KR101995557B1 - 수련 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 구현예는 수련(Nmphaea tetragona)의 꽃, 잎 및 뿌리 추출물을 포함하는 추출 조성물을 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)로 발효시킨 수련 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 이를 통해, 본 발명은 항산화, 피부 주름 방지, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 우수하며, 세포독성이 없고, 인체에 무해하며, 피부자극이 적은 화장료 조성물 및 생산성과 경제성이 우수한 상기 화장료 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.

Description

수련 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법{COSMETIC COMPOSITION INCLUDING FERMENTED WATER LILY EXTRACT AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 수련 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부 미백과 주름 방지는 아름다움의 상징으로써 꾸준한 관심의 대상이 되어 왔다. 이러한 관심으로 피부 미백과 주름 방지용 제품에 대한 수요는 꾸준히 증가하고 있고, 관련 화장품 산업은 고부가 가치 산업으로 성장하고 있다.

한편, 사람의 피부는 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하조직(subcutis)의 3층 구조로 이루어져 있다. 표피층에는 각질층(stratum corneum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum), 기저층(basal layer)이 존재한다.

일반적으로 피부 미백과 가장 밀접하게 연관되어 있는 것은 멜라닌으로 알려져 있다. 이러한 멜라닌은 피부 내 기저층에 존재하는 멜라노사이트(Melanocyte)에 의해 합성되며 티로시나제 등의 효소와 함께 작용하여 생체 내에 항상 존재하는 티로신(tyrosine)이라는 아미노산을 기질로 중합화하는 산화반응을 통해 흑갈색의 색소인 멜라닌을 형성하게 된다. 멜라닌은 멜라닌 세포의 수지상 돌기를 통하여 각질형성세포(keratinocyte)로 전이되어 피부의 착색을 유발한다.

생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고 다만 각질이 표피에서 떨어져 나갈 때 피부에서 같이 떨어져 나감으로써 제거된다. 이러한 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되거나, 피부 노화가 진행되면 과색소 침착증을 유발하여 기미, 주근깨 또는 점과 같은 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.

멜라닌 생산에 영향을 미치는 인자는 여러 가지가 알려져 있는데, 자외선에 의하여 일어나는 멜라닌 생산의 항진 그리고 이에 따른 멜라닌 침착은 화장품 분야에서 주목하고 있는 피부 착색의 요인 중 하나이다. 예를 들면, 멜라닌 침착의 예방 목적으로 사용되는 화장품에 이용되는 유효성분의 기본적인 메커니즘에는 티로시나제 형성에 관여하는 유전자의 형성을 억제하는 방법, 형성된 티로시나제의 활성을 억제하는 방법, 멜라닌 생성 매개체(mediator)의 억제, 기존 멜라닌의 환원 및 광산화 억제, 멜라닌 배설의 촉진 및 자외선 차단 등이 있다.

최근 기술의 발달과 삶의 질 향상으로 미(美)에 대한 욕구와 관심이 증대되면서 과도한 멜라닌 생성을 막는 미백 제품 개발이 필요하게 되었고 이에 따라 미백제 및 미백 화장품 개발에 관한 연구가 활발히 진행 중이다. 예를 들면, 코지산(kojic acid) 및 알부틴(arbutin) 등과 같은 티로시나제 활성을 저해하는 억제제들, 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 A, 비타민 C 및 이들의 유도체 등이 미백 제품에 사용되고 있다. 그러나 이들은 피부에 대한 안전성의 문제, 제형 내에서의 안정성 문제 및 미백 효과의 불충분으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

한편, 주름과 가장 밀접하게 연관되어 있는 것은 피부 세포의 노화이다. 일반적으로 피부 노화의 원인은 고령화에 따라 나타나는 자연 노화와 외부환경에 의해 나타나는 내적인 노화로 분류될 수 있다. 자연 노화는 유전자적 요인 등이 많이 관여되기 때문에 제어가 어렵다. 때문에, 자외선，산화，건조 등과 같은 환경적 요인을 제어하기 위해 많은 연구가 진행되고 있다.

환경적 요인은 주로 진피층에 포함된 콜라겐 단백질, 엘라스틴(elastin) 단백질 등을 파괴하거나 변성을 일으켜 주름을 유발한다. 특히, 태양의 자외선은 피부세포(섬유아세포)를 산화시키고 엘라스틴의 생성저하 및 파괴를 일으키는데, 자외선 등에 의해 피부 내에 엘라스틴 분해효소(elastase)가 발현되며 이 효소가 피부 내의 정상적인 엘라스틴을 분해하여 피부 탄력 저하를 가져 온다.

또한, 환경적 요인에 의해 양산된 활성 산소는 산화 작용에 의해 피부 세포 내의 단백질 파괴, 당의 산화, 유전자 변형 등을 일으켜 피부에 노화 및 주름을 유발할 수 있다. 이러한 산화력과 활성 산소는 피부 세포 내의 단백질 파괴, 당의 산화, 유전자 변형 등을 일으켜 피부에 노화 및 주름을 유발할 수 있다.

이에 따라, 상기의 부작용은 최소화하면서도 피부 미백과 산화 방지 및 주름 방지 효과를 모두 극대화할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 또한, 피부 자극, 세포 독성 등의 위해 요소가 적어 함량의 제한 없이 사용할 수 있는 화장료 조성물에 대한 요구도 증가하고 있다.

본 발명의 목적은 수련의 발효 추출물을 포함함으로써, 항산화, 피부 주름 방지, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 우수하며, 세포독성이 없고, 인체에 무해하며, 피부자극이 적은 화장료 조성물 및 생산성과 경제성이 우수한 상기 화장료 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예는 수련(Nmphaea tetragona)의 꽃, 잎 및 뿌리 추출물을 포함하는 추출 조성물을 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)로 발효시킨 수련 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 수련 추출 조성물은 물, 에탄올, 프로판올, 메탄올, n-부탄올, 아세톤, 1,3-부틸렌글라이콜, 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름 및 에틸아세테이트이상의 용매를 포함할 수 있다.

상기 수련 추출 조성물은 당도가 0.1 brix 내지 50 brix일 수 있다.

상기 수련 추출 조성물은 화장수, 에센스, 파운데이션, 파우더, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패치, 분무제, 마스크 시트 및 세정제 중 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 수련(Nmphaea tetragona)의 꽃, 잎 및 뿌리를 포함하는 수련 추출 조성물을 용매로 추출하는 단계; 수련 추출 조성을 함유하는 배지에 엘라스테이즈 활성 저해 효능을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)를 접종 및 배양하는 단계; 및 상기 배양액을 원심 분리하여 상등액인 수련 발효 추출물을 수득하고, 제형화하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 수련추출 조성물은 꽃, 잎 및 뿌리를 고형물 기준 1:0.5:0.3의 중량비로 포함하는 것일 수 있다.

상기 추출하는 단계는 수련 추출 조성물 전체 중량의 1배 내지 50배의 함량으로 용매를 가하고, 중탕 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 냉침 추출 및 페르콜레이션(percolation) 추출 중 1종 이상을 포함하는 방법으로 추출액을 제조하는 것일 수 있다.

상기 접종 및 배양하는 단계에서, 상기 배지는 MRS 배지 80 중량% 내지 95 중량% 및 당도가 0.1 brix 내지 50 brix인 수련 추출 조성물을 5 중량% 내지 20 중량%를 포함하는 것일 수 있다.

상기 접종 및 배양하는 단계는 상기 균주를 배지에 접종한 후, 27℃ 내지 37℃에서 3일 내지 7일간 배양하는 것을 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물 제조 단계는 수련 발효 추출물에 부형제를 첨가하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 화장수, 에센스, 파운데이션, 파우더, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패치, 분무제, 마스크 시트 및 세정제 중 어느 하나로 제형화하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 수련의 발효 추출물을 포함함으로써, 항산화, 피부 주름 방지, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 우수하며, 세포독성이 없고, 인체에 무해하며, 피부자극이 적은 화장료 조성물 및 생산성과 경제성이 우수한 상기 화장료 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예의 세포 활성도 시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 및 비교예의 자유라디칼 제거 능력 시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예의 주름 방지 효능 시험결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예의 미백 효능 시험결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 일 구현예는 수련(Nmphaea tetragona)의 꽃, 잎 및 뿌리 추출물을 포함하는 추출 조성물을 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)로 발효시킨 수련 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)로 발효시킨 수련의 발효 추출물을 포함함으로써, 항산화, 피부 주름 방지, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 우수하며, 세포독성이 없고, 인체에 무해하며, 피부자극이 적은 화장료 조성물 및 생산성과 경제성이 우수한 상기 화장료 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 류코노스톡 메센테로이데스 GFC 160704 균주는 인삼으로부터 분리된 균주로서, 세포 비독성 탐색 실험 및 엘라스테이즈 저해(elastase inhibition) 탐색 실험 등에 의해 선발된 것이다. 이러한 류코노스톡 메센테로이데스 GFC 160704 균주는 계통학적 특성 분석, 형태학적 특성 분석 및 생리학적 특성 분석 결과를 통해 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)와 99% 이상의 상동성을 같는 동속계 균주임이 확인 되었다.

상기 계통학적 특성 분석으로는 16S rDNA 시퀀스 분석 및 PCR을 이용한 계통수(Phylogenetic tree) 분석법을 수행하였다. 이와 같은, 류코노스톡 메센테로이데스 GFC 160704 균주의 분석은 제조예 1에 기재된 방법과 동일한 조건으로 수행되었다.

전술한 분석 방법들에 의해 동정된 본 류코노스톡 메센테로이데스 GFC 160704 균주는 세포 비독성을 나타내고, 엘라스테이즈 저해 효능이 매우 우수하다. 이러한 류코노스톡 메센테로이데스 GFC 160704 균주를 화장료 조성물, 예를 들면 주름방지용 화장료 조성물로 이용함으로써, 본 발명은 생산성 및 경제성이 우수하면서도, 엘라스테이즈 저해에 의한 주름 방지 효과의 장점을 동시에 취할 수 있다.

구체적으로, 상기 16S rDNA 시퀀스 분석에 사용된 균주는 하기의 방법으로 순수 분리하였다. 먼저, 인삼을 오존수에 살균한 후 밀봉하여 3개월 동안 자연 숙성하였으며, 이때 자연숙성된 인삼으로부터 균주를 분리하여 수행하였다. 상기 분리된 균주의 배양을 위해, 자연숙성된 인삼을 멸균증류수를 이용하여 1~10^-5배의 농도로 희석한 후 MRS agar 배지에 100㎕씩 도말하여 30℃의 인큐베이터에서 배양하였다. 균주는 모양, 색, 투명도, 크기, 외형구조 등을 육안으로 관찰하고, 세포 비독성 탐색 실험 및 엘라스테이즈 저해(elastase inhibition) 탐색 실험에 의해 선발하였다. 선발 균주는 MRS agar 배지에 Streaking 하여 4 회 계대 배양하여 Single colony를 순수 분리하였다. 순수 분리된 균주는 20% Glycerol stock solution을 만들어 -70℃의 초저온 냉동고에 보관하였다.

상기 선별된 균주로부터 DNA를 추출한 다음, 16S rRNA gene sequencing을 (주)제노텍에 의뢰하였으며, 계통학적 분석을 위하여 NCBI database를 이용하여 Type strain과의 상동성을 확인하였다. Type strain의 16S rRNA 염기서열을 BioEdit program (Hall, 1999)과 Clustal X program(Thompson et al., 1997)을 이용하여 Alignment 하고, 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura two-parameter model(Kimura, 1983)을 이용하였으며, MEGA 3 Program(Kumar et al., 2004)의 Neighbor-joining(Saitou and Nei, 1987)방법으로 계통분류학적 위치를 결정하였다.

상기 계통학적 분석 결과 균주가 락토바실러스 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)의 16S rRNA gene과 99％ 상동성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 상기 균주는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)에 속하는 새로운 균주로 판명되어 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주 (수탁번호: KCTC18474P)로 명명하고, 이를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2014년 10월 21일자로 수탁하고, 수탁번호 KCTC18474P 을 부여 받았다.

본 발명의 화장료 조성물은 수련(Angelica gigas)의 EtOH 추출물, E.A 분획물 및 BuOH 추출물을 포함하는 조성물을 상기 균주로 발효시킨 후 수련 발효 추출물로 제조하여 이용한다. 이러한 경우, 화장료 조성물은 자유라디칼 제거에 의한 항산화, 피부 주름 방지, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 우수하다.

본 발명의 수련 발효 추출물은 전술한 류코노스톡 메센테로이데스 GFC 160704 균주, 또는 이의 배양액을 포함할 수 있으며, 이에 의해 수련 추출 조성물이 갖는 항산화, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과를 더욱 향상시키면서도, 세포독성이 없고, 인체에 무해하며, 피부자극이 적은 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

상기 수련추출 조성물은 꽃, 잎 및 뿌리를 고형물 기준 1:0.5:0.3의 중량비로 포함하는 것일 수 있다. 이러한 경우, 수련 추출 조성물이 전술한 균주에 의해 발효되는 효율이 더욱 향상될 수 있다.

상기 수련 추출 조성물의 제조에 사용되는 수련은 품종, 부위가 특별히 한정되지 않는다. 또한, 상기 수련 추출 조성물은 추출액, 분말, 농축물 등의 다양한 형태로 가공되어 이용될 수 있다.

상기 수련 추출 조성물은 예를 들면, 물, 에탄올, 프로판올, 메탄올, n-부탄올, 아세톤, 1,3-부틸렌글라이콜, 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중 1종 이상의 용매를 포함할 수 있다. 상기 용매는 추출 용매로 이용되는 것일 수 있으며, 이러한 경우 추출되는 유효성분의 함량이 높아, 항산화, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과를 더욱 향상시키면서도, 세포독성이 없고, 인체에 무해하며, 피부자극이 적은 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

상기 수련 추출 조성물은 고형분 중량의 1배 내지 50배의 함량으로 용매를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 수련 추출 조성물이 전술한 균주에 의해 발효되는 효율이 더욱 향상될 수 있다.

상기 수련 추출 조성물은 당도가 0.1 brix 내지 50 brix, 구체적으로 1 brix 내지 40 brix, 보다 구체적으로 10 brix 내지 30 brix일 수 있다. 이러한 경우, 이러한 경우, 수련 추출 조성물이 전술한 균주에 의해 발효되는 효율이 더욱 향상되고, 수련추출 발효 추출물의 항산화, 피부 주름 방지, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 더욱 향상될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 파운데이션, 파우더, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패치, 분무제, 마스크 시트 및 세정제 중 어느 하나의 제형일 수 있다. 이러한 경우, 수련 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 항산화, 피부 주름 방지, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 더욱 향상될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 수련(Nmphaea tetragona) 꽃, 잎을 포함하는 수련 추출 조성물을 용매로 추출하는 단계; 수련 추출 조성을 함유하는 배지에 엘라스테이즈 활성 저해 효능을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)를 접종 및 배양하는 단계; 및 상기 배양액을 원심 분리하여 상등액인 수련 발효 추출물을 수득하고, 제형화하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 추출하는 단계는 수련 추출 조성물에 고형분 중량의 1배 내지 50배의 함량으로 용매를 가하는 것, 예를 들면, 꽃, 잎 및 뿌리를 고형물 기준 1:0.5:0.3의 중량비로 포함하는 수련 추출 조성물 100 중량부에, 용매를 100 내지 5000 중량부로 가하는 것을 포함할 수 있다.

구체적으로, 용매의 함량은 수련 추출 조성물 고형분 중량의 1.5배 내지 30배, 보다 구체적으로 5배 내지 20배 또는 5배 내지 15배일 수 있다.

상기 용매는 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 구체적으로, 상기 물은 알카리수일 수 있다. 구체적으로, 상기 유기 용매는 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급알코올, 예를 들면, 에탄올, 프로판올, 메탄올, n-부탄올, 아세톤, 1,3-부틸렌글라이콜 등의 극성 유기 용매; 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 등의 비극성 유기 용매; 및 이들의 혼합물 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 용매는 1종을 단독으로 사용하거나 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

구체예에서, 상기 용매는 물;과 에탄올, 메탄올, n-부탄올, 프로판올 중 하나 이상;을 포함하는 혼합 용매, 또는 1,3-부틸렌글라이콜일 수 있다. 이러한 경우, 유효 성분의 추출 효율이 더욱 향상될 수 있다.

또한, 상기 추출하는 단계는 용매를 가한 후, 중탕 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 냉침 추출 및 페르콜레이션(percolation) 추출 중 1종 이상을 포함하는 방법으로 추출액을 제조하는 것을 포함할 수 있다.

상기 추출하는 단계에서 추출 횟수는 구체적으로 1회 내지 5회 반복될 수 있다. 이러한 경우, 유효 성분의 추출 효율이 더욱 향상될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 추출하는 단계는 환류 냉각기가 달린 추출기에 수련 조성물 및 용매를 투입한 후, 50℃ 내지 100℃에서 4 내지 20시간 동안 가열 환류냉각 추출하는 것일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 추출하는 단계는 수련 추출 조성물 및 용매를 투입한 후, 5℃ 내지 37℃에서 1 내지 15일간 침적시켜 냉침 추출하는 것일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 상기 추출하는 단계는 수련 추출 조성물 및 용매를 투입한 후, 1 내지 200 시간 동안 페르콜레이션할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 상기 추출하는 단계는 수련 추출 조성물 및 용매를 투입한 후, 50℃ 내지 100℃에서 0.5 내지 72시간 동안 중탕 추출할 수 있다.

상기 수련 추출 조성물 추출액, 상기 추출액을 건조시킨 분말, 상기 추출액을 농축여과한 농축물 등의 다양한 형태로 가공되어 이용될 수 있다. 상기 수련 추출 조성물로부터 제조된 추출액은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 함수 알코올을 침출 용매로 포함하는 틴크, 농축물, 엑기스, 유동엑기스 등의 형태로 이용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 추출하는 꽃, 잎, 뿌리를 건조 고형물 기준 1:0.5:0.3의 중량비로 포함하는 수련 추출 조성물에, 상기 수련 추출 조성물 중량의 5배 내지 15배의 에탄올을 가하고, 20 내지 30℃에서 1 내지 72시간 동안 추출하고, 필터 여과 및 농축하여 농축물 상태의 추출액을 얻을 수 있다.

상기 접종 및 배양하는 단계는 수련 추출 조성물의 추출액을 함유하는 배지에 엘라스테이즈 활성 저해 효능을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)를 접종하고, 이를 배양하는 것을 포함한다.

상기 접종 및 배양하는 단계에서, 상기 배지는 MRS 배지 80 중량% 내지 95 중량% 및 수련 추출 조성물의 추출액 5 중량% 내지 20 중량%를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 배양의 효율이 우수하고, 수련 발효 추출물에 포함되는 유효성분의 함량이 더욱 증대될 수 있다.

상기 수련 추출 조성물의 추출액은 당도가 0.1 brix 내지 50 brix, 구체적으로 1 brix 내지 40 brix, 보다 구체적으로 10 brix 내지 30 brix일 수 있다. 이러한 경우, 이러한 경우, 수련 추출 조성물이 전술한 균주에 의해 발효되는 효율이 더욱 향상되고, 수련 발효 추출물의 항산화, 피부 주름 방지, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 더욱 향상될 수 있다. 또한, 상기 당도를 조절하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 농축 또는 희석에 의해 조절될 수 있다.

상기 접종 및 배양하는 단계는 상기 균주를 배지에 접종한 후, 27℃ 내지 37℃에서 3일 내지 7일간 배양하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 배양의 효율이 우수하고, 수련 발효 추출물에 포함되는 유효성분의 함량이 더욱 증대될 수 있다.

상기 화장료 조성물 제조 단계는 상기 배양액을 원심 분리하여 상등액인 수련 발효 추출물을 수득하고, 제형화하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 상기 배양액은 원심 분리 후 살균 과정을 거쳐, 균주를 제균하여 이용할 수 있다. 이러한 경우, 향후 미생물에 번식에 의한 유효성분의 파괴를 방지하고, 제품의 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다.

상기 발효 과정을 거쳐 얻어지는 수련 발효 추출물은 발효 과정을 거치지 않은 수련 추출물에 비해 우수한 피부 항산화, 피부 미백, 피부 주름 방지 및 피부 트러블 조절 효과가 우수하며, 피부 미백용, 피부 주름 방지용, 항산화용 화장료 조성물로 이용되기에 적합하다.

상기 화장료 조성물의 제조단계는 수련 발효 추출물에 부형제를 첨가하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 화장수, 에센스, 파운데이션, 파우더, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패치, 분무제, 마스크 시트 및 세정제 중 어느 하나로 제형화하는 것을 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성의물 제조단계에서, 전체 화장료 조성물 중 수련 발효 추출물의 함량은 0.01 중량% 내지 50 중량%, 구체적으로, 0.2 중량% 내지 30 중량%, 보다 구체적으로 0.5 중량% 내지 20 중량%일 수 있다. 상기 범위 내에서 우수한 항산화, 피부주름개선, 피부 미백 및 피부톤 개선 효과가 우수하며, 세포독성이 없고, 인체에 무해하며, 피부자극이 적어 화장료 조성물로 이용되기에 더욱 적합할 수 있다.

상기 부형제는 정제수(water), 글리세린(glycerin), 미리스틱애씨드(myristic acid), 부틸렌글라이콜(butylene glycol), 포타슘하이드록사이드(potassium hydroxide), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 스테아레이트(sterate), 스테아릭애씨드(stearic acid), 라우릭애씨드(laruic acid), 라우라마이드디이에이(lauramide DEA), 글리세릴스테아레이트(glyceryl stearate), 배헤닐알코올(behenyl alcohol), 마이크로크리스탈린왁스(microcrystalline wax), 페녹시에탄올(phenoxyethanol), 에칠헥실글리세린(ethylhexylglycerin), 토코페릴아세테이트(tocopheryl acetate), 1,2-헥산디올(1,2-hexanediol), 카프릴릴글라이콜(caprylyl glycol), 히드록시에틸렌셀룰로오스(hydroxyethylene cellulose), 잔탄검(xanthan gum), 콜라겐(collagen), 시트르산 나트륨(sodium citrate), 시트르산(citrate), 아스코르빈산 마그네슘(magnesium ascorbate) 및 향료(fragrance) 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.

여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

제조예 1 : 균주의 준비 및 동정

<균주의 준비>

인삼을 오존수에 살균한 후 밀봉하여 3개월 동안 자연 숙성하였다. 상기 자연 숙성된 인삼을 멸균 증류수에 현탁하여 1~10^-5배의 농도로 희석한 후 MRS agar 배지에 100㎕씩 도말하고, 30℃의 인큐베이터에서 24시간 배양하였다.

상기와 같이 배양된 균주를 모양, 색, 투명도, 크기, 외형구조 등을 육안으로 관찰하여 선발하였다. 선발된 균주는 MRS agar 배지에 도말(streaking)하여 4회 계대 배양한 후 형성된 싱글 콜로니(single colony)를 순수 분리하였다. 순수 분리된 균주는 20% Glycerol stock solution을 만들어 -70℃의 초저온 냉동고에 보관하였다.

<균주의 동정>

1) 계통학적 특성분석

상기에서 순수분리된 균주로부터 16S rDNA 시퀀스 분석을 위한 DNA를 추출한 후, 16S rRNA gene sequencing을 DNA 분석기관인 (주)제노텍에 의뢰하였으며, 계통학적 분석을 위하여 NCBI database를 이용하여 Type strain과의 상동성을 확인하였다. Type strain의 16S rRNA 염기서열을 BioEdit program (Hall, 1999)과 Clustal X program(Thompson et al., 1997)을 이용하여 Alignment 하고, 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura two-parameter model(Kimura, 1983)을 이용하였으며, MEGA 3 Program(Kumar et al., 2004)의 Neighbor-joining(Saitou and Nei, 1987)방법으로 계통분류학적 위치를 결정하였다.

상기 균주로부터 DNA를 추출하여 16S rRNA 분석을 실시하고 BLAST 프로그램을 사용하여 균주의 상동성을 분석한 결과, 균주가 락토바실러스 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)와의 16S rRNA gene과 99％ 상동성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로, 16S rDNA 시퀀스 기반의 계통수(ndetic tree) 분석을 수행하였고, 그 결과 순수 분리된 균주류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)에 속하는 새로운 균주 균주임을 확인하였다.

이에 따라, 상기 순수 분리된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주 (수탁번호: KCTC18474P)로 명명하고, 이를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2014년 10월 21일자로 수탁하고, 수탁번호 KCTC18474P을 부여받았다.

제조예 2: 수련 추출 조성물의 추출액 제조

건조된 수련 꽃 100.0g 수련 잎 50.0g, 수련 뿌리 30.0g 을 혼합하여 준비한 수련 추출 조성물에, 상기 수련 추출 조성물 중량의 10배로, 70% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 2시간 동안 추출하였다. 이후, 용매를 증발시켜 당도는 20brix로 조절된 농축물을 수득하였다.

제조예 3: 수련 추출 조성물의 추출액 제조

건조된 수련 꽃 100.0g 수련 잎 50.0 을 혼합하여 준비한 수련 추출 조성물에, 상기 수련 추출 조성물 중량의 10배로, 70% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 2시간 동안 추출하였다. 이후, 용매를 증발시켜 당도는 20brix로 조절된 농축물을 수득하였다.

제조예 4: 수련 추출 조성물의 추출액 제조

건조된 수련 꽃 100.0g, 수련 뿌리 30.0g 을 혼합하여 준비한 수련 추출 조성물에, 상기 수련 추출 조성물 중량의 10배로, 70% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 2시간 동안 추출하였다. 이후, 용매를 증발시켜 당도는 20brix로 조절된 농축물을 수득하였다.

제조예 5: 수련 추출 조성물의 추출액 제조

건조된 수련 꽃 100.0g 수련 잎 100.0g, 수련 뿌리 100.0g 을 혼합하여 준비한 수련 추출 조성물에, 상기 수련 추출 조성물 중량의 10배로, 70% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 2시간 동안 추출하였다. 이후, 용매를 증발시켜 당도는 20brix로 조절된 농축물을 수득하였다.

실시예 1: 수련 발효 추출물의 제조

상기 제조예 1에서 순수분리된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)를 MRS 배지에서 37℃에서 2일간 회전 배양하여 전배양하였다.

상기 제조예 2의 농축물 10 중량% 및 MRS 배지 90중량%를 혼합하여, 배양용 배지를 조성한 후, 이를 121℃에서 15분간 고압멸균처리한 후 실온으로 냉각시켜 발효를 위한 배지를 준비하였다.

앞서 전배양한 GFC 160704 균주를 준비된 배지 100 중량부에 대하여 3 중량부의 양으로 접종하고, 37℃에서 5일 동안 현탁 배양한 후, 원심 분리하여 배양상등액을 수득하였다. 수득한 배양상등액은 0.45㎛ 필터로 여과하여 수련 발효 추출물을 제조하였다.

비교예 1

상기 제조예 1에서 순수분리된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주 (수탁번호: KCTC18474P)를 MRS 배지에서 37℃에서 2일간 회전 배양하여 전배양하였다.

상기 제조예 3의 농축물 10 중량% 및 MRS 배지 90중량%를 혼합하여, 배양용 배지를 조성한 후, 이를 121℃에서 15분간 고압멸균처리한 후 실온으로 냉각시켜 발효를 위한 배지를 준비하였다.

앞서 전배양한 GFC 160704 균주를 준비된 배지 100 중량부에 대하여 3 중량부의 양으로 접종하고, 37℃에서 5일 동안 현탁 배양한 후, 원심 분리하여 배양상등액을 수득하였다. 수득한 배양상등액은 0.45㎛ 필터로 여과하여 여과하여 비교예 1을 제조하였다.

비교예 2

상기 제조예 1에서 순수분리된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주 (수탁번호: KCTC18474P)를 MRS 배지에서 37℃에서 2일간 회전 배양하여 전배양하였다.

상기 제조예 4의 농축물 10 중량% 및 MRS 배지 90중량%를 혼합하여, 배양용 배지를 조성한 후, 이를 121℃에서 15분간 고압멸균처리한 후 실온으로 냉각시켜 발효를 위한 배지를 준비하였다.

앞서 전배양한 GFC 160704 균주를 준비된 배지 100 중량부에 대하여 3 중량부의 양으로 접종하고, 37℃에서 5일 동안 현탁 배양한 후, 원심 분리하여 배양상등액을 수득하였다. 수득한 배양상등액은 0.45㎛ 필터로 여과하여 비교예 2를 제조하였다.

비교예 3

상기 제조예 1에서 순수분리된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주 (수탁번호: KCTC18474P)를 MRS 배지에서 37℃에서 2일간 회전 배양하여 전배양하였다.

상기 제조예 5의 농축물 10 중량% 및 MRS 배지 90중량%를 혼합하여, 배양용 배지를 조성한 후, 이를 121℃에서 15분간 고압멸균처리한 후 실온으로 냉각시켜 발효를 위한 배지를 준비하였다.

앞서 전배양한 GFC 160704 균주를 준비된 배지 100 중량부에 대하여 3 중량부의 양으로 접종하고, 37℃에서 5일 동안 현탁 배양한 후, 원심 분리하여 배양상등액을 수득하였다. 수득한 배양상등액은 0.45㎛ 필터로 여과하여 비교예 3을 제조하였다.

비교예 4

상기 제조예 5의 농축물 10 중량% 및 MRS 배지 90중량%를 혼합하여, 배양용 배지를 조성한 후, 이를 121℃에서 15분간 고압멸균처리한 후 실온으로 냉각시켜 비교예 4를 제조하엿다.

<효능 평가>

1) 세포 독성 시험

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에 대하여, 각각 0(㎍/㎖), 3.125(㎍/㎖), 6.25(㎍/㎖), 12.5(㎍/㎖), 25(㎍/㎖), 50(㎍/㎖), 100(㎍/㎖)의 농도로 희석하였고, 상기 비교예 2에 대하여, 각각 0(㎍/㎖), 0.125(㎍/㎖), 0.25(㎍/㎖), 0.5(㎍/㎖), 1(㎍/㎖), 2(㎍/㎖), 4(%)의 농도로 희석하여 농도에 따른 세포 독성 정도를 평가하였다.

대식세포의 일종인 RAW 264.7 cell을 1% 페니실린/스크랩토마이신, 10% FBS(fetal bovineserum)가 포함된 DMEM배지(ulbecco's Modified Eagle Medium)를 이용하여 24 well plate에 1.0 x 10⁴cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24 시간 동안 배양하였다.

상기 24 시간 배양한 cell에 상기 실시예 1 및 비교예 1~3을 각 농도별로 배지와 혼합 후, 각 well에 1ml씩 첨가하고 37℃및 5% CO₂조건의 incubator에서 24시간 동안 반응한 다음, 각 well의 상등액 만을 따로 취한 뒤 각 well에 WST-1 assay solution (ez-cytox)을 첨가하여 배양기에서 2 시간 반응 후 ELISA reader기로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 식 1에 의하여 세포생존율을 계산하여 그 결과를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.

[식 1]

세포 생존율(%) = [(시료 처리군의 흡광도 / 무처리군의 흡광도) * 100]

하기 표1을 참조하면, 상기 실시예 1는 100(㎍/㎖)농도에서도 세포 독성이 없음을 알 수 있었다.

구분/농도 100(㎍/㎖)	세포생존율(%)
양성대조군	99.4±0.15
실시예1	99.5±0.36
비교예1	99.4±0.54
비교예2	98.2±0.13
비교예3	68.3±0.26
비교예4	99.6±0.32

2) 자유라디칼 제거 능력 시험

프리라디칼은 활성산소를 말하며, 우리가 호흡한 산소가 에너지를 만들고 물로 환원되는 과정에서 나타나는 산화력이 수 천 배나 높은 물질이다. 동식물의 체내 세포들의 대사과정에서 생성되거나 스트레스, 광자극, 세균 침투에 의해서도 발생되며, 과량의 활성산소가 체내에 존재하면 정상 세포까지 무차별 공격, 각종 질병과 노화의 주범이 된다. 또한, 외부 자극에 민감한 면역 반응을 보이는 병리적 인자로 작용하게 된다.

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에 대하여, 0, 0.156, 0.313, 0.63, 1.25, 2.5(㎎/㎖)의 농도로 희석하였고, 비교예에 대하여, 각각 0, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4(%)의 농도로 희석하여 DPPH 억제 정도를 평가하였다. 농도별로 0.1M DPPH 250㎕(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)용액을 혼합 후 30 분간 4℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 각 sample을 96 well plate에 담아 ELISA reader기를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 상기 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 하기 식 2에 의해 시료의 자유라디칼 소거량(Free radical scavenging activity, %)을 계산하여 그 결과를 하기 표에 나타내었다. 이때, 양성 대조군으로 아스코르브산(ascorbic acid)를 사용하여 진행하였고 자유라디칼 소거량이 50 %일 때 아스코로브산의 농도는 1.73 ㎍/㎖으로 나타났다.

[식 2]

자유라디칼소거능(%)=[100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도 X 100)]

하기 표 2 및 도 2를 참조하면, 실시예는 비교예 보다 DPPH 소거능이 증가함을 알 수 있었다. 실시예는 비교예 4의에 사용된 균주보다 발효 후, 자유라디칼소거능이 더욱 높아짐을 알 수 있었다.

구분/농도 100(㎍/㎖)	자유라디칼소거능(%)
양성대조군	66.74±0.98
실시예1	92.05±0.68
비교예1	62.45±0.92
비교예2	50.18±0.61
비교예3	93.5±0.55
비교예4	31.2±0.48

3) 주름방지 효능 검증 시험

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에 대하여, 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10(㎎/㎖)의 농도로 희석하여 엘라스테이즈(Elastase) 억제 정도를 평가하였다.

각각의 농도로 희석하여 농도별로, 10mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)에 녹인 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide (S4760, Sigma) 1.6 mM 농도의 기질과 Elastase from porcine pancreas Type Ⅳ(E0258, Sigma) 0.4U/mL를 혼합하여 25℃에서 5분 동안 반응한 후 96 well plate에 담아 410nm에서 흡광도를 측정하였다.

그리고 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 하기 식 3를 이용하여 계산하여 그 결과를 하기 표3 및 도3 에 나타내었다. 이때, 양성 대조군으로 올레아놀릭산(Oleanolic acid)를 사용하여 진행하였고, 엘라스테이즈 저해활성이 50%일 때 올레아놀릭산의 농도는 8.68 ㎍/㎖으로 나타났다.

[식 3]

엘라스테이즈 저해활성(%)=100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도 X 100)

표 3을 참조하면, 실시예 1은 비교예 보다 엘라스테이즈 저해 효과가 증가함을 알 수 있었다. 실시예는 비교예 4의에 사용된 균주보다 발효 후, 엘라스테이즈 저해 효과 증가율이 더욱 높아짐을 알 수 있었다.

	실시예 1 (%)	양성대조군	비교예 1 (%)	비교예 2 (%)	비교예 3 (%)	비교예 4(%)
25 (㎍/ml)	64.51	67.15	36.53	36.90	27.24	9.84
50 (㎍/ml)	38.11	82.51	30.83	46.29	47.54	10.66
100(㎍/ml)	88.54	90.25	51.45	72.18	84.50	18.04

4) 미백 효능 검증 시험

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에 대하여, 멜라닌 억제량을 측정하였다. 25, 50, 100(㎍/㎖)의 농도로 희석하여, B16F10 melanoma cell을 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용해 60ΦPetri dish에 한 dish당 2.0 x 10⁵cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 멜라닌 생성을 유도하기 위한 α-MSH 50nM과 함께 상기 실시예 및 비교예를 각각 취하여 배지와 혼합하여 분주하고 60시간 반응시켜준 뒤, 배양액(상층액) 수거하였다.

60시간 반응시킨 배양액(상층액)은 세포 외 멜라닌 생성량을 측정하기 위하여 1ml을 덜어 ELISA plate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 하기 식 4의 계산식을 이용하여 세포 외 멜라닌 생성량을 계산하여 그 결과를 하기 표 2 및 도 7에 나타내었다. 이때, 양성 대조군으로 알부틴을 사용하여 진행하였다.

[식 4]

멜라닌 생성량(%)=(각 시험물질의 흡광도/대조군의 흡광도)X100

	실시예 1 (%)	대조군 1 (%) (알부틴)	비교예 1 (%)	비교예 2 (%)	비교예 3 (%)	비교예 4(%)
25 (㎍/ml)	56.08	-	65	78	64	84
50 (㎍/ml)	42.63	34.50	43.21	65.34	41.51	76.1
100 (㎍/ml)	28.15	25.6	29.53	59.70	38.56	74.8

제형예 1: 화장수 제조

하기 표 5에 기재된 성분을 사용하여 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1의 수련 발효 추출물	3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스 (2% 수용액)	12.00
잔탄검 (2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글라이콜	6.00
글리세린	4.00
히알루론산나트륨 (1% 수용액)	5.00
정제수	잔량
계	100.0

제형예 2: 영양로션 제조

하기 표 6에 기재된 성분을 사용하여 통상의 방법에 의하여 영양로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1의 수련 발효 추출물	3.00
아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.01
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글라이콜	3.00
정제수	잔량
계	100.0

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (10)

1. 수련 꽃, 수련 잎 및 수련 뿌리가 고형물 기준 1:0.5:0.3의 중량비로 포함된 수련 추출 조성물을 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)로 발효시킨 수련 발효 추출물을 함유하는 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 수련 추출 조성물은 물, 에탄올, 프로판올, 메탄올, n-부탄올, 아세톤, 1,3-부틸렌글라이콜, 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중 1종 이상의 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 수련 추출 조성물은 당도가 0.1 brix 내지 50 brix인 것을 특징으로 하는 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 파운데이션, 파우더, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패치, 분무제, 마스크 시트 및 세정제 중 어느 하나의 제형인 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물.
   
5. 수련 꽃, 수련 잎 및 수련 뿌리가 고형물 기준 1:0.5:0.3의 중량비로 포함된 수련 추출 조성물을 용매로 추출하는 단계; 수련 추출 조성물을 함유하는 배지에 엘라스테이즈 활성 저해 효능을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) GFC 160704 균주(수탁번호: KCTC18474P)를 접종 및 배양하는 단계; 및 배양액을 원심 분리하여 상등액인 수련 발효 추출물을 수득하고, 제형화하는 단계를 포함하는 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
   
   
   
6. 삭제
7. 제5항에 있어서,
   상기 추출하는 단계는 수련 추출 조성물 전체 중량의 1배 내지 50배의 함량으로 용매를 가하고, 중탕 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 냉침 추출 및 페르콜레이션(percolation) 추출 중 1종 이상을 포함하는 방법으로 추출액을 제조하는 것인 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기 접종 및 배양하는 단계에서, 상기 배지는 MRS 배지 80 중량% 내지 95 중량% 및 당도가 0.1 brix 내지 50 brix인 수련 추출 조성물의 추출액 5 중량% 내지 20 중량%를 포함하는 것인 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
   
9. 제5항에 있어서,
   상기 접종 및 배양하는 단계는 상기 균주를 배지에 접종한 후, 27℃ 내지 37℃에서 3일 내지 7일간 배양하는 것을 포함하는 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
   
10. 제5항에 있어서,
    상기 화장료 조성물 제조 단계는 수련 발효 추출물에 부형제를 첨가하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 화장수, 에센스, 파운데이션, 파우더, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패치, 분무제, 마스크 시트 및 세정제 중 어느 하나로 제형화하는 것을 포함하는 항산화, 주름개선 및 미백용 화장료 조성물의 제조방법.

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