KR101438717B1 - 간세포 보호작용을 갖는 민들레 복합식물 발효추출 조성물 - Google Patents
간세포 보호작용을 갖는 민들레 복합식물 발효추출 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 민들레와 엉겅퀴의 혼합물에 프락토올리고당을 첨가한 후, 살균하는 단계(a); 살균된 민들레와 엉겅퀴의 혼합물에 누룩균(Aspergillus oryzae)을 접종한 후, 발효시켜 민들레 복합 발효물을 제조하는 단계(b); 상기 민들레 복합 발효물을 열수추출하여 민들레 복합 발효추출물을 수득 단계(c); 및 상기 민들레 복합 발효추출물에, 치커리, 인진쑥, 둥굴레, 대추 및 천궁이 혼합된 혼합물을 열수추출하여 제조되는 혼합액을 첨가하는 단계(d);를 포함하는 과정으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 간세포 보호작용 및 간기능 개선효과를 갖는 민들레 복합식물 발효추출 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 민들레를 함유하는 복합식물 발효추출 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 산화적 스트레스에 의해 손상된 항산화계 효소의 유전자 발현을 증진시켜 간세포 보호효능 및 간기능 개선효과가 있는 민들레를 함유하는 복합식물 발효추출 조성물의 제조방법 및 이를 함유하는 간기능 개선효능을 위한 식품 조성물에 관한 것이다.
민들레는 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로 한방명은 포공영으로 알려져 있으며, 한방에서 강장, 해열, 이뇨, 건위, 거담 등에 이용되어 왔다. 또한, 최근 민들레의 다양한 생리활성에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 항산화, 항염증, 간보호 기능, 지질대사조절 등의 다양한 기능성을 가지는 것으로 알려져 있다. 민들레의 성분연구에서 하이드록시신나믹산(hydroxycinnamic acid), 치코릭산(chicoric acid), 클로로겐산(chlorogenic acid), 쿠마린(coumarins), 루테올린(luteolin) 배당체 등 다양한 폴리페놀 화합물을 함유되어 있는 것을 보고하였으며, 치코릭산(chicoric acid) 및 모노카펠탈타릭산(monocaffeyltartaric acid) 화합물이 민들레의 주요한 페놀성 화합물로 알려져 있다(Williams CA 등, Phytochemistry, 1996). 민들레의 고미성분으로 세스퀘테르펜(sesquiterpene) 화합물인 타라씨닉산-베타-디-글루코피라노시드(taraxinic acid-β-D-glucopyranoside) 와 11,13-디하이드로타락씨닉산-디-글루코피라노시드(11,13-dihydrotaraxinic acid-D-glucopyranoside)가 알려져 있으며(Schutz K 등, J. Ethnopharmacol, 2006), 또한, 민들레 뿌리는 다양한 트리테르펜(triterpene)과 타락사스테롤(taraxasterol) 등 다양한 피토스테롤(phytosterol) 및 이눌린 등을 함유하고 있는 것으로 보고되었다(Gonzalez-Castejon M 등, Nutr Rev, 2012; Schutz K 등, J. Ethnopharmacol, 2006). 또한, 민들레 잎에는 다양한 루테올린-7-씨-글루코시드(luteolin-7-O-glucoside), 루테올린-7-씨-루티노시드(luteolin-7-O-rutinoside) 등의 플라보노이드 글루코시드(flavonoid glucoside) 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 주로 하이드로신나믹산(hydrocinnamic acid) 유도체 화합물이 잎의 주요한 페놀릭 컴파운드(phenolic compound)로 알려져 있다(Gonzalez-Castejon M 등, Nutr Rev, 2012).
한편, 생명체는 대사과정 중 다양한 요인에 의해 활성산소종이 생성되며 이러한 물질은 유기물과 반응하여 생명체의 구성성분인 세포의 단백질, 지질 및 DNA 성분을 기능적으로 손상시켜 생체기능을 저하시킨다. 또한, 항산화 체계의 불균형에 의해 활성산소종의 형성이 증가된 상태인 산화적 스트레스 상태가 장기간 유지될 경우에는 다양한 질환의 발병과 연관되어있는 것으로 알려져 있다.
한편, 산화적 스트레스에 의한 세포 구성성분의 산화적 손상을 지연시키기 위한 생체보호 시스템에는 항산화제와 항산화 효소로 구분할 수 있다. 항산화제에는 비타민 C, 비타민 E 등의 항산화 물질을 포함하며, 항산화 효소에는 과산화물제거효소(superoxide dismutase, SOD)등의 효소가 포함된다. SOD는 대사과정 중 형성된 슈퍼옥사이드(superoxide, O2 ·-)를 과산화수소(H2O2)로 전환시키며, 형성된 과산화수소는 글루타티온산화효소(glutathione peroxidase) 및 카탈라아제(catalase)의 작용에 의해 제거된다. 따라서 이러한 항산화 효소들의 활성을 증진 시킬 수 있는 천연소재 개발에 관심이 높아지고 있다.
이에 본 발명자들은 인간 간암 세포주인 HepG2를 이용하여 산화적 스트레스에 의해 감소된 항산화 효소들의 유전자 발현이 민들레를 함유하는 복합식물 발효추출물에 의해 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 산화적 스트레스에 의해 저하된 항산화 효소 활성을 증진시켜 간세포 보호작용 및 간기능 개선효과가 있는 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 민들레와 엉겅퀴의 혼합물에 프락토올리고당을 첨가한 후, 살균하는 단계(a); 살균된 민들레와 엉겅퀴의 혼합물에 누룩균(Aspergillus oryzae)을 접종한 후, 발효시켜 민들레 복합 발효물을 제조하는 단계(b); 상기 민들레 복합 발효물을 열수추출하여 민들레 복합 발효추출물을 수득 단계(c); 및 상기 민들레 복합 발효추출물에, 치커리, 인진쑥, 둥굴레, 대추 및 천궁이 혼합된 혼합물을 열수추출하여 제조되는 혼합액을 첨가하는 단계(d);를 포함하는 과정으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 간세포 보호작용 및 간기능 개선효과를 갖는 민들레 복합식물 발효추출 조성물 및 이를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 누룩균(Aspergillus oryzae)의 접종 조건은, 누룩균(Aspergillus oryzae) 0.1~10중량%를 살균된 민들레와 엉겅퀴의 혼합물에 접종하고 배양온도 30~40℃, 상대습도 40~80%인 배양실에서 24~72시간 동안 발효하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 누룩균(Aspergillus oryzae) 0.1중량%를 접종하고 배양온도 37℃, 상대습도 60%인 배양실에서 36시간 동안 발효하는 것이 좋다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 민들레 복합 발효물은, 민들레 건조물 45~55중량%, 엉겅퀴 건조물 35.9~45.9중량%의 혼합물에 프락토올리고당 8~10.2중량%을 첨가하여 살균한 후, 누룩균(Aspergillus oryzae) 0.05~0.15중량%를 접종하여 발효시켜 제조되는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 민들레 복합 발효물의 열수추출 조건은, 민들레 복합 발효물의 3~20배수의 물을 가한 후, 97℃ 이상의 온도에서 추출하는 것이 바람직하다. 추출은 필요에 따라 가압상태에서 수행할 수도 있다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 혼합물은, 치커리 23~27중량%, 인진쑥 23~27중량%, 둥글레 18~22중량%, 대추 18~22중량% 및 천궁 8~12중량%가 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 민들레와 엉겅퀴는, 이를 건조하여 사용하거나 또는 그대로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 건조하여 사용하는 것이다. 건조법으로는 자연 건조 또는 열풍 건조법 등을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 민들레와 엉겅퀴는, 이를 분쇄하여 사용할 수도 있다. 민들레와 엉겅퀴를 분쇄하여 사용하면 추출을 용이하게 할 수 있다는 이점이 있다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 프락토올리고당은, 액체 또는 분말로 이용할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 치커리, 인진쑥, 둥글레, 대추 및 천궁의 혼합액 제조방법으로는, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 다양한 추출 방법을 이용할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 민들레 복합식물 발효추출 조성물 식품에 첨가되어 간세포 보호기능 및 간기능 개선효과가 있는 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 곡류, 카페인 음료, 일반 음료, 초콜릿, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합체 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있는데, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 민들레와 엉겅퀴를 누룩균(Aspergillus oryzae)으로 발효시킴으로써 산화적 스트레스에 의해 손상된 항산화계 효소의 유전자 발현을 증진시켜 간세포 보호효능 및 간기능 개선효과가 있는 민들레 복합식물 발효물 및 이를 함유한 식품 조성물을 제조할 수 있다.
도 1은 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 본 발명의 민들레 복합식물 발효추출 조성물과 일반 민들레 추출물의 처리농도에 따른 과산화물제거효소-1(SOD-1)의 mRNA 증가를 분석한 결과이다.
도 2는 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 본 발명의 민들레 복합식물 발효추출 조성물과 일반 민들레 추출물의 처리농도에 따른 과산화물제거효소-2(SOD-2)의 mRNA 증가를 분석한 결과이다.
도 2는 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 본 발명의 민들레 복합식물 발효추출 조성물과 일반 민들레 추출물의 처리농도에 따른 과산화물제거효소-2(SOD-2)의 mRNA 증가를 분석한 결과이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예
1: 민들레 복합식물 발효추출 조성물의 제조
민들레 건조물 50중량%, 엉겅퀴건조물 40.9중량%를 혼합한 후, 분말 프락토올리고당 9중량%를 첨가하고 90℃의 스팀으로 15분간 살균한 다음 누룩균(Aspergillus oryzae) 0.1중량%를 접종하여 배양온도 37℃, 상대습도 60%의 배양실에서 36시간 동안 발효시켜 민들레 복합 발효물을 수득하였다.
상기 민들레 복합발효물 1kg을 추출포에 담은 후, 10배수의 물을 가한 다음 97℃의 온도에서 6시간씩 3회 추출하고 여과하였다. 그 다음 이물질이 제거된 추출물을 감압농축하여 고형분 6%의 농도로 조절하여 민들레 복합발효 추출물을 수득하였다.
이어, 치커리 25중량%, 인진쑥 25중량%, 둥굴레 20중량%, 대추 20중량%, 천궁 10중량%의 비율로 혼합하여 혼합물을 1kg을 제조하고 10배의 물을 가하여 추출한 후 농축한 혼합액(고형분 함량 60%)을 3중량%의 농도로 상기 민들레 복합발효 추출물에 첨가하여 민들레 복합식물 발효추출 조성물을 최종 제조하였다.
실시예
2: 민들레 추출물의 제조
세척하고 완전히 건조된 민들레 40 g에 추출수 10배수의 물을 가한 다음 가압상태에서 97℃ 이상의 온도에서 6시간씩 3회 추출하고 여과하였다. 그 다음 이물질이 제거된 추출물을 감압농축하여 고형분 함량이 '상기 실시예 1에서 제조한 민들레 복합식물 발효추출 조성물'과 같도록 조절하여 민들레 추출물을 제조하였다.
실험예
1: 민들레 복합식물 발효추출 조성물의 항산화 활성 측정
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 민들레 복합식물 발효추출 조성물의 항산화 활성을 측정하고자 DPPH/ABTS 라디칼 소거능 및 총 페놀성화합물의 함량을 측정하여 분석하였다.
DPPH 라디칼 소거활성은 블루아(Blois) 방법에 따라 DPPH(1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl)에 대한 전자공여능(electron donating ability)으로 분석시료에 대한 환원력을 측정하였으며, 시료가 DPPH 라디칼을 50% 소거하는데 필요로 하는 농도(EC50)를 측정하였다. 시료를 농도별로 준비하여 150 μM DPPH용액 1 ㎖를 혼합한 다음 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다.
한편, ABTS 라디칼 소거활성을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법에 의하여 측정하였다. 7 mM ABTS와 2.45 mM 싸이오황산칼륨(K2S2O8)을 실온인 암소에서 24시간 반응하여 ABTS 라디칼을 형성시켜 ABTS stock solution을 제조하였으며, 이를 734 nm에서 흡광도 0.70±0.02로 희석시켜 사용하였다. ABTS 용액 1 ㎖와 시료를 첨가하여 암실에서 10분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하여 ABTS 라디칼 소거율을 분석하였다. Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC) 값을 측정하기 위하여 Trolox(Sigma-Aldrich)를 사용하였고, 농도별 ABTS 라디칼 소거율을 측정하여 표준곡선을 작성하여 기울기(slope) 값을 얻었으며, 시료농도에 따른 ABTS 라디칼 소거율을 측정하여 각 분석시료에 대한 기울기(slope) 값을 분석하였다.
한편, 민들레 복합식물 발효추출 조성물의 총 페놀성 화합물 함량은 싱글턴(Singleton)과 로시(Rossi)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 40 ㎕에 증류수 1.56 ㎖를 혼합한 후 0.1 ㎖ Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich)를 첨가한 다음 5분간 실온에서 반응시켰으며, 이후 2 M 소듐 카보네이트 용액 0.3 ㎖를 첨가하여 40℃에서 30분간 동안 반응시켜 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 갈산(gallic acid, Sigma-Aldrich)을 이용하여 농도별 표준곡선을 작성한 후 시료의 총 페놀성화합물 함량을 mg gallic acid equivalent(GAE)/g으로 분석하여 나타내었다.
| DPPH 라디칼 소거활성 (EC50 ㎍/㎖) | ABTS 라디칼 소거활성 (TEAC value) | 총 페놀성화합물 함량 (mg GAE/g of sample) | |
| 민들레 복합식물 발효추출 조성물 |
152.76 ± 0.25 | 0.0375 ± 0.0002 | 40.53 ± 0.13 |
실험결과, 상기 표 1에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 민들레 복합식물 발효추출 조성물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성이 우수하였고, 총 페놀성화합물 함량도 높음을 확인할 수 있었다.
실험예
2 : 민들레 복합식물 발효추출 조성물의 항산화 효소 발현에 미치는 영향 분석
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 민들레 복합식물 발효추출 조성물과 상기 실시예 2에서 제조된 일반적인 민들레 추출물이 항산화 효소 발현에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
간암 세포주인 HepG2는 ATCC에서 분양을 받아 실험에 이용하였다. HepG2 세포주는 배양용기에 DMEM, 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycine)을 첨가한 배양액을 이용하여 배양기(HERAcell 150, Thermo Electron Corp.)에서 37℃ 와 5% 이산화탄소(CO2)를 유지하며 배양하였다.
민들레 복합식물 발효추출 조성물의 처리가 항산화 효소들의 유전자 발현에 미치는 영향을 검토하기 위하여 HepG2 세포에 민들레 복합식물 발효추출 조성물을 농도별로 처리한 후, 과산화물제거효소-1(superoxide dismutase-1, SOD-1, Cu-Zn SOD), 과산화물제거효소-2(superoxide dismutase-2, SOD-2, Mn SOD)의 mRNA의 발현량을 측정하였다. 24 웰 플레이트(well plate)에 5×105 cells/well의 HepG2 세포를 배양한 후, 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 200 μM 과산화수소(hydrogen peroxide)를 시료와 함께 24시간 처리하였으며, 이후 트립신(trypsin) EDTA를 가한 뒤 원심분리를 하고 상등액을 제거하고, 침전된 세포를 수집하였다. 세포로부터 RNeasy Mini Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 추출된 RNA는 유전체(genomic) DNA를 제거하기 위해 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 처리하였다. 생성된 토탈(total) RNA에 올리고(Oligo) dT 및 dNTP를 혼합하여 65℃에서 5분, 냉동에서 1분 동안 반응하였으며, 원심분리 후 RT buffer, 염화마그네슘(MgCl2), DTT, RNaseOUT 및 Super Script III RT(Invitrogen, USA) 시약을 혼합하여 cDNA synthesis mix를 제조한 후, 첨가하였다. PCR의 반응조건은 25℃에서 10분, 50℃에서 10분, 55℃에서 5분 그리고 4℃에서 유지 순으로 수행하였으며, 이후 대장균(E. coli ) RNase H 1 μl를 첨가하여 37℃에서 20분 동안 반응하였다. 최종적으로 합성된 cDNA는 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다. Real-Time PCR 반응액은 총 23 ㎕ [DNA template, Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, USA), 각각의 -F, -R primer (10 pmol/ ㎕), H2O]가 되도록 하여 반응을 수행하였으며, 검출을 위한 3종류의 프라이머(primer) 염기서열을 하기 표 2에 제시하였다. Real-Time PCR은 Qiagen사의 Rotor-Gene Q 2 plex를 사용하였으며 반응조건은 95℃에서 5분 동안 초기-변성과정(pre-denaturation)을 실시한 후, 95℃에서 5초, 60℃에서 10초씩 40 사이클(cycles)을 반복하고, 60℃에서 95℃까지 3분 동안 증가하는 멜팅(melting) 단계 순으로 수행하였다.
| Primer | Oligonucleotide sequence |
| SOD-1 | 5'-ACGGTGGGCCAAAGGATGAA-3' |
| 5'-TCATGGACCACCAGTGTGCG-3' | |
| SOD-2 | 5'-AGAAGCACAGCCTCCCCGAC-3' |
| 5'-GGCCAACGCCTCCTGGTACT-3' | |
| β-actin | 5'-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3' |
| 5'-GGACTCCATGCCCAGGAAGG-3' |
실험결과, 민들레 복합식물 발효추출 조성물은 과산화수소의 처리에 의해 감소된 과산화물제거효소-1(superoxide dismuatse-1, SOD-1)의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었고(도 1), 민들레 복합식물 발효추출 조성물의 처리가 각각 과산화물제거효소-2(superoxide dismuatse-2, SOD-2)의 mRNA 발현을 증가시켜 간세포에서 산화적 스트레스에 의해 감소된 항산화 효소의 발현을 효과적으로 증진시킴으로써 간세포 보호 기능을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다(도 2). 이는 기존의 발효를 적용하지 않은 민들레 제품보다 이들의 활성이 증가한 결과이기도 하다.
Claims (6)
- 민들레와 엉겅퀴의 혼합물에 프락토올리고당을 첨가한 후, 살균하는 단계(a);
살균된 민들레와 엉겅퀴의 혼합물에 누룩균(Aspergillus oryzae)을 접종한 후, 발효시켜 민들레 복합 발효물을 제조하는 단계(b);
상기 민들레 복합 발효물을 열수추출하여 민들레 복합 발효추출물을 수득 단계(c); 및
상기 민들레 복합 발효추출물에, 치커리, 인진쑥, 둥굴레, 대추 및 천궁이 혼합된 혼합물을 열수추출하여 제조되는 혼합액을 첨가하는 단계(d);를 포함하는 과정으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 간세포 보호 및 간기능 개선을 위한 민들레 복합식물 발효추출 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 누룩균(Aspergillus oryzae)의 접종 조건은,
누룩균(Aspergillus oryzae) 0.1~10중량%를 살균된 민들레와 엉겅퀴의 혼합물에 접종하고, 배양온도 30~40℃, 상대습도 40~80%인 배양실에서 24~72시간 동안 발효하는 것을 특징으로 하는 간세포 보호 및 간기능 개선을 위한 민들레 복합식물 발효추출 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 민들레 복합 발효물은,
민들레 건조물 45~55중량%, 엉겅퀴 건조물 35.9~45.9중량%의 혼합물에 프락토올리고당 8~10.2중량%을 첨가하여 살균한 후, 누룩균(Aspergillus oryzae) 0.05~0.15중량%를 접종하여 발효시켜 제조되는 것을 특징으로 간세포 보호 및 간기능 개선을 위한 민들레 복합식물 발효추출 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 혼합물은,
치커리 23~27중량%, 인진쑥 23~27중량%, 둥글레 18~22중량%, 대추 18~22중량% 및 천궁 8~12중량%가 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 하는 간세포 보호 및 간기능 개선을 위한 민들레 복합식물 발효추출 조성물.
- 제1항의 민들레 복합식물 발효추출 조성물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간세포 보호 및 간기능 개선용 식품 조성물.
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