KR101468029B1 - 흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 간 보호 및 간기능 개선제 - Google Patents
흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 간 보호 및 간기능 개선제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질에 관한 것으로 흑미 또는 흑미강을 배양·발효배지화 한 액상흑미배지에 담자균류균사(담자균류인 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사)를 접종하여 배양공정에 의해 생산된 배양물로부터 생물전환공정을 통해 간 보호 및 간기능 개선 효능을 획기적으로 향상시킨 생물전환산물을 생산하는 방법 및 생물전환산물은 간 보호 및 간기능 개선 효능을 가지는 유효성분으로 고분자성 다당체를 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 생물전환공정은 효소처리에 의한 생물전환공정 및 미생물발효에 의한 생물전환공정임을 특징으로 하며, 효소처리는 세포벽 구성성분을 분해할 수 있는 섬유소분해효소에 의한 것이며, 미생물발효는 섬유소분해효소를 생성할 수 있는 미생물에 의한 것임을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질에 관한 것으로 흑미 또는 흑미강을 배양·발효배지화 한 액상흑미배지에 담자균류균사(담자균류인 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사)를 접종하여 배양공정에 의해 생산된 배양물로부터 생물전환공정을 통해 간 보호 및 간기능 개선 효능을 획기적으로 향상시킨 생물전환산물을 생산하는 방법 및 생물전환산물은 간 보호 및 간기능 개선 효능을 가지는 유효성분으로 고분자성 다당체를 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 생물전환공정은 효소처리에 의한 생물전환공정 및 미생물발효에 의한 생물전환공정임을 특징으로 하며, 효소처리는 세포벽 구성성분을 분해할 수 있는 섬유소분해효소에 의한 것이며, 미생물발효는 섬유소분해효소를 생성할 수 있는 미생물에 의한 것임을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 인체의 장기 중 가장 중요하다고 볼 수 있는 간은 간장이라고도 하며 그 기능은 간세포 속에 존재하는 많은 효소의 촉매작용에 의해 탄수화물, 단백질, 지방 등의 물질대사가 중심이 되는 것으로서, 상기 간은 크게 4가지의 기능을 수행하는데 첫째는 분비배출 기능으로서, 빌리루빈, 콜레스테롤, 담즙(쓸개즙)산 등을 비롯하여, 나트륨, 염소, 칼슘 그 밖에 미네랄(무기질), 내인성(內因性) 에스트로겐이나 안드로겐 등으로 이루어진 쓸개즙을 만들어 그것을 담모세관, 세담관(細膽管)을 거쳐 간 밖으로 배출시키는 역할을 한다.
두번째 기능은 알부민 등의 단백질 합성과 함께 글리코겐, 지질, 핵산, 비타민류 등의 생합성 및 그 분해를 하고, 세번째 기능은 장에서 흡수된 암모니아를 요소로 바꿔주는 기능을 하고, 네번째는 피브리노겐, 프로트롬빈, 헤파린 등을 만들며, 적혈구의 파괴와 조혈 및 혈액응고에 관한 기능을 한다.
상기와 같은 간의 기능을 향상시키고 간을 간 독성물질로부터 보호하기 위해 많은 간 보호 및 간기능 개선 제품이 개발되어 사용되고 있다. 일반적으로 지금까지 알려진 제품들 중 간 손상 치료를 목적으로 사용되고 있는 의약품으로는 생약성분의 간질환 치료제인 실리마린(silymarin)제제와 BDD(biphenyl dimethyl dicarboxylate)제제는 매우 강력한 항산화제로 산화적 스트레스를 막아줌으로써 간세포 파괴를 막아주고, 세포막의 변화를 안정화시켜 유해물질로부터 간장을 보호하고 손상된 간세포를 정상화시키는 효과가 인정되어 초기 간 손상이나 초기 간염 치료에 사용되고 있다. 또한 이와 함께 바이러스성 간염을 대상으로 한 항바이러스제제가 치료에 사용되고 있다. 건강기능식품 소재의 개발에 있어서는 간기능 개선 효능이 검증된 한약재의 단순추출물 위주로 제품 개발이 이루어져 왔으며, 대표적 소재로는 헛개나무과병추출물, 표고버섯균사체추출물, 밀크씨슬추출물(실리마린제제), 복분자추출물, 및 유산균발효다시마추출물 등이 개별인정형 건강기능식품 소재로 개발되어 사용되고 있다. 또한 천연물 발효과 관련한 간기능 개선 소재로 일본에서 개발된 쌀눈발효추출물과 미배아·대두발효추출물이 있으며 이들은 쌀눈(미배아) 및 대두를 함유하는 배지에 호알카리성 미생물인 낫또균을 접종하여 알카리조건에서 발효시킨 소재로 숙취해소 소재로 활용되고 있다. 그러나 이와 같은 많은 종류의 간기능 개선 및 숙취해소 등에 관한 조성물이 상품화 되어 판매되고 있으나, 큰 실효를 거두지 못하고 있는 실정이다.
흑미(Oryza sativa L.)는 안토시아닌계(anthocyanins) 및 폴리페놀계(polyphenols) 화합물을 풍부하게 함유하고 있는 쌀로서, 흑미는 영양성분으로 전분, 단백질, 지방산 등을 함유하고 있으며 앞서 설명한 안토시아닌 및 폴리페놀계 화합물 외에도 섬유소, 인체에 필수적인 무기질, 비타민 B군, 비타민 C, 니아신(niacin), 카로틴(carotene) 등이 함유되어 있어 식량의 개념보다도 건강식품의 개념으로 백미에 소량씩 혼합하여 밥으로 많이 섭취하고 있다. 흑미는 본초강목에 의하면 위를 보하고 신장의 기능을 강하게 하며 비장과 간을 활성화시키고 눈을 밝게 하고 혈을 잘 통하게 한다고 했으며, 매일 먹으면 인체의 종합조절기능을 개선하고 면역기능을 강화함으로써 질병을 사전예방하고 노약자나 임산부의 빈혈치료에 좋으며 피부의 노화방지나 여성의 피부미용에 효과가 있고 모발을 검게 만든다고 하였다. 흑미의 약용효과로는 안토시아닌계 색소성분에 의한 항산화 효과, 항암 효과, 항알러지 효과, 항염증 효과, 항고지혈증 효과가 알려져, 최근에는 가공하여 기능성 식품으로도 개발되고 있다. 그러나 흑미의 안토시아닌계 화합물은 가열 처리를 하거나 발효시킬 경우 안토시아닌계의 성분이 파괴되어 흑미는 좋은 효능이 기대 됨에도 불구하고 안토시아닌계 화합물의 불안정성 때문에 저온에서 단순 추출한 가공품들을 제외하고는 적극적으로 개발되고 있지 못하는 실정이다.
현재 전세계 만성 간질환 환자 수는 약 6~8억 명에 이르고 우리나라에선 간질환이 40대 사망원인 순위에서 1위일 정도로 심각하다. 그러나 현재 시판되고 있는 의약품으로는 간섬유화나 간경화 치료 효과가 낮아 국내외에서 개발에 부단히 노력하고 있으나 아직까지 미흡한 실정이다.
간 보호 및 간기능 개선 효능이 탁월하여 손상된 간세포의 부활, 간기능 증진 효과와 함께 간 쿠퍼세포 활성화 및 면역기능을 증진시켜 간질환 예방은 물론 간기능을 개선하여 간 보호와 함께 초기 간질환을 효과적으로 치료할 수 있는 소재 개발이 필요하고도 시급한 실정이다.
따라서, 본 발명의 목적은 효능이 우수한 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 의약품 및 기능성 식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 간 보호 및 간기능 개선 천연발효소재 개발에 있어서 ①발효과정 중 진행되는 천연식물성분의 생물학적 전환(bioconversion)에 의해 획기적으로 향상된 간 보호 및 간기능 개선 효능을 가지는 물질의 생성을 유도시키고, 또한 ②발효미생물 자체가 가지고 있는 간 보호 및 간기능 개선 효능도 함께 향상시킴으로써 간 보호 및 간기능 개선 효능을 극대화하여, 획기적으로 향상된 간 보호 및 간기능 개선 효과를 나타내는 간 보호 및 간기능 개선 소재 개발에 노력한 결과, 약용버섯 균사체 및 흑미의 단순추출에 비해 본 발명자들의 고유의 기술인 세포벽 생물전환(Bioconversion)기술을 접목시켜서 약용버섯 균사체의 간 보호 및 간기능 개선 효능은 물론 흑미의 경우 안토시아닌 성분은 파괴되더라도 흑미의 간 보호 및 간기능 개선 효능을 획기적으로 향상시킬 수 있음을 지속적인 연구의 결과 확인하게 되었다.
이에 본 발명자들은 흑미를 배양·발효배지로 하여 생산된 약용 및 식용 가능한 담자균류균사(상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사) 배양물에 대한 세포벽 생물전환공정을 통해 배양·발효배지 성분인 흑미와 배양공정을 통해 생산된 배양산물인 약용버섯 균사체의 세포벽 구조체인 ‘β-Glycan 구조의 복합다당체로 구성된 불용성 결합체'를 ‘β-Glycan 구조의 수용성 다당체'로 생물전환(Bioconversion)시켜 간 보호 및 간기능 개선 효능을 획기적으로 향상시킨 생물전환산물(Bioconversion Product)을 얻을 수 있었다.
암모니아는 인체 혈액 속 60mM 이상인 상태가 되면 암모니아 중독 상태가 되어, 무기력, 떨림, 언어 장애, 시각 장애 등을 야기하고 심하면 사망에 이르기도 한다. 간 독성물질인 암모니아가 다량 존재하게 되면 요소회로의 엄격한 통제를 받게 되는데 간의 해독작용이 떨어지면 간부전(liver failure) 상태에 놓이게 된다. 간이 정상적인 상태일 때 혈액 내 암모니아는 간의 요소합성 또는 근육의 글루타민 합성(glutamine systhesis)에 의해 해독될 수 있어 암모니아의 수준 측정으로 간기능의 개선 효과를 측정해 볼 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 간 보호 및 간기능 개선 효능의 고분자성 다당체인 생물전환산물을 랫트의 간으로부터 분리한 간세포(hepatocyte cell)에 암모니아(NH4Cl)로 간세포 손상을 유도하고 생체 외(in vitro) 조건에서 처리하였을 때 간세포 생존율이 높게 향상되는 것을 확인하였다(도면3). 따라서 암모니아로 인한 간 손상으로 부터 간세포를 보호하고 간의 암모니아 분해 능력을 상승시켜 암모니아 감소에 효과적으로 영향을 미치는 것으로 확인하였다.
또한 상기 생물전환산물을 암모니아로 손상된 간세포에 처리한 후 간세포에서 해독작용을 수행하는 활성효소중 하나인 글루타티온 S-전달효소(GST:Glutathion S-transferase)의 활성을 측정하였다. 글루타티온 S-전달효소는 병원성물질, 발암성 물질, 독성물질 등의 대사산물 그리고 내인성 독소들 중에서 친전자성 물질 등에 환원형 글루타티온(glutathione)을 결합시켜 글루타티온 티오에스터(glutathione thioester (R-S-G))를 형성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 글루타티온 S-전달효소 활성 측정 결과 암모니아를 처리한 군에서는 해독작용을 위해 글루타티온 S-전달효소의 활성이 증가하였고, 생물전환산물을 함께 처리한 군에서는 글루타티온 S-전달효소의 활성이 농도에 비례하여 감소하였다. 따라서 상기 생물전환산물이 간독성의 감소에 효과적으로 영향을 미치는 것을 확인하였다.
항산화효소인 과산화물제거효소(SOD:superoxide dismutase)는 주로 간, 부신, 신장 등의 조직에 분포되어 있으며, 항산화효소 시스템에서 가장 중요한 효소 중의 하나로 유산소운동 과정의 첫 번째 생성물인 슈퍼옥사이드 라티칼(superoxide radical)을 과산화수소(H2O2)로 전환시켜 주는 역할을 담당한다. 항산화 활성 평가를 위한 과산화물제거효소의 활성을 측정한 결과 암모니아를 처리한 군에서는 감소하였으나, 생물전환산물을 함께 처리한 군에서는 회복되는 경향을 확인하였다. 따라서 생물전환산물이 간의 산화적 손상을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
또한 생체 내(in vivo) 실험에서는 소염제인 아세트아미노펜으로 간 손상을 유발한 흰쥐에 생물전환산물을 투여한 후 간기능 검사 수치 중 아스파테이트 아미노전이효소(AST:Aspartate aminotransferase or GOT:Glutamic oxalacetic transferase), 알라닌 아미노전이효소(ALT:Alanine aminotransferase or GPT:Glutamic pyruvate transferase) 및 젖산탈수소효소(LDH:Lactate dyhydrogenase)을 측정하였다. 아스파테이트 아미노전이효소 및 알라닌 아미노전이효소는 아미노산과 케토산 사이에 아미노기를 전이시키는 반응을 촉매하는 효소로서 여러 종류의 간 질환에 걸리면, 파괴된 간세포로부터 유출되어 혈청의 아스파테이트 아미노전이효소 및 알라닌 아미노전이효소의 수치가 상승한다. 아스파테이트 아미노전이효소 및 알라닌 아미노전이효소 수치가 현저히 상승할 때는 급성간염일 경우로 알라닌 아미노전이효소 수치가 아스파테이트 아미노전이효소 수치보다 더 많이 상승하며, 반면에 지방간이나 만성간염, 간경변, 간암 등에서는 아스파테이트 아미노전이효소 수치가 알라닌 아미노전이효소 수치보다 더 많이 상승한다. 또 알라닌 아미노전이효소는 간세포 내에 많이 분포하는 것에 비해 아스파테이트 아미노전이효소는 심근, 골격근, 적혈구 등에 많이 존재한다. 따라서 알라닌 아미노전이효소 수치는 변하지 않고 아스파테이트 아미노전이효소 수치만 높게 나타날 때는 심근 경색을 비롯한 근질환 등을 의심할 수 있다. 생체 내(in vivo) 실험에서 소염제인 아세트아미노펜으로 간 손상을 유발한 흰쥐에 생물전환산물을 투여한 후 아스파테이트 아미노전이효소 , 알라닌 아미노전이효소 및 젖산탈수소효소 수치를 측정한 결과 간 손상 유발에 의해 상승한 수치가 생물전환산물에 의해 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 독성물질인 아세트아미노펜으로 유발된 간 손상을 회복시키는 효능을 확인할 수 있었다.
일반적으로 알코올이 다른 칼로리를 대체하게 되면 체중이 감소되지만 알코올이 칼로리를 더해 주게 되는 경우 체중 증가를 일으킬 수 있다. 한편 알코올 섭취는 물질대사 및 에너지 대사에 영향을 주어 간을 비롯한 소화관 점막 그리고 타 기관 및 조직에 손상을 초래하며, 이차적인 영양 장애로 인하여 영양소의 소화, 흡수장애, 이용률 저하, 영양소 배설 등을 증가시킨다. 본 발명에서는 알코올로 간 손상을 유발한 흰쥐에 생물전환산물을 투여한 후 간을 적출하여 헤미록실린과 에오신 염색법(Hematoxylin and Eosin staining;H&E)을 이용하여 간 조직을 관찰하였다. 실험결과 알코올 투여군에서는 간세포의 괴사와 함께 염증, 침윤과 함게 문맥 주위에 지방변성에 의한 lipid vacuoles가 산재되어 있음이 관찰된 반면 생물전환산물을 함께 처리한 군에서는 모두 간세포의 파괴가 적게 관찰되었고 비교적 세포 구조도 잘 유지하고 있으며, 지방 변성도 미약하게 관찰되어 간 보호 효과를 확인할 수 있었다.
지질 과산화(Lipid peroxidation)반응은 세포막의 불포화 지방산과 일련의 연쇄반응을 통하여 지질 과산화 유발을 촉진하고, 지질 과산화의 최종산물인 말론디알데히드(malondialdehyde)의 농도가 증가되어 세포에 산화적 손상이 일어나게 되면 생리적 기능 저하에 의해 간 질환 등의 여러 가지 질병을 초래하여 노화나 유전적 장애의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 이러한 지질 과산화반응은 여러 가지 독성 화합물이나 약물 등에 의한 간 손상 발생의 가장 중요한 과정으로서 세포내 유리라디칼 생성의 증가 및 항산화적 방어력의 감소로 인해 야기되는 산화적 스트레스의 증가에 기인한다고 하였다. 또한 간 조직은 체내로 흡수된 모든 영양성분과 알코올, 약물 등을 포함하는 외인성 물질을 분해시켜 독성을 경감시키는 주요 작용을 하기 때문에 이 과정에서 다양한 독성물질에 노출될 기회가 많아 체내에서 이들의 주된 축적 부위로 알려져 있으며, 이 때문에 항산화계가 저하되어 지질 과산화물을 생성하는데 좋은 환경을 제공함으로서 조직의 손상을 초래할 수가 있다고 한다. 이러한 환경에 노출되면 스스로를 보호하기 위한 방어체계가 구축되는데 방어기전은 항산화효소뿐만 아니라 글루타티온(glutathione), 토코페롤(tocopherol) 등의 항산화물질이며, 이중 글루타티온(glutathione)은 동물조직 중에서 비단백성 티올(nonprotein thiol)의 대부분을 차지하며 활성산소의 유리기 포촉제(scavenger)로서 과산화지질을 대사시키는 중요한 기질로 세포내 항산화제 중에서 가장 중요한 역할을 담당하고 있다. 이러한 지질 과산화는 만성 담즙분비정체와 함께 사람과 rat의 간 조직과 혈장에서 증가된다고 보고하고 있으며, 지방간은 과음, 비만, 당뇨 등의 원인으로 지질결합단백합성의 저하와 지방 이동의 저해 그리고 과산화지질이 축적되어 생기며, 지방간, 간염, 간 섬유화를 거쳐 간 경변으로 진행된다는 보고가 있다. 본 발명의 생물전환산물의 지방 과산화 수치변화 측정 결과를 살펴보면, 간 조직학적 변화 관찰에서는 지방 변성이 관찰되지 않은 양성대조군(헛개나무과병추출물 투여군)에서 오히려 알코올 투여군 대비 지방 과산화 수치의 감소가 나타나지 않았다. 알코올 투여군에서는 지방 과산화 수치가 유의한 수준으로 상승한 반면 생물전환산물 투여군에서는 알코올 투여군에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 지방 과산화 수치가 현저히 감소한 것으로 관찰되어 생물전환산물의 간 보호 효과가 우수한 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 생물전환산물은 항산화력에 의해 간 보호 효과가 우수함을 알 수 있으며, 인체에 적용하였을 때 MDA 수치가 유효하게 감소하였다는 보고와 같은 결과를 알 수 있다.
또한 본 발명의 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질과 종래의 간 보호 및 간기능 개선 제품의 간기능 수치를 비교해 본 결과, 본 발명의 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질이 종래 제품에 비해 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 생리활성물질은 간 보호 및 간기능 개선 효과를 나타내는 조성물로서 제공될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 생리활성물질은 간 손상 및 간기능 저하로 유발되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 조성물로서 제공될 수 있다.
도 1은 배지 및 담자균류에 따른 균체 생산량을 나타낸 그래프
도 2는 여러 가지 당류와 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물의 다당체 분획분말에 대한 HPLC 분석 결과로서, 도 2a는 글루코스, 도 2b는 메시마캅셀550, 도 2C는 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물의 다당체분획분말에 대한 HPLC 분석 결과이다.
도 3은 세포 생존율 측정 결과를 나타낸 그래프
도 4는 글루타티온 S-전달효소(GST;glutathione s-transferase) 측정 결과를 나타낸 그래프
도 5는 과산화물제거효소(SOD;superoxide dismutase) 측정 결과를 나타낸 그래프
도 6은 알라닌 아미노전이효소(ALT:Alanine aminotransferase or
GPT:Glutamic pyruvate transferase) 활성 측정 결과를 나타낸 그래프
도 7은 아스파르테이트 아미노전이효소(AST:Aspartate aminotransferase or GOT:Glutamic oxalacetic transferase) 활성 측정 결과를 나타낸 그래프
도 8은 젖산탈수소효소(LDH:Lactate dyhydrogenase) 활성 측정 결과를 나타낸 그래프
도 9는 알코올 유발 간독성에 대한 간조직 관찰 결과를 나타낸 사진
도 10은 알코올 유발 간독성에 대한 간 지방 과산화 수치 측정 결과를 나타낸 그래프
도 11은 패혈증 유발 간의 육안 관찰 결과를 나타낸 사진
도 2는 여러 가지 당류와 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물의 다당체 분획분말에 대한 HPLC 분석 결과로서, 도 2a는 글루코스, 도 2b는 메시마캅셀550, 도 2C는 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물의 다당체분획분말에 대한 HPLC 분석 결과이다.
도 3은 세포 생존율 측정 결과를 나타낸 그래프
도 4는 글루타티온 S-전달효소(GST;glutathione s-transferase) 측정 결과를 나타낸 그래프
도 5는 과산화물제거효소(SOD;superoxide dismutase) 측정 결과를 나타낸 그래프
도 6은 알라닌 아미노전이효소(ALT:Alanine aminotransferase or
GPT:Glutamic pyruvate transferase) 활성 측정 결과를 나타낸 그래프
도 7은 아스파르테이트 아미노전이효소(AST:Aspartate aminotransferase or GOT:Glutamic oxalacetic transferase) 활성 측정 결과를 나타낸 그래프
도 8은 젖산탈수소효소(LDH:Lactate dyhydrogenase) 활성 측정 결과를 나타낸 그래프
도 9는 알코올 유발 간독성에 대한 간조직 관찰 결과를 나타낸 사진
도 10은 알코올 유발 간독성에 대한 간 지방 과산화 수치 측정 결과를 나타낸 그래프
도 11은 패혈증 유발 간의 육안 관찰 결과를 나타낸 사진
본 발명에서의 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 다음과 같다.
본 발명에 따른 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질의 제조방법은
(a) 흑미를 분말화한 흑미분말 또는 흑미의 도정과정에서 나오는 흑미강을 포함하는 액상배지에 전분분해효소 및 단백질분해효소를 첨가하여 반응시킴으로써 흑미를 배양·발효배지화 하는 단계 ;
(b) 상기 (a)단계의 흑미를 배양·발효배지화 한 액상흑미배지에 담자균류균사를 접종하고 배양하여 흑미의 생물전환과 함께 담자균류 균사체를 배양하는 단계 ;
(c) 상기 (b)단계에서 생산된 배양물에 대해 열수추출 후 섬유소분해효소를 첨가하여 2차 생물전환 반응을 시키는 단계 ;
(d) 상기 (b)단계에서 생산된 배양물에 대해 열수추출 후 섬유소분해효소를 생산하는 미생물 및 상기 미생물이 생산하는 섬유소분해효소를 포함하는 배양액을 첨가하여 2차 생물전환 반응을 시키는 단계 ;
(e) 상기 (c) 또는 (d)단계에서 생산된 최종 생물전환산물을 가열하여 효소 불활성화 및 살균과정을 거친 후 동결건조하여 최종적으로 생물전환산물의 분말을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 (e)단계의 생물전환산물 분말을 물에 녹여 불용성 잔사를 제거하고, 상등액을 동결건조시켜 수용성분말을 수득하거나 혹은 상등액에 에탄올을 첨가하여 침전을 유도함으로써 간 보호 및 간기능 개선 효능을 갖는 고분자성 다당체를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a)단계에서 흑미를 분말화한 흑미분말 또는 흑미의 도정과정에서 나오는 흑미강을 1~10%(w/v)를 포함하는 배지일 수 있다. 또한 상기배지에 대두분말 0.1~5%(w/v) 및 KH2PO4 0.1~0.5%(w/v)를 추가로 첨가할 수 있다. 상기 배지에 배양·발효배지화를 위해 첨가한 전분분해효소로는 아밀라제(Amylase)와 단백질분해효소로는 프로테아제(Protease) 등의 효소제(또는 복합효소제)를 적당량(각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 최적량) 첨가한다.
상기 (b)단계에서 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 이들 담자균류균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양받아 사용할 수 있다. 또한 상기(b)단계의 배양·발효배지에 담자균류균사를 접종하여 25~40℃ 및 pH4.5~7의 조건으로 1~10일간 배양할 수 있다. 이때 담자균류균사 배양에 있어서 담자균류균사 배양액의 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점까지 일정기간 배양을 진행하는 회분식배양을 수행할 수 있으며 또한 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 농축된 액상흑미배지를 첨가하여 일정기간 배양하고, 다시 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 농축된 액상흑미배지를 첨가하는 유가식 공정을 수회 반복수행하여 생산성을 향상시킬 수 있다.
상기 (b)단계에서 생산된 약용버섯 균사체의 세포벽 성분 및 흑미의 세포벽 성분은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴, 글루칸, 키틴, 만난 등의 다당체로 구성된 불용성 결합체로 구성되어 있으며, 상기 (c)단계에서 2차 생물전환공정을 위한 효소처리는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase) 등의 다양한 섬유소분해효소 효소제를 적당량(각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 최적량) 첨가하여 실시할 수 있다. 상기 섬유소분해효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제를 사용할 수 있으며, 즉 이에 한정적이지는 않으나 섬유소분해효소인 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물) 및 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물)을 사용할 수 있다.
상기 (d)단계에서 섬유소분해효소를 생산하는 미생물은 섬유소분해효소를 생산한다고 알려져 있는 통상적인 미생물 즉, 유산균, 바실러스균, 효모균, 아스퍼질러스속, 트리코더마 리제이 등의 미생물을 사용할 수 있다. 상기 미생물이 생산한 섬유소분해효소를 포함하는 미생물배양액을 첨가할 수 있다.
상기 (e)단계에서 효소 불활성화 및 살균과정은 90~121℃, 5~120분 수행할 수 있으며, 동결건조하여 생물전환산물의 분말을 수득한다.
상기 (f)단계에서 생물전환산물 분말을 10%(w/v)으로 물에 녹여 불용성 잔사를 제거하고, 상등액을 동결건조하여 수용성분말을 수득하거나 혹은 상등액에 2~10배의 에탄올을 첨가하여 침전을 유도할 수 있으며 이로부터 면역활성을 갖는 고분자성 다당체를 수득할 수 있다.
상기 방법에 따라 제조된 간 보호 및 간기능 개선 효능의 고분자성 다당체인 생물전환산물을 쥐의 간으로부터 분리한 간세포(hepatocyte cell)에 암모니아(NH4Cl)로 간세포 손상을 유도하고 생체 외(in vitro) 조건에서 처리하였을 때 간세포 생존율이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 상기 생물전환산물을 암모니아로 손상된 간세포에 처리한 후 간세포에서 해독작용을 수행하는 활성효소중 하나인 글루타티온 S-전달효소(GST : Glutathion S-transferase)의 활성 및 항산화 활성 평가를 위한 과산화물제거효소(SOD : superoxide dismutase)의 활성의 측정을 통해 간의 산화적 손상의 억제 효과를 확인할 수 있었다.
생체 내(in vivo) 조건에서 소염제인 아세트아미노펜으로 간 손상을 유발한 흰쥐에 생물전환산물을 투여한 후 간기능 검사 수치 중 아스파테이트 아미노전이효소(AST:Aspartate aminotransferase or GOT:Glutamic oxalacetic transferase), 알라닌 아미노전이효소(ALT:Alanine aminotransferase or GPT:Glutamic pyruvate transferase) 및 젖산탈수소효소(LDH:Lactate dyhydrogenase)을 측정하여 독성물질 유래 간 손상에 대한 회복효과를 확인할 수 있었다.
또한 알코올로 간 손상을 유발한 흰쥐에 생물전환산물을 투여한 후 간을 적출하여 헤미록실린과 에오신 염색법(Hematoxylin and Eosin staining;H&E)을 이용하여 간 조직을 관찰하고 간세포의 지질 과산화 수치를 측정함으로써 알코올로 유발된 간세포 괴사, 염증과 지방변성 등의 조직학적 간 손상 회복 효과 및 항산화력에 의한 간 보호 효과를 확인할 수 있었다.
<실시예1>
담자균류균사 배양을 위한 흑미의 배양·발효배지화 및 담자균류균사 배양
담자균류균사가 흑미 또는 흑미강의 전분, 단백질 등의 영양성분 이용이 용이하도록 하기 위하여 흑미를 분말화한 흑미분말 또는 흑미의 도정과정에서 나오는 흑미강 2%(w/v) [배지1] 또는 흑미강 2%(w/v), KH2PO4 0.1~0.5%(w/v) 및 대두분말 1%(w/v)을 첨가한[배지2] 액상배지에 전분분해효소로 아밀라아제(amylase) 및 단백질분해효소로 프로테아제(Protease)를 처리하여 60℃에서 1시간 반응시키고, 고온에서 30분간 멸균처리하여 흑미분말 또는 흑미강의 배양·발효배지화를 수행하였다.
상기 배양·발효배지에 담자균류균사로 상황버섯균사, 차가버섯균사, 표고버섯균사, 목이버섯균사, 눈꽃송이버섯균사 종균배양액을 10%(v/v) 접종하고 28~30℃에서 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 농축된 액상흑미배지를 첨가하는 유가식 공정으로 7~10일간 배양하여 생산된 균체량을 비교하였다. 결과를 도 1에 도시하였다.
<실시예2>
담자균류균사 배양물에 효소처리의 생물전환공정을 위한 효소제 및 효소처리
담자균류인 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 약용버섯 균사체 및 흑미의 세포벽 성분은 셀룰로오스, 헤미셀룰오로스, 펙틴, 글루칸, 키틴, 만난 등의 복합다당체로 구성되어 있다. 흑미 또는 흑미강을 배양·발효배지화한 액상흑미배지에 담자균류균사를 배양하고 배양공정에 의해 생산된 실시예 1의 배양물에 대한 2차 생물전환공정의 효소처리는 열수추출 후 섬유소분해효소 즉, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase) 등의 다양한 효소제를 적당량(각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 최적량)을 첨가하여 실시하였다. 효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제 즉, 섬유소분해효소인 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물), 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물)을 각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 추천 농도로 사용하였다.
<실시예3>
담자균류균사 배양물에 미생물발효의 생물전환공정을 위한 발효
<실시예1> 또는 <실시예2>의 배양물에 미생물발효에서 생산되는 다양한 효소 중 특히, 섬유소분해효소를 통한 생물전환공정을 실시하기 위해 섬유소분해효소를 생산한다고 알려져 있는 통상적인 미생물 즉, 유산균, 바실러스균, 효모균, 아스퍼질러스속, 트리코더마 리제이 등의 미생물에 대해 섬유소분해효소 생성을 확인하고 사용하였다. 미생물발효의 2차 생물전환공정은 <실시예1> 또는 <실시예2>의 배양물을 열수추출 한 후 상기 섬유소분해효소 생산 미생물을 배양한 배양액을 10%(v/v) 넣어 실시하였다.
<실시예4>
생물전환산물의 회수공정
상기 <실시예3>의 생물전환공정에 의해 생산된 생물전환산물은 90℃, 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거친 후 동결건조하여 분말화 하였다. 또한 상기 면역활성 효능을 가지는 생물전환산물 분말을 10배의 물에 녹여 10,000rpm, 30분간 원심분리하여 불용성 잔사를 제거하고, 상등액을 동결 건조하여 수용성분말로 수득하거나 혹은 상등액에 5배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 이상 침전을 유도하고 침전물을 동결건조하여 면역활성을 갖는 고분자성 다당체 분획의 분말을 수득하였다.
<실시예5>
본 발명의 방법에 따라 제조한 생리활성물질의 분석
상기<실시예4>에서 제조한 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물의 다당체분획분말을 겔크로마토그래피 컬럼(UltrahydrogelTM 1000, Waters, USA)을 이용하여 HPLC로 다당체분획을 분석하였다. 다당류의 분자량을 확인하기 위해 일반적으로 잘 알려진 다당류 중 하나인 전분(starch)을 사용하여 다당체의 머무름 시간(retention time)을 확인하였고, 단당류로는 통상적으로 잘 알려진 글루코스를 사용하여 단당류의 머무름 시간을 확인하였다. 또한 소화기암, 간암 및 환자 절제 수술 후, 화학요법과의 병용에 의한 면역기능 항진 등의 효과로 식품의약품안전청에서 허가된 전문의약품인 (주)한국신약의 [메시마캅셀550]을 구입하여 비교 분석하였다. [메시마캅셀550]은 세포독성 항암 치료를 보조하기 위한 면역기능 증진제로 현재 판매되고 있으며, 상황버섯 균사체 추출물(Phellinus linteus의 다당류)을 포함하는 항암면역활성이 있는 산성다당류(153kD)를 유효성분으로 가지는 것으로 알려져 있다. 분석 결과, 상기<실시예4>에서 제조한 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물의 다당체분획분말의 면역활성물질은 전분 및 [메시마캅셀550]의 다당류 피크의 머무름 시간과 유사한 시간대에서 검출되는 것을 확인할 수 있었다[도면 2].
상기 고분자성 다당체분획의 구성단당을 분석하였다. 실험방법은 다음과 같다. 본 실험의 시료의 추출 및 전처리방법으로는 중성당은 10 mg/ml의 농도로 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, 2M)을 이용하여 100℃에서 4시간 동안 가수분해 하였다. 분석은 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 이루어졌으며, 분석장비로는 한국기초과학지원연구원의 장비로 ICS-5000 with electrochemical detection (Dionex, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하였고, 컬럼은 CarboPac PA1 (4 × 250 ㎜, Dionex)에 CarboPac PA1 cartridge (4 × 50 ㎜)를 연결하여 분석하였다. 분석용매는 수산화나트륨(NaOH, 16 mM)을 사용하여 등용매조성으로 분석하였으며, 유속을 1 ml/min로 설정하고 10 μl의 시료를 주입하여 분석하였다. 상기 고분자성 다당체분획의 구성단당을 분석한 결과, 다당체분획의 구성단당은 글루코스(glucose) 및 갈락토스(galactose)가 주종을 이루고 그 외에 만노오스(mannose), 람노스(rhamnose), 아라비노스(arabinose), 프럭토스(fructose), 자일로스(xylose) 등이 포함되어 있는 것으로 나타났다(도 2).
<실시예6>
본 발명의 방법에 따라 제조한 생리활성물질의 생체 외(in vitro) 분석
[6-1] 랫트 간세포 분리
쥐 간세포 분리는 다음과 같은 방법을 사용하였다. 랫트로부터 간세포의 분리는 Seglen의 방법에 기초를 두고 변형된 방법을 실행하였는데 이는 원래(in situ) 상태에서 콜라게나아제(collagenase)로 간의 기질을 분해하여 2단계로 시행하였다. 중량이 180～200g의 Sprague-Dawley 랫트를 동물용 마취제인 0.1mg/kg 럼푼(Xylazine, 바이엘코리아㈜)과 0.58mg/kg 케타민(염산케타민, 염화벤젠제토늄 1ug/kg, 유한양행)을 주사하여 마취시키고 쥐의 복부를 열었다. 간문맥(portal vein)을 찾아 catheter를 꽂은 다음 1단계 관류 용액(NaCl 8g/L KCl 0.4g/L, HEPES(4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazineEthane-Sulfonic acid, Sigma Chem Co.) 2.38g/L, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid, Gibco Co) 0.19g/L, Sodium bicarbonate 0.35g/L, Glucose 0.9g/L, Penicillin 100Unit/mL. Streptomycin 10mg/mL, Amphotericin B 25ug/mL)을 25mL/min의 속도로 10분간 흐르게 하여 충분히 세척하였다. 이때 관류 용액의 온도가 37°C가 유지되게 하고 실리콘 튜브를 통과시키면서 90% 산소(O2), 10% 이산화탄소(CO2)의 혼합가스로 평형 시켰으며 간으로 공기 방울이 들어가지 않도록 간으로 들어가기 바로 앞부분에 기포제거 장치를 설치하였다. 2단계로는 콜라게나아제 용액(collagenase(Sigma Chem Co.) 0.5g/L, 트립신 저해제(trypsin inhibitor;Sigma Chem Co.) 0.05g/L, 염화나트륨(NaCl) 8g/L, 염화칼륨(KCl) 0.4 g/L, 염화칼슘(CaCl) 20.56g/L, 헤페스(HEPES) 2.381g/L, 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate) 0.35g/L, 페니실린(penicillin) 100 Unit/mL, 스트렙토마이신(Streptomycin) 10mg/mL, 암포테리신 비(Amphotericin B) 25ug/mL)을 카테테르(catheter)를 통해서 20mL/min의 유속으로 10분 동안 1단계와 같은 방법으로 흐르게 하였다. 관류 용액이 흐르기 시작하면 암적색의 간은 혈액이 빠지면서 바로 노랗게 변하며 콜라게나아제가 들어있는 관류 용액이 흐르기 시작하면 간의 기질이 분해되기 시작하여 간이 조금씩 부풀기 시작한다. 관류가 끝날 무렵에는 처음보다 약 2배 가량 커지게 된다. 이러한 간을 떼어내어 페트리디쉬에 옮긴 후 메스로 간의 캡슐을 잘라 간세포가 풀어져 나오도록 한 후 풀어진 간 조직을 William’s Medium E(웰진)로 세척하여 거즈에 거르고, 100um pore의 나일론 메쉬에 거른 후 4°C에서 원심분리(500rpm, 50g, 2분) 하였다. 이러한 원심분리 조건에서 간세포는 대부분 가라앉으며 간의 다른 비실질 세포는 대부분 부유상태로 있게 된다. 위의 원심분리를 3회 반복하여 간세포만을 얻을 수 있었다. 간세포의 생존도는 트리판 블루 염색(trypan blue staining) 방법에 의하여 측정하였다. 보통 200g의 쥐로부터 약 2～3 X 108개 정도의 간세포를 회수할 수 있었으며 생존도는 85% 이상이었다.
[6-2] 랫트 일차 간세포 배양
쥐 간세포 배양은 다음와 같이 수행하였다. 쥐 간세포 배양에 사용한 배지는 무혈청배지 (hormonaly defined media, HDM)로서 기본 배지로는 William’s Medium E(웰진)을 사용하였으며 여기에 표피생장인자(epidermal growth factor)(20ug/L, 대웅제약), 인슐린(insulin)(10mg/L, 릴리), 헤페스(HEPES)(1.19g/L, Sigma Chem. Co), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin- streptomycin)(100 Unit/mL, Gibco), 암포테리신 비(amphotericin B)(25ug/mL, Gibco)를 첨가하여 사용하였다. 접종 4시간 후 배지를 교체하고, 24시간 후에 다시 배지를 교체한 후 실험에 사용하였다. 농도 별로 염화암모늄(ammonium chloride) 각각의 5, 10, 20, 50, 100mM 농도에 약재(1mg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포 생존율을 MTT를 이용하여 확인하고 약재를 선택하였다. 그리고 선택된 약재를 농도 별로(0.25, 0.5, 1, 2.5mg/mL) 처리하여 1시간 동안 배양 후 100mM의 염화암모늄(ammonium chloride)를 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
[6-3] 세포 생존율 측정
생체 외(in vitro) 세포실험에서 간세포 손상을 유도하기 위하여 암모니아를 사용하였다. 세포독성은 100mM의 암모니아에서 세포독성이 확연하게 나타나 간세포 손상의 실험군으로 100mM의 암모니아를 주입하였다. 실험에 사용한 시료는 상기 실시예 4에서 제조한 각 시료 즉, 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물의 수용성분말(실험군1), 흑미강/차가버섯균사(발효)/생물전환산물의 수용성분말(실험군2), 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물의 수용성분말(실험군3), 흑미강/목이버섯균사(발효)/생물전환산물의 수용성분말, 흑미강/눈꽃송이버섯균사(발효)/생물전환산물의 수용성분말(실험군5)을 사용하였으며 간세포 보호 효과를 비교하기 위하여 비슷한 효과가 기대되는 물질(실험군6~11)로 선별(screening)실험을 하였다. 암모니아와 함께 상기 시료를 처리하고 24시간 배양한 후 MTT(3- (4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)를 0.5mg/ml의 농도로 처리하여 4시간 반응시키고, 다이메틸설폭사이드(DMSO)를 처리하여 녹여낸 후 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 아무것도 처리하지 않은 정상세포를 기준으로 상대적인 백분율(%)로 나타내었다. 세포 생존율 실험 결과 생물전환산물의 수용성분말을 처리한 경우에 세포의 생존율이 90% 정도로 향상되는 것을 확인하였다. 결과를 도 3에 도시하였다.
[6-4] 글루타티온 S-전달효소(GST;glutathione s-transferase) 측정
글루타티온 S-전달효소 분석 키트 (Glutathione S-Transferase Assay kit, Sigma Chem. Co)를 사용하여 글루타티온 S-전달효소 활성을 측정하였다. 인산완충식염수(Dulbecco’s Phosphate buffer saline), 글루타티온 환원제(L-glutathione reduce) 와 CDNB 로 미리 만들어 놓은 반응액(reaction master mix)과 시료를 잘 섞어 340nm 에서 흡광도로 측정하여 글루타티온 S-전달효소 활성을 계산하였다(도 4).
랫트 간세포에 암모니아를 처리한 군에서는 해독작용을 위해 글루타티온 S-전달효소의 활성이 증가하였고, 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 수용성분말을 처리한 군에서는 글루타티온 S-전달효소의 활성이 농도 의존적으로 비례하여 감소하였다.
[6-5]과산화물제거효소(SOD;superoxide dismutase) 측정
암모니이와 함께 상기 실시예 4에서 제조한 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 수용성분말을 처리한 24시간 후에 trypsin-EDTA 처리하여 모은 세포를 동결 융해(freeze-thaw)방법으로 세포를 용해시켜 과산화물제거효소 활성을 측정하였다. 나이트로블루 테트리졸륨(Nitroblue tetrazolium)을 이용한 간접적인 방법으로 과산화물제거효소 활성을 측정하는 분석 키트(Superoxide dismutase Assay kit, Sigma Chem. Co)를 사용하였다. WST 작업용액(WST working solution)에 상기 시료와 효소를 넣은 후 37°C에서 20분간 반응시킨 후 450nm 흡광도로 측정하고 시료와 시약블랭크를 이용해 과산화물제거효소 활성을(inhibition rate)을 계산하였다.
과산화물제거효소 활성은 암모니아 처리군에서는 감소하였으나, 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 수용성분말을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 회복되는 경향과 함께 농도에 비례하여 증가하면서 고농도에서는 대조군 보다 높은 활성을 나타내었다(도 5).
<실시예7>
본 발명의 방법에 따라 제조한 생리활성물질의 생체 내(in vivo)분석
[7-1]아세트아미노펜 유발 간독성 동물실험
상기 실시예 4에서 제조한 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말의 간독성에 대한 효능을 관찰하기위해 생체 내(in vivo)실험으로 흰쥐에서 아세트아미노펜 유발 간독성 동물실험을 수행하였다.
생후 8주령의 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐를 (주)오리엔트사(Korea)로 부터 분양받아 ‘실험동물 관리 및 이용에 관한 지침(Guide for Care and Use of Laboratory Animals(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council, USA; National Academy Press: Washington D.C., 1996)’에 의하여 실험식이로 사육하였다. 사육실은 25±2℃의 온도와 50±5%의 습도에서 12시간 간격의 광주기로 일정한 조건을 유지하였다. 실험 과정은 질병관리본부의 동물관리지침에 따라 시행하였고 동국대학교의 동물실험윤리위원회의 승인하에 수행하였다.
실험에 앞서 모든 실험동물에게 물과 고형배합사료를 제한 없이 급여하면서 일주일간 환경에 적응시킨 후 체중에 따라 실험군을 분류하였다.
아세트아미노펜은 1mg/kg의 농도로 4일간 투여하였으며 정상군은 아세트아미노펜 대신 물을 먹였다.
이후 동물을 희생하여 검사를 시행하였다. 즉, 마취 하에서 심장에서 직접 혈액을 채취 하였으며, 간은 체취 후 즉시 액화질소에 저장하였다. 혈장은 혈액에서 1000×g, 15분 4°C에서 원심분리 하였고, 모든 시료는 -70°C에서 실험 전까지 저장되었다.
상기 시료 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말 및 대조군 모두 250mg/kg을 투여하였다. 상기 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말의 투여에 있어서 먼저 투여량에 맞게 중량을 측정한 후 상기 분말을 수용액에 녹이고 침전을 제거한 상등액을 투여하였다.
[7-1-1]알라닌 아미노전이효소(ALT:Alanine aminotransferase or GPT:Glutamic pyruvate transferase) 활성 측정
알라닌 아미노전이효소 활성을 측정하기 위해서 Reitman-Frankel 방법에 의해 제조된 키트 (GOT kit, Asan pharmaceutical, Korea)를 사용하였다. L-알라닌(L-alanine)과 알파케토글루타르산(α-ketoglutaric acid)을 기질로 사용하여 37°C 에서 반응시킨 후 정색시약(2,4-dinitrizine hydrazine)과 0.4N 수산화나트륨(NaOH)로 발색하여 505nm 에서 흡광도를 측정하였다. 활성도의 단위는 케멘(Kamen) unit/ml 로 표시하였다.
혈중 알라닌아미노전이효소 활성에 미치는 영향은 정상대조군에 비해서 아세트아미노펜 섭취 대조군에서 알라닌 아미노전이효소 활성이 유의한 수준으로 증가하는 것을 관찰하였다. 양성대조군에서는 아세트아미노펜 섭취 대조군과 비교해 보았을 때 통계적으로 유의한 수준의 감소가 관찰되지 않았으나, 본 실험의 실험군인 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말을 섭취한 군에서는 알라닌 아미노전이효소 활성이 통계적으로 유의한 수준으로 감소하는 것을 관찰하였다(도 6).
[7-1-2]아스파테이트 아미노전이효소(AST:Aspartate aminotransferase or GOT:Glutamic oxalacetic transferase) 활성 측정
아스파테이트 아미노전이효소 활성을 측정하기 위해서 Reitman-Frankel 방법에 의해 제조된 키트(GOT kit, Asan pharmaceutical, Korea)를 사용하였다. L-아스파르트산(L-aspartic acid)과 알파케토글루타르산(α-ketoglutaric acid)을 기질로 사용하여 37°C 에서 반응시킨 후 정색시약(2,4-dinitrizine hydrazine)과 수산화나트륨(NaOH)로 발색하여 505nm 에서 흡광도를 측정하였다. 활성도의 단위는 케멘(Kamen) unit/ml 로 표시하였다.
혈중 아스파테이트 아미노전이효소 활성에 미치는 영향은 정상대조군에 비해서 아세트아미노펜 섭취 대조군에서 아스파테이트 아미노전이효소 활성이 유의한 수준으로 증가하는 것을 관찰하였다. 양성대조군에서는 아세트아미노펜 섭취 대조군과 비교해 보았을 때 통계적으로 유의한 수준으로 감소하였으며, 본 실험의 실험군인 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말을 섭취한 군에서는 아스파테이트 아미노전이효소 활성이 통계적으로 유의한 수준으로 좀 더 감소하는 것을 관찰하였다(도 7). 따라서 간 손상 유발에 의해 상승한 효소활성 수치가 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말에 의해 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
[7-1-3]젖산탈수소효소(LDH:Lactate dyhydrogenase) 활성 측정
젖산탈수소효소 활성을 측정하기 위해 젖산탈수소효소 세포독성 확인 키트(LDH Cytotoxicity Detection Kit ; Takara Bio Inc., Atsu, Shiga, JAPAN)를 사용하였다. 젖산탈수소효소는 체내 모든 조직이나 세포에 분포되어 있는 효소로서 피루브산(pyruvate)와 젖산(lactate) 사이의 상호전환(interconcentration)을 촉매하는 작용을 갖는다. 세포독성이나 세포사멸 등의 현상에 의해 AST, ALT와 동일하게 간세포로부터 빠져나와 젖산탈수소효소 수치가 증가하게 된다.
혈중 젖산탈수소효소 활성에 미치는 영향은 정상대조군에 비해서 아세트아미노펜 섭취 대조군에서 젖산탈수소효소 활성이 유의한 수준으로 상승하였고, 양성대조군에서는 아세트아미노펜 섭취 대조군에 비하여 유의한 수준으로 감소하였다. 본 실험의 실험군인 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말도 아세트아미노펜 섭취 대조군과 비교해 볼 때 유의한 수준으로 젖산탈수소효소 활성이 감소하는 것을 확인하였다(도 8). 따라서 간 손상 유발에 의해 상승한 효소활성 수치가 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말에 의해 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
[7-2]알코올 유발 간독성 동물실험
알코올로 간 손상을 유발한 흰쥐에 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말을 투여한 후 간을 적출하여 헤미록실린과 에오신 염색법(Hematoxylin and Eosin staining;H&E)을 이용하여 간 조직을 관찰하였다. 실험방법은 다음과 같다.
포르말린에 충분히 고정시킨 후 적출한 간은 70% 에탄올 용액으로 옮겨져, 분석 전까지 4℃에서 보존하였다. 조직의 파라핀 프로세싱은 먼저 70% 메탄올 용액에서 1시간 담근 후 순서대로 90% 메탄올 용액에서 1사간, 95% 메탄올 용액에서 1시간, 100% 메탄올 용액에서 1시간, 100% 에탄올 용액에서 1시간, 자일렌에서 1시간 담그기를 총 2회 반복하였다. 이후 파라핀(65℃)에서 30분 동안 담궈 두었으며 다음으로 조직의 파라핀 블록이 준비되었다. 블록들은 박절기를 이용하여 4μm 조직 절편을 만들어 water bath에 담근 후, 깨끗한 유리 슬라이드에 고정하게 된다. 조직을 유리 슬라이드에 확실히 고정하기 위해서 65℃ 오픈에서 20분동안 유리 슬라이드를 가열하게 된다. 유리 슬라이드는 자일렌에서 2분 동안 담그기를 총 3회 반복하고 이후 100% 에탄올 용액에 담그기를 총 2회 반복 후 순서대로 95% 에탄올 용액, 80% 에탄올 용액, 마지막으로 물에 담그는 과정을 거쳐 탈파라핀(deparaffinization)과 재수화(rehydration) 작용을 거치게 된다.
헤마톡실린 & 에이오신(H&E) 조직 염색은 먼저 헤마톡실린에서 2분 정도 담근 후 흐르는 물로 행구어 준다. 이후 에이오신에서 15초 정도 담근 후 95% 에탄올 용액에 담그기를 2회 반복하고 이후 100% 에탄올 용액에 담그기를 2회 반복하였다. 이후 자일렌에서 2분 정도 담그기를 총 2회 반복 후 커버 글라스로 덮어 주었다. 준비된 슬라이드는 현미경으로 관찰하였고 각각의 이미지들을 포착하였다.
[7-2-1]알코올 유발 간독성에 대한 간조직 관찰
알코올로 간 손상을 유발한 흰쥐에 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말을 투여한 후 간을 적출하여 헤미록실린과 에오신 염색법(Hematoxylin and Eosin staining;H&E)을 이용하여 간 조직을 관찰한 결과, 알코올 투여군에서는 간세포의 괴사와 함께 염증, 침윤과 함게 문맥 주위에 지방변성에 의한 lipid vacuoles가 산재되어 있음이 관찰된 반면 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말을 함께 처리한 군에서는 모두 간세포의 파괴가 적게 관찰되었고 비교적 세포 구조도 잘 유지하고 있으며, 지방 변성도 미약하게 관찰되어 간 보호 효과를 확인할 수 있었다(도 9).
[7-2-2]알코올 유발 간독성에 대한 간 지방 과산화 수치 측정
간 지방 과산화(Hepatic lipid peroxidation) 수치 측정은 STA-330 OxiSelect™ TBARS Assay Kit (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 MDA로 표시하였다. 먼저, 간은 항산화 용액 키트인 1X BHT를 포함한 인산완충용액 100 mg/mL로 재부유하였다. 조직은 얼음 위에서 균일하게 하였고 그 결과로 생긴 균질현탁액(homogenate)은 4°C에서 5분간 10,000g을 원심분리 하였다. 상층액(supernatant)은 조심스럽게 분리하여 TBARS 수준 측정을 위해 즉시 검사하였다.
간 지방 과산화 수치 측정 결과 정상대조군과 비교해 보았을 때 알코올 섭취 대조군에서 간 지방 과산화 수치가 유의한 수준으로 상승하는 변화를 나타내었다. 반면, 양성대조군에서는 알코올 섭취 대조군 대비 변화가 관찰되지 않았으나, 본 실험의 실험군인 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말, 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말과 흑미강/목이버섯균사(발효)/생물전환산물 분말 섭취군에서는 모두 에탄올 섭취군과 양성대조군에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 간 지방 과산화 수치가 낮아지는 것을 확인하였다(도 10).
간 조직의 관찰과 비교해 볼 때 지방 변성이 전혀 관찰되지 않은 양성대조군에서는 오히려 알코올 섭취군과 비교해 보았을 때 지방 과산화 수치가 감소하지 않았으며, 실험군인 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말, 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말과 흑미강/목이버섯균사(발효)/생물전환산물 분말 섭취군에서는 알코올 섭취군과 비교해 보았을 때 지방 변성이 미약하게 관찰된 반면, 지방 과산화 수치는 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 따라서 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말, 흑미강/표고버섯균사(발효)/생물전환산물 분말과 흑미강/목이버섯균사(발효)/생물전환산물 분말의 간 보호 효과가 우수함을 확인하였다(도 10).
[7-3]엘피에스(지질다당류;Lipopolysaccharide(LPS))에 의해 유도된 패혈증 동물모델에서의 간 손상 억제 관찰
상기 실시예 4에서 제조한 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말의 패혈증 동물모델에서의 간 손상 억제에 대한 효능을 관찰하기 위해 생체 내(in vivo)실험으로 흰쥐에서 엘피에스(LPS) 유발 간 손상 동물실험을 수행하였다. 실험방법은 다음과 같다.
생후 6주령의 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐를 샘타코(Osan, Kyunggido, Korea)로 부터 분양받아 ‘실험동물 관리 및 이용에 관한 지침(Guide for Care and Use of Laboratory Animals(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council, USA; National Academy Press: Washington D.C., 1996)’에 의하여 실험식이로 사육하였다. 사육실은 25±2℃의 온도와 50±5%의 습도에서 12시간 간격의 광주기로 일정한 조건을 유지하였다. 실험 과정은 질병관리본부의 동물관리지침에 따라 시행하였고 아주대학교의 동물실험윤리위원회의 승인하에 수행하였다.
실험에 앞서 모든 실험동물에게 물과 고형배합사료를 제한 없이 급여하면서 일주일간 환경에 적응시킨 후 체중에 따라 실험군을 분류하였다.
대조군은 엘피에스(LPS) 5㎍/㎏와 갈락토사민(Galactosamine) 700㎎/㎏의 농도로 복강에 투여하여 패혈증을 유도하였으며, 실험군은 흰쥐에 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말을 10㎎/㎏ body weight/day의 농도로 14일간 경구(사료 식이) 및 복강 투여한 후 패혈증을 유도하였으며, 정상군은 패혈증 유도대신 물을 먹였다.
실험 종료 후 동물을 희생하여 검사를 시행하였다. 즉, 마취 하에서 심장에서 직접 혈액을 채취 하였으며, 간은 체취 후 사진 촬영 후 즉시 액화질소에 저장하였다. 혈장은 혈액에서 1000×g, 15분 4°C에서 원심분리 하였고, 모든 시료는 ?70°C에서 실험 전까지 저장되었다.
[7-3-1]알라닌 아미노전이효소(ALT:Alanine aminotransferase or GPT:Glutamic pyruvate transferase) 활성 측정
알라닌 아미노전이효소 활성을 측정하기 위해서 Reitman-Frankel 방법에 의해 제조된 키트 (GOT kit, Asan pharmaceutical, Korea)를 사용하였다. L-알라닌(L-alanine)과 알파케토글루타르산(α-ketoglutaric acid)을 기질로 사용하여 37°C 에서 반응시킨 후 정색시약(2,4-dinitrizine hydrazine)과 0.4N 수산화나트륨(NaOH)로 발색하여 505nm 에서 흡광도를 측정하였다. 활성도의 단위는 케멘(Kamen) unit/ml 로 표시하였다.
혈중 알라닌아미노전이효소 활성에 미치는 영향은 정상대조군에 비해서 패혈증을 유도한 대조군에서 알라닌 아미노전이효소 활성이 유의한 수준으로 증가하는 것을 관찰하였다. 반면에 본 실험의 실험군인 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말을 경구(사료 식이) 및 복강 투여한 군에서는 알라닌 아미노전이효소 활성이 통계적으로 유의한 수준으로 감소하는 것을 관찰하였다(표 1).
[7-3-2]아스파테이트 아미노전이효소(AST:Aspartate aminotransferase or GOT:Glutamic oxalacetic transferase) 활성 측정
아스파테이트 아미노전이효소 활성을 측정하기 위해서 Reitman-Frankel 방법에 의해 제조된 키트(GOT kit, Asan pharmaceutical, Korea)를 사용하였다. L-아스파르트산(L-aspartic acid)과 알파케토글루타르산(α-ketoglutaric acid)을 기질로 사용하여 37°C 에서 반응시킨 후 정색시약(2,4-dinitrizine hydrazine)과 수산화나트륨(NaOH)로 발색하여 505nm 에서 흡광도를 측정하였다. 활성도의 단위는 케멘(Kamen) unit/ml 로 표시하였다.
혈중 아스파테이트 아미노전이효소 활성에 미치는 영향은 정상대조군에 비해서 패혈증을 유도한 대조군에서 아스파테이트 아미노전이효소 활성이 유의한 수준으로 증가하는 것을 관찰하였다. 본 실험의 실험군인 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말을 섭취한 군에서는 아스파테이트 아미노전이효소 활성이 통계적으로 유의한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다(표 1).
흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말의 패혈증 유도 동물모델에서의 알라닌 아미노전이효소 및 아스파테이트 아미노전이효소 활성 결과를 통해 간 손상 억제에 우수한 효과가 있음을 확인하였다(표 1).
<표1>
또한 채취한 간의 육안 관찰을 통해서 정상대조군에 비해 패혈증이 유도된 간의 색이 매우 검붉게 손상된 것을 관찰 할 수 있었으며, 본 실험의 실험군인 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말의 경구(사료 식이) 및 복강 투여한 섭취군에서는 간 손상이 매우 적게 일어나 간의 색이 선홍색을 띄는 것을 관찰할 수 있었다(도 11).
따라서, 흑미강/상황버섯균사(발효)/생물전환산물 분말의 패혈증 유도 동물모델에서의 간 손상 억제에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
Claims (14)
- (a) 흑미를 액상으로 배양·발효배지화 하는 단계
(b) 상기 (a)단계의 배양·발효배지화 한 액상흑미배지에 담자균류균사를 접종하여 배양하는 단계
(c) 상기 (b)단계의 배양공정에 의해 생산된 배양물로부터 생물전환공정을 통해 간 보호 및 간기능 개선 효능을 향상시킨 생물전환산물을 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 (c)단계의 생물전환산물은 면역활성을 갖는 고분자성 다당체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기(a)단계의 흑미의 배양·발효배지화는 흑미를 분말화
한 흑미분말 또는 흑미의 도정과정에서 나오는 흑미강에 전분분해효소 및 단백질분해효소로 처리한 후 멸균처리하여 액상흑미배지로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 흑미분말 또는 흑미강에 대두분말을 추가하여 액상흑미배지를 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 (b)단계의 담자균류 균사는 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯 으로 이루어진 그룹에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기(b)단계의 배양공정은 회분식 배양공정과 함께 잔류 배지성분의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 흑미배지를 추가로 첨가하여 배양하는 유가식 배양공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 (c)단계의 생물전환공정은 열수추출 후 효소처리에 의한 생물전환공정 및 열수추출 후 미생물발효에 의한 생물전환공정인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 효소처리는 세포벽 구성성분을 분해할 수 있는 섬유소분해효소에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 섬유소분해효소는 셀룰라제, 헤미셀룰라제 및 글루카나제로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 미생물발효에 의한 생물전환공정에서의 미생물은 섬유소분해효소를 생성할 수 있는 미생물에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 섬유소분해효소를 생성할 수 있는 미생물로는 유산균, 바실러스균, 효모균, 아스퍼질러스 및 트리코더마 리제이로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 다당체는 (c)단계의 생물전환공정을 거친 배양액에서 불용성 잔사를 제거한 상등액에 에탄올 첨가하여 침전을 유도하여 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항의 방법에 의해 제조된 간 보호 및 간기능 개선 생리활성물질.
- 제 13 항의 생리활성물질을 포함하는 건강식품 조성물.
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