KR101796955B1

KR101796955B1 - 유산균을 이용한 지유 및 필발 복합발효추출물을 함유하는 피부 미백 효과를 갖는 화장료 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101796955B1
Application number: KR1020160091829A
Authority: KR
Inventors: 신동주; 남상인; 강은수; 김용선; 유진희; 최수정
Original assignee: 인코스(주)
Priority date: 2016-07-20
Filing date: 2016-07-20
Publication date: 2017-11-13

Abstract

본 발명은 미백 효과를 지닌 천연식물의 복합 발효추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 유산균을 이용한 지유 및 필발 복합 발효추출물을 함유하는 미백화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 복합 발효 추출물은 피부미백과 관련된 타이로시나제 활성저해효과, DOPA 산화활성저해효과 및 B16F1 멜라노싸이트를 이용한 타이로시나제 활성저해효과와 멜라닌 생성 저해 효과 평가에서 우수한 미백 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 복합 발효추출물은 미백용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

유산균을 이용한 지유 및 필발 복합발효추출물을 함유하는 피부 미백 효과를 갖는 화장료 조성물 및 이의 제조방법{Cosmetic Composition Comprising the Extract of Mixed Fermentation with Sanguisorba Officinalis and Piper Longum Linn. showing Skin Anti-Aging and Whitening Effect, a preparation method thereof}

본 발명은 유산균을 이용한 지유 및 필발 복합발효추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 지유 및 필발의 발효추출물을 제조하여 피부 미백 효과를 가지는 미백 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

발효(fermentation)란 미생물이 분비하는 효소에 의해 유기물을 분해하는 과정을 말한다. 또한 미생물이 에너지를 얻는 과정에서 유용한 물질을 내는 것도 발효이다.

한국인은 이러한 발효와 친숙한데 예로부터 김치를 비롯하여 된장, 청국장 등의 전통 발효식품이 대표적이다. 이러한 발효과정은 무산소호흡을 하는 미생물들로 유기물을 완전히 분해시키고 다른 종류의 유기물을 만들어 내기도 하여 적은 양의 에너지를 생성시킨다. 이러한 발효의 종류는 미생물에 따라 젖산발효, 알콜 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이 있다.

이러한 발효에 관계되는 미생물의 대표적인 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 당을 분해하여 젖산이나 초산과 같은 유기산을 생성하며 부산물로 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제, 프로테아제와 같은 효소를 생성하여 천연물 내의 거대분자의 저분자화를 통하여 피부침투를 용이하게 해준다.

지유(地楡,Sanguisorba officinalis)는 중국, 일본 및 우리나라 전 지역에 널리 분포하고 있으며, 장미과 (Rosacease)에 속한 오이풀 또는 기타 동속 근연식물의 뿌리이다. 한방에서는 주로 양혈지혈 (??血止血)및 해독렴창 (解毒斂瘡)의 효과가 있어 지혈과 상처부위의 치료에 사용되어 왔으며, 특히 피부염 (皮膚炎), 점막염 (??膜炎), 습진 (濕疹), 화상 (火傷)에 외용하는 것으로 알려져 있다. 또한 지유의 잎과 뿌리를 오래 달여서 만든 약은 여러 종류의 염증과 피부병, 화상 치료에 효력이 뛰어나며, 그 중에서도 화상으로 인한 화독을 없애고 감염을 막는데 최상의 약초로 2차적인 조직 괴사와 삼출액이 빨리 줄어들고 화상부위가 깨끗하게 되면서 새살이 돋아 나오게 한다.

필발(Piper longum Linn.)은 후추나무과(Pieperaceae) Piper 종에 속하고, 열대 및 아열대에 걸쳐 약 700종 이상이 존재하며 상업적, 경제적 및 의학적으로 가치가 있는 식물 중 하나이다. 또한 경제적으로도 세계 향료시장에서 후추생산에 중요한 위치를 차지하며, 몇몇 종들은 지역적으로 원예용 관엽식물로 재배되고 있다.

멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 색소로 이 멜라닌의 양과 분포에 의해 피부색이 결정된다. 멜라닌을 만드는 세포는 피부 표피 밑에 멜라닌 형성 세포(Melanocyte)라고 불리는 세포에서 만들어져서 피부의 신진대사로 각질 표면으로 이동하여 떨어져 나간다. 피부색에 관계없이 멜라닌 형성 세포의 수는 거의 동일하다. 단지 멜라닌이 생성되는 양과 종류, 분포가 다르기 때문에 피부색이 차이가 나는 것이다.

미백 작용을 더욱 자세히 설명하면 다음과 같다. 멜라닌은 피부 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트라는 세포에서 티로신(Tyrosine)이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성되며, 표피를 구성하고 있는 각질세포로 전이된다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(Tyrosinase), 티로시나제 관련 프로테인1(Tyrosinase-Related protein 1) 및 도파크롬 토토머라제(dopachrome tautomerase)가 있다. 티로시나제 외의 이 두 효소는 주목을 끌고 있으나 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나제이다. 멜라닌의 생합성 첫 단계는 티로시나제에 의하여 유발된다. 티로시나제에 의해 티로신이 도파(Dopa)로 되고, 이 도파(Dopa)를 도파퀴논(Dopa-quinone)으로 만든다.

이 두 반응의 다음단계 과정들은 비효소적인 반응에 의해서도 가능한 것으로 알려져 있으며 티로시나제 단독으로도 멜라닌 생성이 가능하다고 알려져 있다.

최근에는 피부 세포내의 신호 전달물질의 발현에 따른 멜라닌 형성과정에 대한 새로운 이론이 제시되고 있다. 피부가 자외선에 노출되면 염증을 유발시키는 인터루킨-알파(Interlukin-a)가 상피(Epidermis)내에 있는 케라티노사이트(Keratinocyte)로부터 발현되고, 이 인터루킨-알파가 케라티노사이트 엔도셀린(Endothelin)발현을 촉진 시킨다. 이러한 일련의 과정이 멜라노사이트의 형성을 증가시키고 멜라노사이트를 활성화시킨다. 이렇게 형성된 멜라노사이트내 멜라노좀에서 티로신이 티로시나제에 의해 멜라닌이 형성된다.

이미 아스코르빈산(특개평 4-9320), 하이드로퀴논(특개평 6-192062), 코직산(특개평 56-7710), 알부틴(특개평 4-9315) 및 일부의 화합물들이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료의 원료로 이용되고 있으나, 처방계 중에서의 안정성이 떨어져 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체레벨과 유사한 멜라노마 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다.

또한 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코직산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질이다.

소량 함유한 화장료를 실온에서 수주일동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다. 식물성 천연물들은 안전성이 뛰어날 뿐만 아니라 여러 가지 유익한 성분들을 가지고 있어 미백 물질의 좋은 검색대상이 되고 있다.

오래전부터 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과 기능을 지닌 기존원료가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 한방제로 사용되고 있는 생약, 야채, 과일, 꽃 등의 안전성이 뛰어난 식물추출물로부터 비정상적인 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 여러 가지 효과를 가진 추출물을 찾고자 하는 노력이 있어 왔다.

본 발명자들은 피부 미백 및 개선에 효능이 있는 물질을 찾고자 자연의 여러 가지 천연물질들 중에서 피부 미백에 유효한 물질을 스크리닝한 지유 및 필발을 유산균으로 발효한 복합 발효추출물이 매우 우수한 피부 미백 효능을 나타냄을 발견하였고 이에 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 유산균을 이용한 지유 및 필발 복합 발효추출물을 혼합하여 피부 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 피부 미백과 관련된 타이로시나제 활성저해효과, DOPA 산화활성저해효과 및 B16F1 멜라노싸이트를 이용한 타이로시나제 활성저해효과와 멜라닌 생성 억제함으로서 우수한 피부 미백효과를 작고, 안전성에 문제가 없는 식물성 천연 복합 발효추출물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 이러한 효능을 갖는 복합발효추출물을 기존 제형에 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은

지유 및 필발 복합발효추출물을 함유하는 피부 미백 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

유산균을 MRS 고체 배지에서 25℃ 내지 50℃ 온도에서 22 내지 26시간 동안 활성화시키는 유산균 활성화 단계;

상기 유산균 활성화 단계가 종료된 후 한 콜로니를 따서 멸균된 MRS 액체 배지에 접종한 후 25℃ 내지 50℃ 온도의 배양기에서 22 내지 26시간 동안 진탕 배양시켜 종균으로 발효시키는 발효단계;

상기 발효단계가 종료된 후 지유 및 필발 복합추출물이 1 내지 90 중량%가 함유된 액체 배지에 미리 배양 된 종균을 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml 농도가 되도록 첨가한 후 25 내지 50℃의 온도범위에서 18 내지 120시간 배양하여 발효시켜 발효물을 제조하는 발효물 제조단계;

상기 발효물 제조단계가 종료된 후 발효를 90 내지 110℃의 온도범위에 30 내지 50분 동안 열을 가하여 종균의 기능을 상실시키는 종균기능 상실단계; 및

상기 종균기능 상실단계가 종료된 후 발효물을 원심분리기로 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 채취하는 것을 포함하는 지유 및 필발 복합발효추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 지유 및 필발 복합 발효추출물은 미백과 관련된 타이로시나제 활성 저해효과, DOPA 산화 활성 저해 효과 및 B16F1 멜라로싸이트를 이용한 타이로시나제 활성저해효과와 멜라닌 생성 저해 효과에서 우수한 활성을 나타내어 뛰어난 미백효과를 가지며, 이러한 지유 및 필발의 복합 발효추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물은 피부에 안전할 뿐만 아니라 피부를 맑고 밝게 하는 피부의 미백효과를 가진다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 지유 및 필발 복합발효추출물을 함유하는 피부 미백 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

다른 관점에서, 본 발명은 유산균을 MRS 고체 배지에서 25℃ 내지 50℃ 온도에서 22 내지 26시간 동안 활성화시키는 유산균 활성화 단계; 상기 유산균 활성화 단계가 종료된 후 한 콜로니를 따서 멸균된 MRS 액체 배지에 접종한 후 25℃ 내지 50℃ 온도의 배양기에서 22 내지 26시간 동안 진탕 배양시켜 종균으로 발효시키는 발효단계; 상기 발효단계가 종료된 후 지유 및 필발 복합추출물이 1 내지 90 중량%가 함유된 액체 배지에 미리 배양 된 종균을 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml 농도가 되도록 첨가한 후 25 내지 50℃의 온도범위에서 18 내지 120시간 배양하여 발효시켜 발효물을 제조하는 발효물 제조단계; 상기 발효물 제조단계가 종료된 후 발효를 90 내지 110℃의 온도범위에 30 내지 50분 동안 열을 가하여 종균의 기능을 상실시키는 종균기능 상실단계; 및 상기 종균기능 상실단계가 종료된 후 발효물을 원심분리기로 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 채취하는 것을 포함하는 지유 및 필발 복합발효추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 미백 효과를 갖는 지유 및 필발 복합추출물을 발효한 복합발효추출물을 포함하는 것이라면 어떠한 것을 사용하여도 무방하다.

여기서, 상기 복합발효추출물은 피부 미백효과를 갖는 것으로서, 지유 및 필발 복합추출물을 유산균으로 발효시켜 얻어진 것이라면 특별히 한정되지 않는다.

상가 화장료 조성물에 포함되는 지유 및 필발 복합발효추출물의 사용량은 사용자의 선택에 따라 변경 가능하지만, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50%(w/w)로 함유되는 것을 추천한다.

이때, 복합발효추출물, 특정적으로 지유 및 필발 복합발효추출물을 수득하기 위해 상기 지유 및 필발을 유산균으로 발효시키는 방법은 당업계의 통상적인 방법이라면 특별히 한정되지 않지만, 추천하기로는 유산균을 MRS 고체 배지에서 25℃ 내지 50℃ 온도에서 22 내지 26시간 동안 활성화시키는 유산균 활성화 단계; 상기 유산균 활성화 단계가 종료된 후 한 콜로니를 따서 멸균된 MRS 액체 배지에 접종한 후 25℃ 내지 50℃ 온도의 배양기에서 22 내지 26시간 동안 진탕 배양시켜 종균으로 발효시키는 발효단계; 상기 발효단계가 종료된 후 지유 및 필발 복합추출물이 1 내지 90 중량%가 함유된 액체 배지에 미리 배양 된 종균을 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml 농도가 되도록 첨가한 후 25 내지 50℃의 온도범위에서 18 내지 120시간 배양하여 발효시켜 발효물을 제조하는 발효물 제조단계; 상기 발효물 제조단계가 종료된 후 발효를 90 내지 110℃의 온도범위에 30 내지 50분 동안 열을 가하여 종균의 기능을 상실시키는 종균기능 상실단계; 및 상기 종균기능 상실단계가 종료된 후 발효물을 원심분리기로 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 채취하는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 지유 및 필발을 발효시키기 위한 유산균은 당업계의 통상적인 유산균이라면 어떠한 것을 사용하여도 무방하지만, 추천하기로는 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 비피더스(Lactobacillus bifidus), 락토바실러스 애시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 콘프세스(Lactobacillus confuses), 락토바실러스 퍼멘튬(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 류코노스토크 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스토크 메세테로이더스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스토크 에스피(Leuconostoc sp), 페디오코커스 에시디락시티(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 판토사세우스(Pediococcus pentosaseus)로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 것을 포함하는 것이 좋다.

한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 로션, 밀크로션, 영양로션, 영양크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 바디로션 및 바디클렌저 제형 중 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 포함한다.

이때, 상기 화장료 조성물은 피부 미백 효과를 제공할 수 있다.

특정적으로, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혼합물을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~40%(w/w)로 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-α토코페롤, d-α토코페롤, d-δ토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-α토코페롤, 니코틴산dl-α토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

다른 특정 양태로서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 고분자 펩티드를 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~40%(w/w)로 더 포함할 수 있다.

상기 고분자 펩티로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

상기 스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

<비교예1> 지유 및 필발 복합 추출물의 제조

환류냉각관을 부착시킨 둥근 플라스크에 지유 및 필발을 1:1의 중량비로 혼합한 혼합물 100g의 시료에 증류수 1L를 넣고 80℃의 수욕조 상에서 3시간씩, 3회 반복 추출하여 얻은 추출물을 여과지로 여과하여 추출물을 제조하고, 하기 실시예의 시료로 사용하였다.

<실시예1> 지유 및 필발 복합 발효 추출물의 제조

락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)균을 MRS 고체 배지에서 25℃ 내지 50℃ 온도에서 24시간 활성화시킨 후, 한 콜로니를 따서 멸균된 MRS 액체 배지에 접종한 후 25℃ 내지 50℃ 온도의 배양기에서 24시간 진탕 배양시켜 종균으로 사용하였다.

지유 및 필발 복합 추출물이 1 내지 90 중량%가 함유된 액체 배지에 미리 배양 된 Lactobacillus paracasei 균을 10⁷~10⁸CFU/ml농도가 되도록 첨가한 후 25~50℃ 에서 18~120시간 배양하여 발효시켜 발효물을 제조하였다.

발효를 종료하기 위해 약 100℃에서 약 40분간 열을 가하여 균의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 하기 실시예에 사용하였다.

<실험예1> DOPA 산화 활성 저해 실험으로 미백 효과 측정

멜라닌 합성과정의 속도결정단계를 촉매 하는 타이로시나제의 DOPA 산화반응에 대한 활성 저해율을 측정하여 미백효과를 판단하였다.

DOPA 산화반응에 대한 활성저해효과 측정은 다음과 같이 수행하였다. 추출물 시료를 시험에 적당한 농도범위로 0.1M 인산염완충액(pH 7.0)에 희석한 것을 시료액으로 하였다. 시험관에 0.1M 인산염완충액(pH 7.0) 40uL와 시료액 10uL, 그리고 머시룸타이로시나제(2000units/mL) 10uL를 순서대로 넣고 약 37℃에서 약 3분 동안 반응시켰다. 이 용액에 1mM DOPA 100uL를 넣은 다음, 약 37℃에서 약 1분 동안 반응시켰다. 실험 종료 후 Microplate reader (BioTek, USA)를 이용하여 475㎚에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 1을 통해 DOPA 산화활성 저해율(%)을 산출하였다.

상기 DOPA 산화활성저해시험을 위한 대조군은 추출물 시료 대신 0.1M 인산염완충액(pH 7.0)을 양성 대조군(positive control)으로 0.1 mg/ml의 아스코르브산(ascorbic acid) 넣어 같은 방법으로 측정하였다.

측정 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 유산균 발효를 통해 얻어낸 지유 및 필발 발효추출물이 발효 전인 지유 및 필발 추출물에 비해 DOPA 산화활성 저해율이 훨씬 높게 나타났다.

[수학식 1]

DOPA 산화활성 저해율 (%)= 100-((b-b')/(a-a') x 100)

a : 공시료액의 반응 후의 흡광도

b : 시료액의 반응 후의 흡광도

a', b' : 타이로시나제, DOPA 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

농도(%)	DOPA 산화활성 저해율(%)
농도(%)	Ascorbic Acid (100 ug/ml)	비교예1	실시예1
100	64.7	64.7	97.7
10		50.7	91.7
1		23.6	71.8

<실험예2> B16-F1 멜라노마 세포를 이용한 세포 독성 측정

본 발명의 지유 및 필발 추출물과 지유 및 필발 발효추출물을 시료로 사용하여 B16-F1 멜라노마 세포(CRL-6323, ATCC)의 세포 생존율을 MTT 실험을 수행하여 측정하였다.

먼저, B16-F1 멜라노마 세포를 10 % FBS(Fetal bovine serum, Gibco)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modifiedeagle's medium, Gibco)을 함유한 6 well plate에 1x10⁵cells/well로 세포를 분주하고, 하루 동안 5 % CO2, 37 ℃로 배양하였다. 이후, 10 % FBS가 함유된 새로운 DMEM 배지로 교체한 후, 상기 비교예1 및 실시예1 시료물질을 농도별로 처리하여 3 일 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 배지를 제거하고 0.25mg/ml의 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 용액 2ml을 처리하여 37℃에서 약 4시간 반응시켰다. 반응 완료 후, MTT 용액을 제거한 세포에 DMSO(dimethylsulfoxide) 2ml을 첨가하여 MTT 포르마잔(formazan)을 용해시키고, 570nm에서 흡광도를 측하고, 하기 수학식 2에 따라 계산하여 실험군들의 세포 생존율을 측정하였다. 실험군의 대조군으로는 지유 및 필발 추출물과 지유 및 필발 발효추출물을 첨가하지 않은 반응액을 사용하였다. 측정 결과는 표 2에 나타내었다.

측정 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 비교예1은 0.2% 농도에서 세포 독성이 나타나며, 실시예1은 5% 농도에서 세포생존율이 87%이상인 것을 확인할 수 있다. 비교예1의 지유 및 필발 추출물이 발효 후 세포 독성이 줄어드는 것을 확인 할 수 있으며, 실시예1의 지유 및 필발 발효추출물이 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있다.

[수학식2]

세포 생존율(%) = 시료 첨가군의 흡광도/ 대조군의 흡광도 X 100

농도(%)	세포생존율(%)
농도(%)	비교예1	실시예1
0.008	95.1	100.4
0.04	90.7	100.4
0.2	60.3	98.4
1	46.0	91.3
5	-	87.7

<실험예 3> B16F1 멜라노마 세포를 이용한 세포 내의 멜라닌 생성 저해 효과

본 발명자들은 본 발명의 화장료 조성물의 피부 미백 효능을 확인하기 위하여 B16F1 멜라노마 세포에서의 멜라닌 생성 저해율을 측정하여 미백효과를 판단하였다.

B16F1 멜라노마 세포를 6 well plate에 1 x 10⁵cells/well의 밀도로 분주시키고 37℃, 5% 농도의 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 상기 비교예1 및 실시예1 시료물질을 농도별로 배지에 희석하여 교체한 후, 최종 0.2 μM α-MSH(melanocyte stimulating hormone, Sigma)이 되도록 첨가 하여 72시간 동안 더 배양하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않고 α-MSH만 첨가한 것으로 하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, 10% DMSO가 함유된 1N NaOH를 첨가한 후 50℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 용해시켰다. 이 액을 microplate reader (BioTek, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 총 단백질로 보정하였다. 측정값은 하기 수학식 3에 의해 멜라닌 생성율로 하기 표 3에 나타내었다. 이때 시료를 처리하지 않고 α-MSH만 첨가한 세포 배양액의 흡광도를 대조군 100%로 하였으며, 실험은 각각 3회씩 수행하여 나타내었다.

[수학식3]

멜라닌 생성율(%) = 대조군의 반응흡광도-추출물의 세포배양액반응흡광도/대조군의 반응 흡광도 X 100

측정 결과, 상기 표 3에 나타낸 것과 같이 실시예1의 지유 및 필발 발효추출물이 비교예1의 지유 및 필발 추출물에 비해 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내었다

농도(%)	멜라닌 생성율 (%)
농도(%)	a-MSH (20 nM)	Arbutin (0.05%)	비교예1	실시예1
0.008	503	198	622	261
0.04	503	198	332	168

<실험예 4> B16F1 멜라노마 세포를 이용한 세포내 tyrosinase activity assay

본 발명자들은 본 발명의 화장료 조성물의 피부 미백 효능을 확인하기 위하여 B16F1 멜라노마 세포에서의 tyrosinase activity를 측정하여 미백효과를 판단하였다.

세포내 tyrosinase activity 측정법은 Pawelk과 Pomerantz 방법을 사용하였다. 6 well plate에 5x10⁵cells/well로 세포를 분주하고 하루 동안 배양한 후 시료를 처리하였다. 24시간 후, 세포를 수집하여 용해시킨 후 0.2% L-DOPA가 첨가된 0.1M sodium phosphate buffer(pH 6.8)를 넣고 37℃에서 2시간 동안배양하고 490 nm에서 흡광도를 측정하였다

조성물들의 티로시나아제 활성 억제 효과를 조사하기 위해, 티로시나아제의 기질인 0.1M 인산 나트륨 완충용액(pH 6.8)에 용해된 10mM L-DOPA(L-dihydroxyphenylalanine,in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 6.8) 0.4 mL에 실시예1에서 제조한 조성물들의 추출액 0.2mL를 첨가하여 상온에서 잘 혼합하였다. 상기 혼합액에 티로시나아제(Tyrosinase, 100 unit/mL) 0.4mL를 넣고 25℃에서, 15분간 반응시켰다. 그 후 냉동 조건에서 반응을 정지시킨 후 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 하기 수학식 4에 의해 티로시나아제 저해효과율로 하기 표4에 나타내었다. 대조군으로 추출물 대신 증류수를 사용하였으며 실험은 각각 3회 수행하여 나타내었다.

측정 결과, 표4에서 나타난 것과 같이 실시예1의 지유 및 필발 발효추출물이 비교예1의 지유 및 필발 추출물에 비해 우수한 티로시나아제 저해 효과를 나타내었다

[수학식4]

티로시나아제 활성 저해율(%) = 1-(추출물의 흡광도/대조군의 흡광도)ㅧ 100

농도(ppm)	티로시나아제 활성 저해율 (%)
농도(ppm)	Control	Arbutin (0.1%)	비교예1	실시예1
5	100	50.6	80.7	38.4
1	100	50.6	91.5	46.7

<실시예2> 유연화장수(스킨로션)

하기의 표 5과 같이 상기 지유 및 필발 발효추출물을 함유하는 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량%
지유 및 필발 발효추출물 (실시예1)	10
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트80	0.4
에탄올	10
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

<실시예3> 밀크로션(유액)

하기의 표 6과 같이 상기 지유 및 필발 발효추출물을 함유하는 밀크로션을 수상과 유상은 각각 75℃에 가열 후 5분간 유화시켜 냉각 탈포하여 제조하였다.

원료명	중량%
지유 및 필발 발효추출물 (실시예1)	10
스쿠알란	5.0
밀납	4.0
폴리솔베이트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

<실시예4> 영양크림

하기의 표 7과 같이 상기 지유 및 필발 발효추출물을 함유하는 영양크림은 수상과 유상은 각각 75℃에 가열 후 5분간 유화시켜 냉각 탈포하여 제조하였다.

원료명	중량%
지유 및 필발 발효추출물 (실시예1)	10
밀납	10.0
폴리솔베이트60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

<제형예1 및 비교제형예1>

본 발명의 지유 및 필발 발효추출물을 함유하는 제형예 1 및 비교제형예1을 하기 표8에 기재된 배합성분으로 제조하여 임상실험의 시료로 사용하였다. 비교제형예1은 지유 및 필발 발효추출물 대신 물을 더 추가하여 첨가하였다.

구분	중량%
원료명	제형예1	비교제형예1
실시예1	5.0	-
시토 스테롤	1.7	1.7
폴리글리세릴 2-올레이트	1.5	1.5
세테아레스	1.2	1.2
콜레스테롤	1.5	1.5
디세틸포스페이트	0.4	0.4
글리세린	5.0	5.0
선플라워오일	10.0	10.0
카르복시비닐폴리머	0.2	0.2
잔탄검	0.3	0.3
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	To 100	To 100

<임상실험예 1> 지유 및 필발 발효추출물의 미백 육안평가

피부 미백에 대한 지유 및 필발 발효추출물의 영향을 알아보기 위해, 건강한 피부를 가진 19 ~22세 여성을 대상으로 인공색소 침착을 유도한 뒤, 이중맹검법과 무작위화된 인체시험방법을 적용하여 6주간 상기 제형예1 및 비교제형예1의 시험제형을 사용하게 한 후, 지유 및 필발 발효추출물의 피부 미백 효과를 평가하였다.

제형 사용 전과 사용 1주, 2주, 4주, 6주 후 시점에서 피부 미백 효과를 평가하였다. 평가 기준은 1 ~ 7점 척도를 사용하여 2명의 관찰자가 평가하였다. 표 9은 관찰자 1에 의한 육안 평가 결과이고, 표 10은 관찰자 2에 의한 육안 평가 결과이다. 시험군과 대조군을 시점 별로 반복 평가하였고 시험 결과를 반복측정 분산분석법을 적용하여 군간, 시점별 차이를 검정하였다(p<0.05).

<평가기준>

0:색소 침착 1:없거나 가벼운 색소 침착

2:가벼운 색소 침착 3:가볍거나 보통의 색소 침착

4:보통의 색소 침착 5:보통이거나 심한 색소 침착

6:심한 색소 침착 7:매우 심한 색소 침착

	주	N	평가값	S.E.Mean	S.D
대조군	0주	15	6.48	0.1466	0.7247
	1주	15	6.14	0.1860	0.8454
	2주	15	5.38	0.1567	0.8141
	4주	15	4.90	0.1473	0.8474
	6주	15	4.63	0.1663	0.8246
	시험군	0주	15	6.45	0.1707	0.7027
		1주	15	6.08	0.1602	0.7639
		2주	15	5.28	0.1738	0.7278
		4주	15	4.89	0.1579	0.7366
		6주	15	4.11	0.1569	0.8647

	주	N	평가값	S.E.Mean	S.D
대조군	0주	15	6.43	0.1544	0.6413
	1주	15	6.27	0.1602	0.6352
	2주	15	5.53	0.1535	0.6465
	4주	15	5.01	0.1722	0.6678
	6주	15	4.52	0.1472	0.6657
	시험군	0주	15	6.34	0.1270	0.6233
		1주	15	6.19	0.1384	0.6198
		2주	15	5.51	0.1642	0.6392
		4주	15	5.23	0.1368	0.6466
		6주	15	4.32	0.1888	0.6250

그 결과, 상기 표 9 및 10에 나타나는 바와 같이 본 발명의 지유 및 필발 발효추출물이 첨가된 제형을 사용한 경우가 사용하지 않은 대조군에 비해 유의한 개선 효과를 보였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모두 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모두 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

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락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)균을 MRS 고체 배지에서 25℃ 내지 50℃ 온도에서 24시간 동안 활성화시키는 유산균 활성화 단계;
상기 유산균 활성화 단계가 종료된 후 한 콜로니를 따서 멸균된 MRS 액체 배지에 접종한 후 25℃ 내지 50℃ 온도의 배양기에서 24시간 동안 진탕 배양시켜 종균으로 발효시키는 발효단계;
상기 발효단계가 종료된 후 지유 및 필발 복합추출물이 1 내지 90 중량%가 함유된 액체 배지에 미리 배양 된 종균을 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml 농도가 되도록 첨가한 후 25 내지 50℃의 온도범위에서 18 내지 120시간 배양하여 발효시켜 발효물을 제조하는 발효물 제조단계;
상기 발효물 제조단계가 종료된 후 발효를 100℃의 온도범위에 40분 동안 열을 가하여 종균의 기능을 상실시키는 종균기능 상실단계; 및
상기 종균기능 상실단계가 종료된 후 발효물을 원심분리기로 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 채취하는 것을 포함하는 지유 및 필발 복합발효추출물의 제조방법.