JP5663187B2 - 抗酸化剤、紫外線傷害抑制剤及び抗光老化化粧料 - Google Patents

Description

本発明は、特定培地で培養したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ の菌体抽出液からなることを特徴とする抗酸化効果に優れた皮膚外用剤ならびに紫外線傷害を抑制する効果の高い抗光老化化粧料に関する。

近年、老化の原因としてフリーラジカルや活性酸素がとりあげられ、生体成分の酸化による機能低下が大きな問題となっている。なかでも紫外線に常にさらされている皮膚は、このような酸化ストレスのダメージが最も大きな器官の一つであり、紫外線により発生した種々の活性酸素が、皮脂や脂質の過酸化、蛋白変性、酵素阻害等を引き起こし、皮膚の炎症などの原因となる。また、紫外線により真皮のヒアルロン酸やコラーゲンの産生が低下すると共に、コラーゲンの変性が生じ、肌の弾力やハリが低下しシワの原因になる。さらに、表皮細胞が紫外線に照射されると各種のサイトカインを産生し、メラニン産生を増大させる。例えばエンドセリンや、チオレドキシンなどのサイトカインは紫外線照射により表皮細胞から産生されメラノサイトに働きかけてメラニン産生を促進させ光老化によるシミの原因になっている。これら紫外線が原因となる光老化により生じるシワ・シミを防ぐ方法の一つにフリーラジカルや活性酸素を除去する抗酸化剤を配合する方法が知られている。

生体は活性酸素種を除去する自己防御機構としてＳＯＤなどの抗酸化機構を有しているものの、生体組織の防御能力を超えた活性酸素が生体組織の老化の原因となる。フリーラジカルを捕捉する能力を備える抗酸化剤は、ラジカル連鎖反応を抑制・停止させることができるので、このような抗酸化剤を配合した皮膚外用剤は、光酸化ストレスによる皮膚老化、例えば、シワ・シミ・タルミなどの予防・改善効果が期待できる。このため従来より、光老化によるシワ防止を目的として用いられるフリーラジカル消去剤にはアスコルビン酸、トコフェロール、３，５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）等が用いられてきた。

しかし、皮膚の光老化防止又は抗酸化を目的として用いられるＳＯＤは不安定であり、製剤化が難しく、トコフェロールも効果が充分であるとは言えない。また、合成化合物であるＢＨＴ等は安全性に問題があり、配合量に制限があることから、化学合成品ではなく、安定でかつ副作用が少ないとともにより効果の高い天然原料が望まれてきた。

酵母の菌体抽出液には抗酸化効果があることが知られており、特開平８−１００１７５（特許文献１）には、酵母を細胞壁溶解酵素あるいはタンパク質分解酵素により処理し抽出した水溶性の抗酸化作用を有する酵母タンパク質分解物の記載がなされている。また、特開２００６−２７１２６１（特許文献２）には抗酸化健康食品として、発酵活性を有しないサッカロマイセスセレビシエを配合した抗酸化健康食品に関する記載がなされている。

特開２００６−１９７８９７（特許文献３）には酵母を培養する培地成分として、焼酎蒸留残液を原料として用いて、米麹及び酵母の存在下で発酵させた抗酸化作用を有する飲食品の記載がある。
さらに、特開２００６−１０９７６８（特許文献４）には、サトウキビから砂糖を分離した糖蜜および／または柑橘果汁窄汁残渣より回収する果汁蜜で酵母を培養し、ラジカル消去活性の高い酵母含有組成物を得る方法の記載があり、特開２００６−９４８００（特許文献５）には廃糖蜜を乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌を用いて発酵させることを特徴とする抗酸化作用が増強された組成物の記載がなされている。

特開２００４−１４１１６３（特許文献６）には、モモタマナ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃａｔａｐｐａ）の葉を乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌が用いて発酵させて得られる抗酸化効果の高い組成物が、また、特開２００４−７３０５０（特許文献７）には、沖縄に自生しうるミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）植物及び／又はキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）植物を、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌を用いて発酵させる発酵組成物、また特開２００４−４３５０５（特許文献８）には、グアバ抽出物と、米糠類、大豆類及び炭素源を含む培地に微生物を接種し、発酵培養して得られる米糠・大豆発酵物を含有することを特徴とする発酵組成物が記載されている。

特開２００２−３３５８８１（特許文献９）には、イチゴ、イチジク、ウメ、ブルーベリー、ラズベリー、リンゴ、キウイ等の果実、あるいは柑橘類の皮を加熱殺菌し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを接種して発酵させ、これに砂糖、ペクチン等を加えて加熱濃縮してジャムを製造する抗酸化性に優れ、風味のよい食品の記載がある。

特開２００５−３４８６０７（特許文献１０）には、白米に黄麹菌を接種して３０時間以上の培養して麹（黄麹）を造り、次いで、水に酵母と麹（黄麹）、蒸米を加えて醗酵を行い、清酒醪とする一方で、紫黒米の玄米に白麹菌または黒麹菌を接種して培養することによりクエン酸生成を特徴とする麹を製造し、得られた麹に水を加え、糖化液とし、この糖化液と上記清酒醪とを混合したのち圧搾することを特徴とする低アルコール機能性清酒の製造方法が記載されている。
上記に記載したように培地等にいろいろなものを添加し、また各種の微生物を用いて培養した組成物が記載されている。しかしながら、黒米抽出液、赤米抽出液を培地に添加し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ で培養し、培養後の菌体抽出液を利用した抗酸化剤、紫外線傷害抑制剤の記載はなされていない。

特開平８−１００１７５号公報 特開２００６−２７１２６１号公報 特開２００６−１９７８９７号公報 特開２００６−１０９７６８号公報 特開２００６−９４８００号公報 特開２００４−１４１１６３号公報 特開２００４−７３０５０号公報 特開２００４−４３５０５号公報 特開２００２−３３５８８１号公報 特開２００５−３４８６０７号公報

上述のように、各種培地にて酵母菌をはじめとして、各種の菌を培養して、抗酸化物質を得ているが、いずれも満足いく効果ではなかった。そこで、本願においては黒米抽出液、赤米抽出液から選ばれる1種以上の抽出液を培地に添加し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ で培養した培養後の菌体抽出液が、これまでにない高い抗酸化効果を有する物質を得ることを課題とし、更には、紫外線照射による光老化で生じるシワ・シミの抑制に有効な化粧品に応用することを課題とする。

酵母菌の培養に通常用いられる培地に、黒米抽出液、赤米抽出液から選ばれる1種以上の抽出液を加え、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ で培養し、培養終了後、菌体と培養液とに分離し、本培養菌体の抽出液を効果成分として用いる。

本発明によると黒米抽出液、赤米抽出液から選ばれる1種以上の抽出液を添加した培地でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ で培養した培養後の菌体抽出液は、高い抗酸化性物質を含有するため、紫外線による細胞の損傷を抑制する作用が顕著である。紫外線は皮膚内で活性酸素を生成し、表皮細胞にアポトーシスを起こさせると共に、種々のサイトカインを産生しメラニン産生を促進させる。紫外線照射により表皮細胞は傷害され細胞数の減少を招くと共に、表皮の角化が抑制され表皮バリアーの形成が不十分となる。このため、皮膚の水分保持が少なくなり、かさかさした肌になると共に炎症も起こり易い肌となる。また、真皮の線維芽細胞は、紫外線照射によりコラーゲン・ヒアルロン酸の産生が抑制され、肌のハリ・弾力が低下する。従って、かかる酵母菌体抽出液を配合してなる本発明の化粧料は、それら両作用の複合に基づく相乗的効果により、紫外線による光老化によるシワ・シミ・タルミなどの皮膚の老化や不健全化の症状の予防或いは改善に多面的かつすぐれた効果を発揮して、皮膚を真に健全で若々しい状態に維持し、改善する効果を有する。又、本発明化粧料で活性成分として用いる酵母菌体抽出液は、皮膚に対する刺激性が全くなく、このため本発明の化粧料は生体安全性にも大変すぐれたものである。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で用いるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ は市販されているパン酵母、または分譲されているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに属する酵母であれば特に制限なく使用できる。また、酵母は糖類が存在する自然界からも容易に分離することができるため、植物や土などから分離した酵母であっても、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに属する酵母であれば使用できる。

また、培地に添加する黒米および赤米は、米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）の品種のひとつであり、古代米とも呼ばれる。黒米にはアントシアニン系の色素を含むのが特徴であり、このため外見が黒色を呈している。さらに黒米にはビタミンＣや、銅・亜鉛・マンガン等のミネラルを多く含むと言われている。黒米の品種には紫黒苑、黒田苑、湖南黒米（登録商標）、黒紫、湖北紫黒米などが栽培され利用されており、いずれの品種のものも本発明に利用できる。赤米はタンニン系のポリフェノール色素を含むため、外観は赤茶色を呈している。赤米は単独で飯にした場合著しく食味が劣るため白米や他の雑穀と共に飯にしたり、酒・菓子の加工用に用いられることが多い。品種としては紅茜、紅吉兆、紅朱雀、紅飛鳥、桃園などのものが栽培され利用されており、いずれの品種のものも本発明に利用できる。

本発明に用いる黒米および赤米抽出液の調製法は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて低温下から加温下で抽出することができる。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。そのうち、水、エチルアルコール、１、３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適に示される。

また抽出方法は黒米および赤米をそのまま、あるいは粉砕したものを質量比で２〜１０００倍量、特に５〜１００倍量の溶媒を用いることが出来る。常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好適である。また、６０〜１００℃で０．５〜２４時間、加熱抽出しても良い。

以上のような条件で得られる黒米、赤米抽出液は、ろ過等の処理をして溶液のまま用いても良いが、更に必要により、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを培養する培地としては、一般的にはＹＭ培地、ＹＰＤ培地などが代表的であるが、グルコースのような糖原料と、酵母エキスのような微量ビタミン類、ミネラル類などの栄養素を含有する物質が含まれていれば培養が可能である。また、酵母の生育に必要なアミノ酸、ビタミン、ミネラル、糖源、窒素源を加えた合成培地でも培養が可能である。基本培地の炭素源としては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース等の単糖類、シュクロース、マルトース、トレハロース等の二糖類を用いることができる。基本培地の窒素源としては、イーストエキス、モルトエキス、ペプトン、ポリペプトン、カザミノ酸等の有機物、硝酸カルシウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム等の窒素含有化合物を用いることができる。また、ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等を用いることができる。ミネラルとしては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として用いることができる。

前記以外の培地組成であっても、酵母菌培養に適している培地であれば、本発明に適用されるのは勿論である。さらに、培地には水或いは水と低級アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノールなど）もしくはグリコール類（エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンなど）との混液等を添加して培養しても良い。

前記の組成からなる培地は、これを培養工程に供する前に、殺菌を行って培養の障害となる雑菌を除去する。この場合殺菌除去方法としては、培養組成物を予め殺菌した上、無菌水等の無菌媒体に懸濁する方法を用いてもよく、又培養組成物を媒体に懸濁した後、懸濁液を加熱殺菌する方法を用いるようにしてもよい。加熱殺菌法としては、懸濁液を１２０〜１３０℃で１０〜２０分間加熱するオートクレーブ殺菌法や、懸濁液を８０〜９０℃に６０〜１２０分間保持することを１日１回２〜３日間繰り返す間断殺菌法が一般に用いられる。

次に、この無菌化した培養液を培養タンクに入れ、これに酵母を植菌して培養を行う。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ の接種量は１０^７〜１０^８個／ｍＬが適量である。接種量が上記の範囲より多くなっても培養の進行時間は殆ど変わらず、一方上記の範囲より少なくなると培養完了までに長時間を要することとなって好ましくない。

培養温度は一般に５〜５０℃の範囲、好ましくは酵母菌の生育至適温度である２０〜４０℃の範囲である。培養日数は、至適温度に於いて一般に１〜１０日、好ましくは２〜５日の範囲である。培養日数が上記の一般的範囲より短くなると培養が十分に行われず培養物の有効性が低下する傾向にあり、一方１０日を越えて長くしても有効性のそれ以上の上昇は認められないだけでなく、菌体への着色や培養臭の増加が生ずることとなっていずれも好ましくない。

以上の培養処理が終ったならば、酵母菌体と培養液を分離させ培養の進行を止める。培養物はろ過、或いは遠心分離などの固液分離手段によって培養液を分取し、酵母菌体と分離する。又、培養した酵母菌は、菌体中の抗酸化性物質を抽出するために、水と有機溶媒の混液で抽出する。このとき用いる有機溶媒は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて低温下から加温下で抽出することができる。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。そのうち、水、エチルアルコール、１、３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適に示される。また、酵母菌体の細胞壁を分解させるβ-グルカナーゼなどの酵素を作用させる方法や、酸、アルカリによる加水分解により、菌体内成分を抽出する方法も可能である。これらの抽出方法の中でも、５０％エタノール水混液は、極性の低い成分から極性の高い成分まで容易に抽出出来るので、最適である。

本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養後の菌体抽出液を配合してなる化粧料としては、例えば乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、洗顔料などの基礎化粧料、口紅、ファンデーション、リキッドファンデーション、メイクアッププレスドパウダー、おしろい、アイシャドーなどのメイクアップ化粧料、洗顔料、ボディーシャンプー、石けんなどの清浄用化粧料、さらには浴剤等が挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。

本発明の化粧料中に於けるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ の培養後の菌体抽出液の配合量は、菌体抽出液の固形分として、基礎化粧料の場合は、一般に０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜１質量％の範囲、メイクアップ化粧料の場合は、一般に０．００１〜５質量％、好ましくは０．０１〜０．５質量％の範囲、清浄用化粧料の場合は、一般に０．００１〜５質量％、好ましくは０．０１〜０．５質量％の範囲である。

本発明の化粧料には、上記の必須成分の他に、通常化粧料に用いられる配合成分、例えば油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。

ここで、油性成分としては、例えばオリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、植物由来スクワランなどの植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油などの動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリンなどのロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワランなどの炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸などの脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）などの合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。

界面活性剤としては，例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩などのアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪酸アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩などのカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタインなどの両性界面活性剤等を使用することができる。

保湿剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類、マルチトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、グルコース等の糖類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸菌発酵米、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体など）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、加水分解シルク蛋白質、ＮＭＦ関連物質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、フィトステロール、大豆リン脂質、イソステアリン酸コレステリル、海藻抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体等が挙げられる。

増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン、ファーセララン等の褐藻、緑藻或いは紅藻由来成分、ビャッキュウ抽出物、ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体等の多糖類、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム等のガム類、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリグルタミン酸及びその誘導体、グルコシルトレハロースと加水分解水添デンプンを主体とする糖化合物等が挙げられる。

防腐・殺菌剤としては、例えば尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャーマル（イミダゾデイニールウレア）、１，２−ペンタンジオール、ウドなどのタラノキ属植物の抽出物、各種精油類、樹皮乾留物、プロポリスエキス等がある。

粉体成分としては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、６−又は１２−ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー等がある。

紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。

本願発明以外の抗酸化剤としては、例えばスーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、カタラーゼなどの生体内活性酸素分解酵素、ビタミンＥ、ビタミンＤなどのビタミン類及びその誘導体、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ユビデカキノン（ユビキノン）、ルチン、ルチングルコシド、γ−オリザノール等がある。

さらに必要ならば、本発明で用いる発酵物の作用効果及び特長を損なわない範囲で、他の活性成分（美白剤、皮膚老化防止・肌荒れ改善剤、抗炎症剤等）を配合してもよく、かかるものとしては、例えば美白剤であれば、トラネキサム酸及びその誘導体、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン誘導体、エラグ酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、胎盤抽出物、システイン、ソウハクヒ抽出物、ユキノシタ抽出物、ハマメリス抽出物、イタドリ抽出物、甘草抽出物、ゲンノショウコ抽出物、ユキノシタ抽出物、ナツメ抽出物、シャクヤク抽出物、トウキ抽出物、モモ抽出物、緑藻類、紅藻類又は褐藻類の海藻の抽出物、リノール酸及びその誘導体もしくは加工物（例えばリノール酸メントールエステルなど）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体等が、皮膚老化防止・肌荒れ改善成分であれば、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、セラミドなどの細胞間脂質、胎盤抽出物、ニコチン酸及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ前駆体、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、アラントイン、α−ヒドロキシ酸類、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、コエンザイムＱ−１０、アデノシン、α−リポ酸、ピコリン、カルニチン及びその誘導体、ゲンチアナエキス、甘草エキス、ハトムギエキス、カミツレエキス、ニンジンエキス、アロエエキスなどの生薬抽出エキス、米発酵エキス、緑藻類、紅藻類又は褐藻類の海藻の抽出物、ソウハクヒエキス、ブナ抽出物、キダチアロエ抽出物、マンネンロウ抽出物、イチョウ抽出物、スギナ抽出物、ベニバナ抽出物、オタネニンジン抽出物、セイヨウニワトコ抽出物、ハゴロモグサ抽出物、レンゲ抽出物、マンゴー抽出物、卵殻膜抽出タンパク質、デオキシリボ核酸カリウム塩、紫蘭根抽出物、ムラサキシキブ抽出物、イネ抽出物等が、又抗炎症成分であれば、例えばグアイアズレンスルホン酸ナトリウム、グアイアズレンスルホン酸エチルなどのアズレン誘導体、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸ステアリルなどのグリチルリチン酸誘導体、アラントイン、カンゾウ抽出物、クジン抽出物、シャクヤク抽出物、ボタンピ抽出物、レンギョウ抽出物、リュウタン抽出物、トウキンセンカ抽出物、パセリ抽出物、オトギリソウ抽出物等が挙げられる。

次に、実施例として、ＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）を用いたラジカル消去活性の測定による、本発明品の効果を具体的に説明する。紫外線が皮膚に照射されると、皮膚内において活性酸素ラジカルが生成し、この活性酸素ラジカルにより皮膚に炎症や傷害をもたらすことが知られている。ＤＰＰＨラジカル消去試験は、紫外線による皮膚内で生じる活性酸素ラジカル消去を想定した試験である。ＤＰＰＨはそれ自体が安定なラジカルであり、ラジカル消去物質すなわち、抗酸化物質が存在すると安定な物質に変化する。ＤＰＰＨラジカルが消去されると溶液の紫色が次第に退色することから、この吸光の変化を吸光光度計で測定することによって化合物のもつ抗酸化力を測定する。具体的には、あらかじめエタノールに溶解しておいたＤＰＰＨを、被験液に加えて撹拌し、室温で一定時間放置した後、５４０ｎｍの吸光度を測定し対照群に対して減少した吸光度をＤＰＰＨラジカル消去活性とする。また、表皮細胞の紫外線防御効果は、ヒト表皮細胞Ｈａｃａｔ細胞を用いて試験を行った。処方例（化粧料の実施例）及び試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下に於いて、部はすべて質量部を、又％はすべて質量％を意味する。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの採取方法
市販されているパン酵母（日清スパーカメリア・ドライイースト：日清フーズ（株））を購入し、１２０℃で１５分間滅菌したＹＭ培地１００ｍｌを添加した三角フラスコに０．１ｇ懸濁し、２８℃、１５０ｒｐｍで３日間回転培養を行った。懸濁液を１白金耳取り、ＹＭ寒天培地上で引き伸ばして単独コロニーを得、これを以下の実験に使用した。なお、ＹＭ培地の組成はペプトン５g/L、酵母エキス３g/L、麦芽エキス３g/L、グルコース１０g/Lであり、ＹＭ寒天培地はＹＭ培地に寒天２０g/Lを添加し、加熱溶解して作成した。

黒米、赤米、白米抽出液の調製方法
岩手県産朝紫の黒米５０ｇに精製水１５０ｇを加え、８０℃で０．５時間加熱抽出した。抽出物は遠心分離器を行って上澄み液を取り、黒米抽出液とした。同じく赤米は（株）プロ農夢花巻より販売された品種を用い、黒米と同じように処理して抽出液を得た。さらに、白米は魚沼産コシヒカリを用い、同じ処理を行って抽出液を得た。

酵母の培養と菌体培養液の調製方法
培地はＹＮＢ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ） ｗｉｔｈ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ 合成培地にグルコースを２．０％添加した。培地５０ｍｌに前記黒米、赤米、白米抽出液の調製方法で調製した抽出液５ｍｌを加え、１２０℃、１５分間オートクレーブで滅菌処理を行った。培地を冷却後、１白金耳の酵母菌を植え付け、２８℃、１５０ｒｐｍ、で４日間培養を行った。培養後、２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、菌体と培養液を分離した。分離した菌体に５０％エタノール水溶液３ｍｌを加え、室温で１昼夜放置した。その後３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を取り菌体抽出液とした。
ＹＮＢ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ） ｗｉｔｈ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ 合成培地の組成は、硫酸アンモニウム５，０００、リン酸二水素カリウム１，０００、硫酸マグネシウム５００、塩化ナトリウム１００、塩化カルシウム１００、ビオチン０．００２、パントテン酸カルシウム０．４、葉酸０．００２、イノシトール２．０、ナイアシン０．４、パラアミノ安息香酸０．２、塩酸ピリドキシン０．４、リボフラビン０．２、塩酸チアミン０．４、ホウ酸０．５、硫酸銅０．０４、ヨウ化カリウム０．１、塩化第二鉄０．２、硫酸マンガン０．４、モリブデン酸ナトリウム０．２、硫酸亜鉛０．４（単位は全てｍｇ/L）からなる。

ＤＰＰＨ試験
ＤＰＰＨ溶液の調製
（Ａ）ＭＥＳ（２-（N-モルホリノ)エタンスルホン酸）５．５２ｇを水１００ｍｌに溶かし、１Ｎ−ＮａＯＨでＰＨ６．１に調製する。
（Ｂ）ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニルー２−ピクリルヒドラジル）１５．７ｍｇをエタノール１００ｍｌに溶解する。
（Ｃ）精製水
ＤＰＰＨ溶液は（Ａ）：（Ｂ）：（Ｃ）＝１：４：３容量の割合で混合し調製する。
（Ｄ）Ｔｒｏｌｏｘ溶液の調製
Ｔｒｏｌｏｘ
２５ｍｇをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１０ｍｌに溶解し、１０ｍＭ溶液を作成した。
（Ｅ）ＤＰＰＨ試験
測定は試験溶液１０μｌを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌ中に加え、次いでＤＰＰＨ溶液 １９０μｌを迅速に加え混合する。１０分後、各ｗｅｌｌの吸光度を５４０ｎｍで測定する。試験溶液のＴｒｏｌｏｘ当量は、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、１.０ｍＭ、３．０ｍＭ、５．０ｍＭ、１０ｍＭのＴｒｏｌｏｘ溶液１０μｌをとり、ＤＤＰＨ溶液１９０μｌを加え混合し、10分後の５４０ｎｍの吸光度を測定し、Ｔｒｏｌｏｘ濃度と５４０ｎｍの吸光度値の検量線を作成する。試験溶液の５４０ｎｍの吸光度値から、検量線によりＴｒｏｌｏｘ当量を算出した。標準物質として使用するＴｒｏｌｏｘは、トコフェロールと類似した構造を有する物質である。Ｔｒｏｌｏｘを１とした場合、α-、γ-、δ-トコフェロールは、それぞれ０．５０、０．７４、１．３６を示すといわれております。

表−１に各種パン酵母培養物のＤＰＰＨラジカル消去試験の結果を示した。
表−１には黒米抽出液、赤米抽出液のほかに白米抽出液を培地に添加して培養した場合の菌体抽出液の結果も示した。表−１の結果より、黒米抽出液を１０％添加した培養前の培地のＤＰＰＨ消去活性が０．５４２ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量を示した。０．５４２ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量は、この培養液がＴｒｏｌｏｘ ０．５４２ｍＭのＤＰＰＨ消去活性の強さを示すことを示しており、この値が高いほど抗酸化活性が高いことを示すものである。このＤＰＰＨ消去活性が培養後では、培養液で０．５６１ｍＭ、菌体抽出液で９．５６ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量を示した。一方、黒米抽出液を添加しないＹＮＢ培地のみでパン酵母を培養した培養液および菌体抽出液のＤＰＰＨ消去活性は０．１５３ｍＭ、−０．０７ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量であり、明らかに黒米抽出液を添加して培養した培養菌体抽出液の抗酸化活性が高くなったことが分かる。

同じく、赤米抽出液を１０％添加して培養した結果、培養前の培地のＤＰＰＨ消去活性が０．２１ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量を示したのに対し、培養後では培養液、菌体抽出液のＤＰＰＨ消去活性がそれぞれ、０．５６ｍＭ、７．５４ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量を示し、明らかに赤米抽出液を添加して培養した培養菌体抽出液の抗酸化活性が高くなったことがわかる。

一方、白米抽出液を培地に１０％添加して培養した場合は、培養前の培地のＤＰＰＨ消去活性が０．０１ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量を示したのに対し、培養後では培養液のＤＰＰＨ消去活性が０．０７ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量を示し、大きなＤＰＰＨ消去活性は認められなかった。また、菌体抽出液のＤＰＰＨ消去活性は白米抽出液の１０％添加では、−０．０３ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ当量となり、黒米抽出液、赤米抽出液の場合と比較して著しく低い値を示していた。
尚、黒米、赤米、白米をエタノール、エタノール水混液、１，３-ブチレングリコール、1，３−ブチレングリコール水混液等で抽出した抽出液を培地に添加した場合においても、同様の傾向が確認された。
また、黒米抽出液と赤米抽出液の両方を加えた培地で培養した場合にも、同様に高い効果が確認された。

紫外線照射による細胞増殖試験
〔細胞の調製〕
ヒト表皮細胞であるＨａｃａｔ細胞を５％ＦＢＳを添加したＤ−ＭＥＭ培地に分散し２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０^４／ｗｅｌｌになるよう細胞を播種し１日間、３７℃で培養を行ない５０％程度のコンフルーエント状態にした。翌日、各菌体抽出液を細胞培養液５００μｌに対して２５μｌ添加し２時間、３７℃にてインキュベートを行った。その後、培地を捨て、ＰＢＳ（−）溶液で細胞を洗浄した。洗浄した細胞に１５ｍＪ／ｃｍ２量のＵＶ−Ｂを照射した後、５％ＦＢＳを添加したＤ−ＭＥＭ培地５００μｌを添加して、２日間培養した。培養終了後、培養液を捨てＰＢＳ（−）で洗浄後、１０％中性ホルマリン溶液を３０分間添加し細胞を固定した。１０％中性ホルマリン溶液を除去し、精製水で細胞を洗浄後、０．０５％−ナフトールブルーブラック溶液（９％酢酸、０．１Ｍ酢酸ナトリウム）で３０分間染色した。染色後、細胞を精製水で洗浄し、０．０５Ｎ−ＮａＯＨ溶液５００μｌでナフトールブルーブラック色素を抽出し、５９５ｎｍの吸光度を測定することによって各ｗｅｌｌ中の細胞数の比較を行った。なお、細胞数の比較はコントロール区の吸光度値を１００とした場合の割合を求めて算出した。

表−２に黒米、赤米、白米抽出液を添加して培養した酵母菌体抽出液の紫外線照射後の細胞増殖試験の結果を示した。表中の値はＵＶ−Ｂ非照射群の細胞増殖度を１００とした場合のＵＶ−Ｂ照射群の細胞増殖度を示した。
各種酵母菌体抽出液を添加しなかった群、すなわち５０％エタノール水溶液添加区の細胞増殖度は、非照射群の５６％の増殖度を示した。これはＵＶ−Ｂ照射により細胞増殖が約半分に抑制されたことを示している。一方、黒米抽出液を１０％培地に添加して培養した酵母菌体抽出液をＵＶ−Ｂ照射前に添加しておいた群では、細胞増殖度が９２％を示しており、細胞をＵＶ−Ｂ傷害から防いでいることが明らかであった。同じく、赤米抽出液を添加して培養した酵母菌体抽出液をＵＶ−Ｂ照射前に添加した群では、細胞増殖度が８８％を示し、細胞をＵＶ−Ｂ傷害から防いでいた。これに対して白米抽出液を添加して培養した酵母菌体抽出液添加群およびＹＮＢ培地のみで培養した酵母菌体抽出液添加群では、細胞増殖がそれぞれ５８％、５４％となり、ＵＶ−Ｂ傷害による細胞死を抑制できないことが示された。
尚、黒米、赤米、白米をエタノール、エタノール水混液、１，３-ブチレングリコール、1，３−ブチレングリコール水混液等で抽出した抽出液を培地に添加した場合においても、同様の傾向が確認された。
また、黒米抽出液と赤米抽出液の両方を加えた培地で培養した場合にも、同様に高い効果が確認された。

次に、本発明の培養処理物を配合した処方例を示すが、本発明はこれに限定されるものでない。
化粧料の処方例

（１）化粧用クリーム（質量％）
ａ）ミツロウ・・・２．０
ｂ）ステアリルアルコール・・・５．０
ｃ）ステアリン酸・・・８．０
ｄ）スクワラン・・・１０．０
ｅ）自己乳化型グリセリルモノステアレート・・・３．０
ｆ）ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｇ）黒米抽出液添加培養菌体抽出液・・・２．０
ｈ）１，３−ブチレングリコール・・・５．０
ｉ）水酸化カリウム・・・０．３
ｊ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｋ）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｆ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｈ）〜ｋ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｆ）に加えて乳化し、４０℃まで撹拌しながら冷却する。その後、ｇ）を加え、攪拌し均一に溶解する。

（２）乳液（質量％）
ａ）ミツロウ・・・０．５
ｂ）ワセリン・・・２．０
ｃ）スクワラン・・・８．０
ｄ）ソルビタンセスキオレエート・・・０．８
ｅ）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．２
ｆ）赤米抽出液添加培養菌体抽出液・・・５．０
ｇ）１，３− ブチレングリコール・・・７．０
ｈ）カルボキシビニルポリマー・・・０．２
ｉ）水酸化カリウム・・・０．１
ｊ）精製水・・・残部
ｋ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｌ）エタノール・・・７．０
製法
ａ）〜ｅ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｇ）〜ｋ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｅ）に加えて乳化し、５０℃まで撹拌しながら冷却する。５０℃でｆ）、ｌ）を添加し、４０℃まで攪拌、冷却する。

（３）化粧水（質量％）
ａ）黒米抽出液添加培養菌体抽出液・・・１０．０
ｂ）グリセリン・・・５．０
ｃ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｄ）エタノール・・・６．０
ｅ）香料・・・適量
ｆ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｇ）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｇ）までを混合し、均一に溶解する。

（４）洗顔料（質量％）
ａ）ステアリン酸・・・１２ ．０
ｂ）ミリスチン酸・・・１４ ．０
ｃ）ラウリン酸・・・５．０
ｄ）ホホバ油・・・３．０
ｅ）グリセリン・・・１０．０
ｆ）ソルビトール・・・１５．０
ｇ）１，３−ブチレングリコール・・・１０．０
ｈ）ＰＯＥ（２０）グリセロールモノステアリン酸・・・２．０
ｉ）水酸化カリウム・・・５．０
ｊ）水・・・残部
ｋ）キレート剤・・・適量
ｌ）香料・・・適量
ｍ）赤米抽出液添加培養菌体抽出液・・・１．０
製法
ａ）〜ｈ）までを加熱溶解し７０℃に保つ。ｊ）にｉ）を溶解後ａ）〜ｈ）に加えケン化する。その後ｋ）、ｌ）を入れ攪拌しながら冷却する。５０℃でｍ）を添加し、４０℃まで攪拌、冷却する。

（５）化粧水（質量％）
ａ）黒米抽出液添加培養菌体抽出液・・・１０．０
ｂ）赤米抽出液添加培養菌体抽出液・・・５．０
ｃ）グリセリン・・・５．０
ｄ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
e）エタノール・・・６．０
ｆ）香料・・・適量
ｇ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｈ）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｈ）までを混合し、均一に溶解する。

（６）パウダーファンデーション質量％）
a)酸化チタン・・・１３．０
b)セリサイト・・・２５．０
c)タルク・・・残部
d)ベンガラ・・・０．８
e)黄酸化鉄・・・２．５
f)黒酸化鉄・・・０．１
g)黒米抽出液添加培養後培養液・・・０．０５
h)スクワラン・・・１０．０
i)セスキオレイン酸ソルビタン・・・３．５
j)防腐剤・・・適量
製法
顔料ａ）〜ｆ）を混合し、粉砕機にかけて粉砕する。これを高速ブレンダーに移し、ｇ）〜ｊ）を混合する。これを粉砕機で処理し、圧縮成形する。

塗布によるヒトでの効果確認試験
本発明の化粧料の抗シワ改善効果につき、使用テストにより効果試験を行った。使用テストは、それぞれ３０〜６０才の１０名の女性をパネラーとし、毎日朝と夜の２回、１ケ月にわたり洗顔後に試験化粧料を顔面に塗布することにより行った。試験化粧料は、段落００５１に記載の化粧料を用いた。対照品としては上記の化粧料から、赤米抽出液添加培養菌体抽出液の変わりに表中の抽出液に置き換えたものを使用した。結果を表３に示す。なお、評価基準は下記の基準により評価した。
＜抗シワ効果評価基準＞
・有効‥‥‥‥肌のシワが改善された。
・やや有効‥‥肌のシワがやや改善された。
・無効‥‥‥‥かわらない。

表―３の結果から明らかなように、黒米および赤米抽出液を添加してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
で培養した培養菌体抽出液を配合した化粧料は皮膚のシワ改善効果に対し有効であった。
尚、黒米、赤米、白米をエタノール、エタノール水混液、１，３-ブチレングリコール、1，３−ブチレングリコール水混液等で抽出した抽出液を培地に添加した場合においても、同様の傾向が確認された。
また、黒米抽出液と赤米抽出液の両方を加えた培地で培養した場合にも、同様に高い効果が確認された。

以上詳述したごとく、本発明の化粧料は、シワ改善効果に優れているので紫外線や、外的環境から受ける肌の炎症などにより生じる光老化によるシワの改善に幅広く適用することができる。また、本発明の化粧料は安全性が高く、安心して使用することができる。

Claims (4)

1. 黒米抽出液、赤米抽出液から選ばれる1種以上の抽出液を配合した培地で培養したサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌体抽出液からなる抗酸化剤。
2. 黒米抽出液、赤米抽出液から選ばれる1種以上の抽出液を配合した培地で培養したサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌体抽出液からなる紫外線傷害抑制剤。
3. 請求項１または請求項２記載のいずれかの剤を配合したことを特徴とする化粧料。
4. 請求項１または請求項２記載のいずれかの剤を配合したことを特徴とする抗光老化化粧料。