귀 에탄올 추출물에 서로 다른 바실러스 속 균주를 접종하고 6일 후 얻은 추출물의 성분을 분석한 결과이다.
본 발명의 일측면에 따른 데커신 함량이 증가된 참당귀 추출물의 제조방법은 참당귀를 에탄올 추출하는 단계; 및 상기 에탄올 추출물에 바실러스 속 균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하고, 상기 바실러스 속 균은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 또는 바실러스 서브틸리스 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 일컫는 '추출물'은 원료로부터 임의의 방법으로 추출된 물질을 의미하며, 이렇게 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한 없이 모두 포함하는 의미로 사용된다.
상기 추출물은 원료 또는 이의 건조물로부터 추출하여 얻을 수 있으며, 상기 추출물의 원료는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 추출물을 원료로부터 추출하여 수득할 때, 추출 방법으로는 용매 추출법, 초음파 추출법, 고압 추출법, 초고압 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 통상적인 추출 방법을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용함으로써 제조할 수 있다. 상기 추출 과정은 수회 반복할 수 있으며, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 단계를 추가적으로 거칠 수 있다. 구체적으로, 수득한 추출물을 감압 농축하여 농축액을 얻고, 상기 농축액을 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 고농도의 추출 분말을 제조할 수 있다. 본 발명의 추출물은 상기 추출물을 추가적으로 분획하여 얻은 분획물이나 상기 추출물에 추가적으로 발효 등의 과정을 거쳐 얻은 발효물도 포함한다.
당귀는 산형과에 속하는 다년생 초본식물로서, 주로 한국, 일본 및 중국 등지에서 약용을 목적으로 재배되고 있다. 당귀는 그 산지에 따라 한국에서 생산되는 참당귀(Angelica gigas Nakai), 일본에서 생산되는 일당귀(Angelica acutiloba Kitagaw), 그리고 중국에서 생산되는 중국당귀(Angelica sinensis Diels)로 구분되나, 그 성분과 약리적 효과는 상이한 것으로 알려져 있다. 이 중 본 발명에서 이용되는 참당귀(Angelica gigas Nakai)는 전술한 바와 같은 다양한 유효성분을 포함하며, 특히 데커신(decursin)과 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 주요 유효성분으로 하는 것으로 알려져 있다.
일 구현예에서, 상기 참당귀는 건조된 것을 특징으로 할 수 있다. 참당귀의 유산균(Lactobacillus) 발효에 대한 연구에서, 건조된 것을 사용하는 경우에만 데커신이 증가되는 것으로 보고된 바 있다(Seo SH.(2016), Enhancement of Indicator Substances and Antioxidant activities of Angelica gigas Nakai by Bioconversion Technology, 석사학위논문, 안동대학교, 안동).
일 구현예에서, 상기 참당귀는 참당귀의 뿌리, 잎 및 줄기 중에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게 뿌리 부분인 것을 특징으로 할 수 있다. 참당귀의 부위별 생리활성 물질에 관한 한 연구에서, 잎, 줄기 및 뿌리에서 데커신 비율이 각각 13.0%, 37.6% 및 47.1%로 나타나, 뿌리에 데커신 함량이 가장 높은 것으로 보고한 바 있다(Heo et al., Journal of Life Science, 2010, 20(5): pp. 750~759).
일 구현예에서, 상기 에탄올은 30 내지 70 부피%의 에탄올, 바람직하게 40 내지 60 부피%의 에탄올인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 추출하는 단계 후에, 상기 에탄올 추출물을 건조 분말화 한 후 상기 바실러스 속 균이 접종되는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 바실러스 속 균은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 EMD17 균주 또는 바실러스 서브틸리스 9-3 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. EMD17 균주는 한국의 전통 발효 식품 청국장으로부터 분리된 균주로, 이재용(2015), Characteristics of antimicrobial substances produced by Bacillus amyloliquefaciens EMD17 (석사학위논문, 경상대학교, 진주)에서 동정된 바 있다. 바실러스 서브틸리스 9-3는 한국미생물보존센터 기탁번호 KCCM 11316의 균주 또는 이로부터 파생된 균주일 수 있다.
본 발명에서 발효는 유기물을 효소활성을 통해 다른 화합물로 전환하는 생물전환(bioconversion)의 의미로 사용되었으며, 전술한 균을 접종하여 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발효는 5일 내지 7일 진행되는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 연구자들은 발효 기간에 따라 상기 추출물이 유효성분 별로 다른 증감양상을 나타낼 수 있으며, 특히 바실러스 속 균, 특히 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 EMD17 균주 또는 바실러스 서브틸리스 9-3를 접종한 경우 6일 후에 데커신의 증가가 크게 나타날 수 있다는 것을 확인하였다. 상기 발효 기간은 7일을 넘지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 발효 기간이 7일 경과 후 이취가 발생할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발효는 25 내지 35℃에서, 바람직하게 27 내지 33℃에서 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면은 전술한 제조방법으로 제조된 참당귀 추출물을 제공한다. 상기 참당귀 추출물은 참당귀의 유효성분 중 데커신 함량이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 참당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
유미애(2011) (당귀 추출물 및 데커신의 피부노화억제효능에 대한 연구(Studies on regulation of skin anti-aging related proteins in Angelica Gigas Nakai extracts and decursin-stimulated human dermal fibroblast), 박사학위논문, 아주대학교, 수원)에 따르면, 참당귀 추출물이 피부노화억제에 중요한 역할을 하는 콜라겐 합성, 항산화 및 세포외기질-섬유아세포 간 상호작용에 관여하는 단백질의 발현을 증가시키며, 이는 추출물 내 데커신 농도에 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 해당 논문에서는 데커신은 자외선A/B 조사에 의한 손상을 억제하고 피부노화를 억제할 수 있으며, 데커신이 함유된 기능성 화장품에 대한 임상평가결과, 피부주름, 색소침착 및 피부톤에 대한 개선 효과를 가지는 것을 확인하였다.
Choi et al.(Biomed Pharmacother, 2022, 147:112651)은 데커신은 PKA/CREB, p38/ERK MAPK, 및 PI3K/Akt/GSK-3β등 다양한 신호전달체계를 조절함으로써 멜라닌 합성의 주요 전사 인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)를 저해하며, ex vivo 3D 인간 피부 모델에서 멜라닌 합성을 저해할 수 있음을 보고하여 데커신이 갖는 피부 미백 효능의 기작을 구체적으로 밝힌 바 있다.
또한 데커신은 강력한 항균 작용을 나타내는 것으로 보고되었으며(Lee et al., Arch Pharm Res, 2003, 26(6): 449-452), 내외부 자극에 의해 유도되어 염증을 일으키는 COX-2(cyclooxygenase-2)를 저해하는 등의 기작을 통해 항염증(anti-inflammatory) 효과를 가지는 것으로 알려져 있다(Shehzad et al., Inflamm Res, 2018, 67(3): 209-218 등).
본 발명의 조성물은 이러한 데커신의 함량이 증가된 참당귀 추출물을 그 유효성분으로 하여, 피부의 노화/광노화, 주름, 또는 색소침착의 방지 또는 개선; 항균; 또는 항염증; 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 참당귀 추출물은 0.01 내지 50 부피%, 바람직하게 0.1 내지 10 부피% 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기 참당귀 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 상기 통상적으로 이용되는 성분들은 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예1. 참당귀 추출물의 제조
참당귀는 경남 산청군 소재 재배농가에서 3년 재배한 후 가을에 수확하여 절단한 건조 참당귀 뿌리 200 g을 분말화하여 50%(v/v) 에탄올 1L에 넣어 추출하였다. 상기 에탄올 추출물을 농축하여 동결건조하여 분말화한 다음, MRS 배지에서 전배양한 균주를 상기 에탄올 추출물 동결건조 분말의 5%(w/w)가 되도록 첨가하여 30℃, 습도 45% 조건에서 고체 배양시켰다.
이 때, 사용된 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EMD17, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HCD2, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 9-3, 바실러스 서브틸리스 #8, 바실러스 서브틸리스 191이었으며, 전배양은 glucose 10%, peptone 5%, KNO3 2%, NH4H2PO4 2%, MgSO4·7H2O 0.5% 및 CaCl2 0.1%를 함유한 배지에서 온도 30℃, 150rpm 조건의 Shaking incubator(JEIOTECH, ISS-4075R, Seoul, KOREA)에서 72시간 이루어졌다.
이 때, 상기 두 균주를 각각 접종하고 7일 후 이취가 심하게 발생하여 이후 발효는 6일 이내로 진행하였다.
실시예2. 참당귀 추출물의 분석
분석기기는 Acquity UPLC (Waters, waters, USA)를 사용하였으며, 컬럼은 Waters Acquity BEH C18 column (2.1×100 mm, 1.7μm), 용매 A는 HPLC용 water(0.1% formic acid), 용매 B acetonitrile을 사용하여 gradient 조건으로 분석하였다. 분석조건은 column oven 온도 25℃, 이동상의 속도 0.4ml/min, DAD 분석파장은 330nm로 용매 gradient 조건으로 분석하였다. 발효물의 분석은 지표물질 중심 정량/정성 분석을 위해 UPLC-QTOF-Mass를 이용하여 분석을 실시하였다. 분석조건은 Waters UPLC-QTOF-Mass를 사용하였으며 ACQUITY BEH C18 chromatography column(2.1 x 100 mm, 1.7um), 칼럼온도는 35℃, mobile phases A와 B는 water (0.1% formic acid), acetonitrile를 사용하였다. 분자량 확인을 위한 질량분석 또한 실시하였다. 이 때, 상기 분석은 참당귀의 지표물질로 알려진 노다케닌(nodakenin), 데커신(decursin), 데커시놀(decursinol), 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 중심으로 진행하였다.
우선, 발효 전 참당귀의 유효성분 함량을 알아보기 위해 참당귀 에탄올 추출물 동결건조 분말에 대해 분석을 진행하였다. 그 결과 RT은 nodakenin 1.143 ppm, decursinol 2.105 ppm, decursin 5.500 ppm, decursinol angelate 5.607 ppm으로 나타났다. 유효 성분의 함량은 decursinol angelate 186.040 ppm 〉 decursin 179.133 ppm 〉 nodakenin 30.550 ppm 〉 decursinol 3.615 ppm으로 decursinol angelate와 decursin이 가장 많이 함유되어 있는 것으로 나타났다(도 1).
다음으로, 참당귀 에탄올 추출물 동결건조 분말에 Bacillus subtilis 9-3 균주를 접종한 다음 2, 4 및 6일 경과 후 수득한 각 참당귀 추출물에 대한 분석을 진행하였다. 그 결과 도 2와 같이 접종 후 2일 후 데커신과 데커시놀 안젤레이트의 함량이 급격하게 감소했다가 4일 후에는 조금 증가하고, 6일 후에는 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 노다케닌과 데커시놀의 경우 접종 4일 후 증가했다 6일 후 다시 감소하는 것으로 나타났다.
다음으로, 참당귀 에탄올 추출물 동결건조 분말에 서로 다른 바실러스 속 균주를 접종하고 6일 경과 후 수득한 각 참당귀 추출물에 대한 분석을 진행하였으며, 그 결과 도 3과 같이 균주 별로 데커신 함량에 큰 차이가 있는 것으로 나타났다. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 EMD17와 바실러스 서브틸리스 9-3 균주를 접종하여 수득한 참당귀 추출물은 각각 높은 데커신 함량을 나타낸 반면, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HCD2, 바실러스 서브틸리스 #8 및 바실러스 서브틸리스 191을 접종한 경우는 데커신이 미량 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 노다케닌과 데커시놀의 경우 모든 균주에서 유사한 결과를 얻었다.
종합해보면, 참당귀 에탄올 추출물 내의 유효성분의 함량은 바실러스 속 균주를 접종하여 발효시키는 과정을 통해 변화시킬 수 있으며, 특정 유효성분의 함량은 균주 및 발효 기간에 따라 달라질 수 있음을 알 수 있다. 본 발명의 발명자들은 바실러스 속 균주, 특히 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 EMD17 또는 바실러스 서브틸리스 9-3 균주를 접종하여 6일 발효시키는 경우 데커신의 함량을 높일 수 있음을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (10)
- 참당귀를 에탄올 추출하는 단계; 및
상기 에탄올 추출물에 바실러스 속 균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하고,
상기 바실러스 속 균은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 또는 바실러스 서브틸리스 중에서 선택되는 것인, 데커신 함량이 증가된 참당귀 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 참당귀는 건조된 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 참당귀는 참당귀의 뿌리 부분인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 에탄올은 30 내지 70 부피%의 에탄올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 추출하는 단계 후에,
상기 에탄올 추출물을 건조 분말화 한 후 상기 바실러스 속 균이 접종되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 바실러스 속 균은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 EMD17 균주 또는 바실러스 서브틸리스 9-3 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 발효는 5일 내지 7일 진행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 발효는 25 내지 35℃에서 진행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항의 제조방법으로 제조된 참당귀 추출물.
- 제9항의 참당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
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