KR20170000099A - 흑삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물 - Google Patents

흑삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물, 항산화용 건강기능식품 및 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 ROS 소거능을 가지며, 항산화 효소의 활성 증가 및 상기 효소의 단백질 발현 수준을 증가시켜 우수한 항산화 효과를 보이므로 항산화용 조성물, 건강기능식품 및 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

Description

흑삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물 {A COMPOSITION FOR ANTIOXIDANT COMPRISING FERMENTED BLACK GINSENG}
본 발명은 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물, 항산화용 건강기능식품 및 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
과산화물 음이온 라디칼, 히드록실 라디칼 및 과산화수소를 포함하는 ROS(reactive oxygen species)는 암, 염증, 노화 및 동맥경화증(atherosclerosis)과 같은 다양한 질병의 발달과 관련이 있다. 상기 ROS의 축적은 세포에서 지질 과산화, 단백질 불활성화 및 DNA 손상을 일으킨다(Cell Signal 24: 981-990, 2012). 이에 대해 효소적 또는 비효소적 항산화 방어 기전은 ROS를 소거함으로써 산화적 스트레스를 감소시킨다.
독성 자유라디칼 및 ROS에 대해 스스로를 지키기 위하여, 세포는 다양한 항산화 방어기전을 발달시켜 왔다(Toxicology 153: 83-104, 2000). 구체적으로 상기 방어기전은 과산화물 음이온에서 과산화수소로 불변화(dismutation)에 촉매작용을 하는 SOD(superoxide dismutase); H2O2를 산소 및 물 분자로 전환시키는 CAT(catalse); H2O2 및 과산화수소의 분해에 촉매작용을 하는 GPx(glutathione peroxidase)와 같은 항산화 효소가 관여하는 효소적 항산화 방어기전과 특정 비타민 또는 그 밖의 항산화 화합물이 자유라디칼을 소거하고 분자의 산화를 지연시시키는 비효소적 항산화 방어기전이 있다(Int J Mol Sci 13: 2314-2330, 2012).
특히, 파이토케미칼(phytochemical)은 자유라디칼로부터의 산화적 손상에 대해 더 큰 보호효과를 제공한다. 많은 연구들에서 과일, 채소 및 초본에 존재하는 파이토케미칼이 상기 내생 항산화 효소를 유도 또는 활성화시켜 산화적 스트레스에 대한 항산화 효과를 보인다는 내용을 개시하였다(Liver Int 27: 393-399, 2007).
한편, ROS 생산 증가는 DNA 및 지질과 같은 고분자를 산화시켜 직접적으로 세포에 손상을 줄 뿐만 아니라 간접적으로 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호 경로를 유발한다(J Signal Transduct 2011: 792639, 2011). ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 및 JNK(c-Jun N-terminal kinase)와 같은 MAPK 신호 경로는 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인에 의해 생산되는 다양한 신호에 반응하여 세포 증식, 분화 및 세포 사멸에 핵심적인 신호 경로뿐만 아니라 유전자 독성(genotoxic) 및 산화적 스트레스원(stressor)과도 관련되어 있다(Trends Pharmacol Sci 26: 318-326, 2005). MAPK 신호 경로는 또한 ROS 생산 및 항산화 효소 활성 및 발현에 의해 조절될 수 있다고 보고된바 있다(Carcinogenesis 18: 451-456, 1997).
인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 가장 잘 알려진 약초 중 하나로, 항암, 항노화, 항당뇨, 항스트레스 및 신경보호 효과 등의 약리 활성을 가진 것으로 알려져있다(Plant Food Hum Nutr 66: 298-305, 2011). 흑삼은 신선한 인삼을 사용하여 약 85℃에서 수 회 증숙하고 수 회 건조하는 과정(반복적으로 증숙 및 건조)을 거쳐 생산하는 것으로, 제조 과정이 끝나면 검은색으로 변하게 된다(J Ginseng Res 35: 421-428, 2011). 흑삼은 열 처리 및 건조 과정 동안 진세노사이드(ginsenoside)를 포함하는 생활성 화합물 성분이 풍부해지기 때문에 향상된 생활성을 보인다(J Ethnopharmacol 113: 225-232, 2007).
본 발명에서는 상기 흑삼 발효물의 항산화 효과를 확인하였는데, 구체적으로 효소 및 세포 수준에서 상기 흑삼 발효물의 항산화 방어 특성 및 ROS 생산을 억제하는 능력을 조사하였으며, 결과적으로 본 발명의 흑삼 발효물은 항산화 효소의 활성 및 발현을 유도하고 MAPK를 포함하는 상류 단백질 키나아제를 조절하여 우수한 항산화 효과를 가짐을 증명하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "흑삼(black ginseng)"은 인삼을 증숙과 건조 과정을 여러 차례 되풀이하여 얻는 것으로, 특히 3 내지 8년근 인삼, 바람직하게는 5 내지 7년근 인삼을 60 내지 120℃, 바람직하게는 80 내지 100℃에서 약 1 내지 48시간, 바람직하게는 1 내지 12시간 동안 증숙하는 단계 이후, 상기 증숙된 인삼을 30 내지 80℃, 바람직하게는 40 내지 70℃에서 약 1 내지 72시간, 바람직하게는 12 내지 48시간 동안 건조시키는 단계를 수 회, 특히 3 내지 12 회 반복하는 것을 포함하는 공정을 통하여 수득된 흑삼을 포함할 수 있다.
"흑삼 추출물"은 상기 흑삼의 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는, 물 또는 1-100% 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함할 수 있다.
"흑삼 발효물"은 상기 흑삼 추출물을 발효시킨 것을 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 특히 효모를 이용하여 1 내지 72시간, 바람직하게는 12 내지 36시간 20 내지 60℃, 바람직하게는 30 내지 40℃에서 발효시켜 수득하는 발효물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "흑삼 발효물"은 "발효 흑삼"과 동일한 의미로서, 혼용하여 사용될 수 있다.
구체적으로 본 발명에서 정의되는 "흑삼 발효물"은 1) 인삼을 증숙시키고 건조시키는 과정을 반복하여 흑삼을 제조하는 단계; 2) 상기 흑삼을 물로 추출하는 단계; 및 3) 제조된 흑삼 추출물을 효모로 발효시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서는 기존의 흑삼에 들어있는 사포닌 함량을 증대시켜 우수한 항산화 효과를 얻기 위해 상기 흑삼 추출물을 발효시켜 흑삼 발효물을 제조하였다.
상기 효모는 당업계에 공지된 흑삼을 발효시킬 수 있는 효모 균주를 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 세척한 수삼을 70 내지 150℃에서 3 내지 10 시간 동안 증숙하는 제1차 증숙단계;
물에 식용 코팅제를 혼합, 가온하여 점성의 코팅 용액을 만든 후 상기 제1차 증숙단계를 완료 후 수삼의 전면에 상기 코팅 용액이 도포되도록 하는 코팅 단계;
상기 코딩 단계가 완료된 수삼을 70 내지 150℃에서 3 내지 10시간 동안 증숙하고 자외선을 7 ~ 20시간 조사하는 제2차 증숙단계;
상기 제2차 증숙 단계가 완료된 수삼을 70 내지 100℃의 열수로 추출하는 추출단계;
상기 추출단계의 추출물에 알파-아밀라제(α-amylase) 및 셀룰라제(cellulase)를 부가하고 25 내지 65℃에서 2 내지 7시간 동안 효소 처리하는 효소처리단계; 및
상기 효소처리가 완료된 추출물에 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 넣고 20 내지 40℃에서 10 내지 48시간 발효시키는 발효 단계를 포함하는 제조방법으로 흑삼 발효물을 제조하였다.
상기 1차 증숙단계는 이미 알려져 있는 종래의 제조방법(예를 들어 한국등록특허공보 제10-0543862호)과 실질적으로 동일하다.
1차 증숙단계 이후 수행되는 코팅단계는 본 발명에 있어서 매우 중요한 단계로서 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
첫 번째 증숙이 완료된 삼에 코팅을 하여 유효성분 손실 및 벤조피렌의 발생을 억제하는 것으로서, 코팅에 사용되는 물은 일반적인 물을 사용할 수도 있지만 첫 번째 증숙이 완료되고 증숙 용기에 남아 있는 물을 이용하여 코팅하는 것이 더욱 바람직하다.
첫 번째 증숙 용기에 남아 있는 물을 이용하여 코팅하는 것은 첫 번째 증숙 용기에 남아 있는 물에 조사포닌과 진세노사이드와 같은 유효 성분이 많이 함유되어 있기 때문에 이를 재활용하기 위한 것이다.
또한 코팅이 완료되면 증숙에서 발생하는 조사포닌 및 진세노사이드 등의 손실을 막을 수 있는 효과, 이후 여러 차례의 증숙 과정에서 장시간 열에 노출되어 생성되는 벤조피렌의 생성을 간접적으로 열에 노출함으로써 방지할 수 있는 효과 등이 발휘된다.
본 발명에 따른 코팅 단계는 물, 바람직하게는 증숙 용기에 남아 있는 물에 물의 점도를 증가시켜 코팅이 가능하도록 하는 식용 코팅제를 혼합한 후 가온을 하여 점성을 가지는 코팅액을 만든 후 이 코팅액을 이용하여 첫 번째 증숙과 건조가 끝난 삼에 전체 표면에 골고루 도포하면 완성된다.
도포하는 방법에 코팅액에 삼을 완전히 담갔다가 빼고 하는 것을 반복하여 도포하는 방법, 붓을 이용하여 도포하는 방법 등 다양한 방법에 의해서 이루어질 수 있다.
본 발명에서 첫 번째 증숙 후 건조가 완료되고 두 번째 증숙 전에 코팅을 하는 것은 코팅을 하게 되면 증숙에서 발생하는 조사포닌 및 진세노사이드 등의 손실을 막을 수 있는 효과, 이후 여러 차례의 증숙 과정에서 장시간 열에 노출되어 생성되는 벤조피렌의 생성을 간접적으로 열에 노출함으로써 방지할 수 잇는 효과 등이 최대로 발휘되기 때문이다.
또한, 본 발명에 따른 흑삼 제조방법에 있어서, 식용 코팅제로는 식용가능하며 코팅 가능하게 물의 점성을 증가시킬 수 있는 것이라면 특별한 제한 없이 사용가능하나, 바람직하게는 아교, 젤라틴, 한천, 카세인, 알긴산나트륨, 잔탄검, 퀸스시드검, 하이드록시 셀룰로오스 및 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상술한 바와 같은 식용 코팅제의 사용은 이후의 발효 단계에서 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 아미노산을 공급하는 효모 영양제 역할을 하여 발효 역가를 높여주어 조사포닌과 진세노사이드의 체내 흡수율을 높임과 동시에 유효 성분의 함량을 극대화시키는 효과가 있다.
또한, 코팅 용액을 만들기 위한 물과 식용 코팅제의 함량 비율을 물, 바람직하게는 첫 번째 증숙 후 증숙 용기에 남아 있는 물 1ℓ를 기준으로 식용 코팅제 100 내지 500g이 혼합될 수 있다.
상술한 코팅단계 이후에 수행되는 제2차 증숙단계는 제1차 증숙단계에서와 같이 종래의 흑삼 제조방법의 증숙단계와 유사하게 수행되나 증숙 후 자외선을 7 ~ 20시간 조사하는 부분에서 차이를 보인다.
본 발명에서 이용하는 자외선은 전자기파 스펙트럼에서 보라색 띠에 인접한, 사람의 눈에는 보이지 않는 영역으로 320~400nm의 UV-A, 280~320nm의 UV-B, 100~280nm의 UV-C 어떠한 것도 이용 가능하다.
그리고 상술한 자외선 조사 시간은 조사포닌 및 진세노사이드의 함량 증가를 위한 것으로 이에 제한되는 것은 아니나, 특히 7 내지 20시간 동안 자외선을 조사하는 것일 수 있다.
또한 제2차 증숙단계는 벤조피렌의 발생, 유효성분의 손실 등을 고려하여 대략 88 ~ 90℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 이와 같은 제2차 증숙단계는 1회만 이루어지는 것이 아니라 반복되는 것이 바람직한데, 그 반복 횟수는 2 내지 11회 일 수 있며, 특히 5 내지 9회 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이어 추출단계를 설명하기로 한다.
종래의 제조방법은 9번 증숙을 한 후 열수 추출하여 복용할 수 있는 상태로 제조하는 것으로 종료하거나 발효단계를 거치는 경우 증숙 과정 중에 어느 하나 사이에 수삼에 효모를 접종하여 처리하여 발효를 한 후 9번 증숙을 완료하고 열수 추출하여 복용할 수 있는 상태로 제조하는 것으로 종료한다. 그러나 본 발명의 경우에는 제2차 증숙단계를 완료한 후 열수 추출을 한 다음에 이후에 효소 처리 및 발효 단계를 거쳐 제조를 완료하게 되는 차이가 있다.
종래에서와 같이 수삼을 발효하는 것이 아니라 추출물을 발효함으로써 본 발명은 발효 효율을 높일 수 있는 장점이 있다. 열수 추출 단계는 통상의 열수 추출 단계와 실질적으로 동일하다.
이어서 추출단계를 마친 추출물을 효소로 처리하는 효소처리단계를 설명하기로 한다.
상기 효소처리단계는 열수 추출물에 알파-아밀라제(α-amylase) 및 셀룰라제(cellulase)를 부가하고 25 내지 65℃에서 2 내지 7시간 동안 효소처리를 수행하는 단계이다.
알파-아밀라제(α-amylase) 및 셀룰라제(cellulase)는 통상에 판매되는 제품을 구입하여 그대로 이용할 수 있으며, 그 예를 들면, 알파-아밀라제(α-amylase)로는 상표명 FURGAMYL, 셀룰라제(cellulase)로는 VISCOZYME을 들 수 있다.
이와 같은 알파-아밀라제(α-amylase) 및 셀룰라제(cellulase)를 통한 효소처리단계를 통하여 본 발명에 따른 흑삼 발효물 제조 방법은 흑삼 전분의 알파 1, 4 결합과 베타 1, 4 결합을 끊어 발효단계의 발효 역가를 높여주고 전분에 결합된 사포닌을 유리시켜서 사포닌의 장내 흡수율을 높여주는 장점을 가지게 된다.
이어 발효 단계에 대하여 설명한다.
발효 단계를 실시하는 목적은 흑삼의 제조 과정에서 발생하는 유효 성분의 체내 흡수율을 높이며 또한 조사포닌, 진세노사이드와 같은 유효 성분의 함량을 극대화시키기 위한 것으로서 상기 효소처리가 완료된 추출물에 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 넣고 20 내지 40℃에서 10 내지 48시간 발효시키는 형태로 수행된다.
상기 사카로마이시스 세레비시지애(Saccharomyces cerevisiae)는 특별한 제한없이 사용가능하며, 본 발명자는 프랑스 FERMIVIN사에서 시판하는 제품을 구매하여 사용하였다.
발효단계를 시작하기 전에 온도는 80 내지 95℃로 상승시킨 후 3 내지 9시간 동안 방치하여 알파-아밀라제(α-amylase) 및 셀룰라제(cellulase)를 불활성화시키고 다른 균을 살균처리하는 것이 발효 단계의 수행에 바람직하다.
발효 용기로 사용되는 항아리는 사전에 알코올로 소독하고 산소가 통하는 종이로 봉인하고 그 위에 참숯을 올려놓아서 잡균 및 잡냄새의 침입을 막고 깨끗이 멸균한 천연 면소재의 천을 여러 겹 덮어서 보온할 수 있다.
상기 제조 과정을 통하여 제조된 본 발명의 흑삼 발효물은 종래의 방법에 의해 제조된 흑삼과 비교하여 인삼 사포닌 함량이 현저히 증가하였으며(표 1), 이에 따라 우수한 항산화 효과를 가진다.
한편, 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 상기 흑삼 발효물을 HepG2 세포에 처리했을 때 세포독성을 나타내는지를 평가하기 위해, MTT 분석을 이용하여 처리된 흑삼 발효물의 농도(0, 10, 25, 50, 100, 200㎍/ml)에 따른 세포 생존률을 확인하였으며, 그 결과 일정 농도까지는 세포 독성이 없는 것을 확인하였고(도 1), 이와 같이 세포 독성이 없는 50㎍/ml 이하의 농도의 흑삼 발효물을 이용하여 이후의 실험을 수행하였다.
본 발명에서 용어 "사포닌(saponin)"은 특별하게 다른 언급이 없는 한, 진세노사이드, 즉 인삼사포닌과 동일한 의미로 사용되고 있다. 본 발명의 흑삼 발효물은 조사포닌(crude saponin) 함량이 500 내지 3,000㎍/ml 일 수 있고, 바람직하게는 1,000 내지 2,000㎍/ml 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1,200 내지 1,600㎍/ml 일 수 있다.
본 발명에서 용어 "진세노사이드(ginsenoside)"란, 글리코실화된 다마렌(dammarene) 타입의 4환 구조의 트리테르펜(tetracyclic triterpene)으로서, 진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계(Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(Oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물의 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)에 의해 부착되는 당 모이어티(아글리콘)(sugar moieties(aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류된다. 또한, PPD 및 PPT는 다른 수산화 형태(hydroxylation pattern)를 가지고 있다. PPD는 3번, 12번 및 20번 탄소 위치에 -OH기를 가지고 있는 반면, PPT는 3번, 6번, 12번 및 20번 탄소 위치에 -OH기를 가지고 있다. 상기 PPD 및 PPT는 글루코스 및 다른 당으로 글리코실화되어 다양한 진세노사이드로 전환될 수 있다. 대표적인 PPD 타입의 진세노사이드에는 진세노사이드 Rh2, 진세노사이드 Rg3, 화합물 K, 진세노사이드 F2 및 진세노사이드 Rd를 포함하며, 대표적인 PPT 타입의 진세노사이드에는 진세노사이드 F1, Rg1, Re, Rh1 및 Rg2가 있다.
본 발명의 흑삼 발효물은 표 1에 기술한 바와 같이 다양한 종류의 진세노사이드(ginsenoside)를 유효성분으로 함유할 수 있는데, 구체적으로 이에 제한되는 것은 아니나 특히 진세노사이드 Rg2, Rg3, Rh1, Rh2 및 Rf를 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 내지 5㎍/ml의 진세노사이드 Rg2, 10 내지 50㎍/ml의 진세노사이드 Rg3, 5 내지 30㎍/ml의 진세노사이드 Rh1, 0.1 내지 1㎍/ml의 진세노사이드 Rh2, 및 0.5 내지 3㎍/ml의 진세노사이드 Rf를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 2 내지 3㎍/ml의 진세노사이드 Rg2, 20 내지 30㎍/ml의 진세노사이드 Rg3, 10 내지 20㎍/ml의 진세노사이드 Rh1, 0.2 내지 0.8㎍/ml의 진세노사이드 Rh2, 및 1 내지 2㎍/ml의 진세노사이드 Rf를 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 2.86㎍/ml의 진세노사이드 Rg2, 24.52㎍/ml의 진세노사이드 Rg3, 12.62㎍/ml의 진세노사이드 Rh1, 0.63㎍/ml의 진세노사이드 Rh2, 및 1.32㎍/ml의 진세노사이드 Rf를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "항산화"란, 좁은 범위로는 체내에서 생성되는 자유라디칼, 상기 자유라디칼로부터 생성되는 과산화수소 또는 과산화물, 상기 과산화수소로부터 생성되는 하이드록시 라디칼의 생성 또는 반응을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미하고, 넓은 범위로는 자연계에서 발생하는 산화반응의 생성을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항산화는 좁은 범위의 항산화로서 이해되고, 주로 세포 수준에서 발생되는 자유라디칼 또는 과산화수소의 생성 또는 반응을 억제, 감소 또는 제어하는 작용으로서 이해될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
한편, 본 발명의 조성물은 흑삼 발효물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 1 종 이상의 유효성분을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 흑삼 발효물의 ROS 소거 활성을 측정한 결과 H2O2가 있는 조건뿐만 아니라 없는 조건에서도 모두 농도 의존적으로 ROS를 소거하는 것을 확인하였다(도 2). 이와 같이 본 발명의 흑삼 발효물은 우수한 ROS의 소거 활성을 가지므로 흑삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 항산화 용도로 이용될 수 있다.
또한, 상기 발효물은 항산화 효소의 활성을 증가시키거나 항산화 효소의 단백질 발현을 증가시킬 수 있다. 구체적으로 상기 항산화 효소는 CAT(catalase), GPx(glutathione peroxidase) 및 Mn-SOD(manganese-superoxide dismutase)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 효소일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 흑삼 발효물을 HepG2 세포에 전처리 한 후 H2O2를 처리하였을 때 CAT, GPx 및 Mn-SOD의 활성이 대조군에 비해 증가되었으며(도 3), 상기 효소들의 단백질 발현 수준 역시 증가하는 것을 확인하였다(도 4).
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 이와 같은 작용 기전을 밝히기 위하여, 흑삼 발효물을 처리하였을 때 항산화 효소 단백질의 발현과 관련이 있는 MAPK 단백질의 인산화를 확인한 결과 농도의존적으로 MAPK 단백질의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다(도 5). 결론적으로 본 발명의 흑삼 발효물의 항산화 효과는 MAPK 단백질의 인산화를 억제하고, CAT, GPx 및 Mn-SOD와 같은 항산화 효소의 활성 및 효소 단백질의 발현 수준을 증가시키기 때문일 수 있다는 것을 확인하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 포함하는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.
흑삼 발효물 및 항산화에 대해서는 상기 기술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하며, 경우에 따라 건강식품, 기능성식품, 건강보조식품 등의 용어와 호용될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 건강기능식품은 항산화 활성을 나타내어 이를 섭취한 개체의 건강을 유지, 개선 또는 회복에 유용한 효과를 얻기 위하여 제조될 수 있으며, 이들의 제품 형태는 바람직하게는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 특별히 이제 제한되지는 않는다.
흑삼 발효물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 흑삼 발효물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
흑삼 발효물 및 항산화에 대해서는 상기 기술한 바와 같다.
바람직한 하나의 실시예에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물은 기능성 화장품의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 기능성 화장품은 다양한 기능성 화장품 중에서 피부세포에 항산화 효과를 부가하는 제품을 의미하고, 바람직하게는 흑삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 기능성 화장품이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않고, 상기 항산화용 기능성 화장품에 포함되는 흑삼 발효물의 함량 역시 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 기능성 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있는데, 바람직하게는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있고, 보다 상세하게는 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 로션, 젤, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 연고, 스틱, 패취, 스프레이 또는 파우더의 제품으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 ROS 소거능을 가지며, 항산화 효소의 활성 증가 및 상기 효소의 단백질 발현 수준을 증가시켜 우수한 항산화 효과를 보이므로 항산화용 조성물, 건강기능식품 및 화장료 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 HepG2 세포에서 흑삼 발효물(fermented black ginseng)의 세포 독성 효과를 나타낸 것이다. 세포에 24시간 동안 DW 또는 흑삼 발효물(10-200μg/ml)을 처리하고, MTT 분석을 통해 세포 생존성을 확인하였다. 데이터는 6 번의 독립적인 실험의 평균 ± SD(standard deviation) 값을 나타낸다. 상기 값은 변량 분석 이후 Bonferroni's test를 이용하여 대조군과 비교하였다. 통계적 유의성은 *P<0.05이다.
도 2는 HepG2 세포에서 H2O2(hydrogen peroxide)로 유도된 ROS(reactive oxygen species) 생산에 대한 흑삼 발효물(fermented black ginseng)의 효과를 나타낸 것이다. 세포를 DCF-DA로 1시간 동안 전처리하고 H2O2가 있거나 없는 조건에서 DW(대조군) 또는 흑삼 발효물을 6시간 동안 처리하였다. 데이터는 3 번의 독립적인 실험의 평균 ± SD(standard deviation) 값을 나타낸다. 상기 값은 변량 분석 이후 Bonferroni's test를 이용하여 대조군과 비교하였다. H2O2가 없을 때 대조군에 대한 통계적 유의성은 *P<0.05이고, H2O2가 존재할 때 대조군에 대한 통계적 유의성은 #P<0.05이다.
도 3은 H2O2(hydrogen peroxide)를 처리한 HepG2 세포에서 CAT(catalase), GPx(glutathione peroxidase) 및 Mn-SOD(manganese-superoxide dismutase) 활성에 대한 흑삼 발효물(fermented black ginseng)의 효과를 나타낸 것이다. 흑삼 발효물 처리는 H2O2를 처리한 HepG2 세포에서 CAT, GPx 및 Mn-SOD의 활성을 증가시키는 경향을 보인다. 데이터는 3 번의 독립적인 실험의 평균 ± SD(standard deviation) 값을 나타낸다. 상기 값은 변량 분석 이후 Bonferroni's test를 이용하여 대조군(DW)과 비교하였다. 대조군과의 통계적 유의성은 *P<0.05이고, H2O2 처리 그룹과 통계적 유의성은 #P<0.05 이다.
도 4는 H2O2(hydrogen peroxide)를 처리한 HepG2 세포에서 CAT(catalase), GPx(glutathione peroxidase) 및 Mn-SOD(manganese-superoxide dismutase) 단백질 발현에 대한 흑삼 발효물(fermented black ginseng)의 효과를 나타낸 것이다. 세포에 DW(대조군) 또는 흑삼 발효물(10, 25 또는 50μg/ml)을 1시간 동안 전처리한 후 H2O2를 6시간 동안 처리하였다. 밴드 사진은 유사한 결과를 보이는 3 번의 독립적인 실험의 대표 사진을 보여준다. 상기 값은 변량 분석 이후 Bonferroni's test를 이용하여 대조군(DW)과 비교하였다. 대조군과의 통계적 유의성은 *P<0.05이고, H2O2 처리 그룹과 통계적 유의성은 #P<0.05 이다.
도 5는 H2O2(hydrogen peroxide)를 처리한 HepG2 세포에서 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 인산화에 대한 흑삼 발효물(fermented black ginseng)의 효과를 나타낸 것이다. 세포에 DW(대조군) 또는 흑삼 발효물(10, 25, 50μg/ml)을 1시간 동안 전처리한 뒤 H2O2를 1시간 동안 처리하였다. 밴드 사진은 유사한 결과의 3 번의 독립적인 실험의 대표 사진이다. 상기 값은 변량 분석 이후 Bonferroni's test를 이용하여 대조군(DW)과 비교하였다. 대조군과의 통계적 유의성은 *P<0.05이고, H2O2 처리 그룹과 통계적 유의성은 #P<0.05 이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1 : 흑삼 및 흑삼 발효물의 제조
금산에서 생산되어 유통되는 5년근 삼을 구입한 후 삼을 흙만 없어지도록 물로 가볍게 세척을 한 후 인삼 증숙기에 넣고 123℃에서 5시간 동안 가압상태에서 1차 증숙하였다. 이어서 1차 증숙된 삼을 60℃가 유지되는 건조실에서 약 12시간 동안 건조하였다.
이어서 1차 증숙 후 증숙기에 남아 있는 물에 물을 더 부가하여 1ℓ로 한 다음 여기에 젤라틴 300g을 부가한 후 식용 코팅제가 용해되거나 물에 잘 풀어지도록 교반하면서 가온한 다음 이를 약 40℃로 식힌 후 1차 증숙이 완료된 삼을 식용 코팅제가 담긴 용기에 넣어 삼 전면에 도포되도록 한 다음 꺼내고 어느 정도 건조된 다음 다시 담기는 과정을 4회 반복하여 코팅 단계를 완성하였다.
다음으로 코팅 완료된 삼을 82℃에서 9시간 증숙한 다음 자외선을 14시간 동안 조사하는 2차 증숙단계를 총 8번 반복하여 총 9회의 증숙단계를 수행하였다.
이어서 9번 증숙한 삼을 곱게 분쇄한 다음 85℃의 열수 5ℓ로 72시간 동안 추출하여 흑삼 추출물을 제조하였다.
그 후 상기 추출물을 55℃로 낮춘 다음 알파-아밀라제(α-amylase) 및 셀룰라제(cellulase) 각각 30g을 부가한 후 3시간 동안 효소처리를 하였다.
효소처리 후 85℃까지 상승시킨 다음 6시간 동안 이 온도를 유지하여 효소를 불활성화시키고 추출물을 살균하였다.
이어서 34℃로 온도를 낮춘 다음 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 넣고 24시간 동안 발효한 다음, 온도를 85℃로 상승시켜 24시간 동안 유지하여 살균처리하여 본 발명에 따른 흑삼 발효물 제조를 완료하였다.
상기 흑삼 발효물의 주요 성분은 LC/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)법을 이용하여 확인하였으며 하기 표 1에 나타내었다.
Ginsenosides Concentration(㎍/ml)
Crude saponin 1,440
Ginsenoside Rg2 2.86
Ginsenoside Rg3 24.52
Ginsenoside Rh1 12.62
Ginsenoside Rh2 0.63
Ginsenoside Rf 1.32
실시예 2 : 시약
KCN(potassium cyanide, 60178), H2O2, 설프아닐아마이드(sulfanilamide, S9251), N-(1-나프틸)에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, P7626), 니트로블루 테트라졸리움염(nitroblue tetrazolium salt), 잔틴(xanthine), 쿠퍼 클로라이드(copper chloride), 베이커 효모(baker's yeast) 유래 글루타티온 환원제(Saccharomyces cerevisiae; 단백질 100-300 U/mg) 및 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium, inner salt)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. DCF-DA(2'7'-dichlorohydrofluorescein diacetate)는 Molecular Probes사(Eugene, OR, USA)에서 구입하였다. CAT(14097), pERK(9101), pJNK(9251), pp38(9211) 및 홍당무과산효소 결합 항 토끼 IgG(7074) 항체는 Cell Signaling Technology사(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. SOD(sc-18504), GPx(sc-30147), β-액틴(sc-1616) 및 홍당무과산효소 결합 항 염소 IgG(sc-2350) 항체는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
실시예 3 : 세포 배양
HepG2 인간 간세포암종(hepatocellular carcinoma) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 상기 세포는 37℃, 5% CO2 조건으로 10% FBS(fetal bovine serum), 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신(모두 HyClone, Logan, UT, USA), 1% 필수아미노산 및 1% 글루타맥스(glutamax)(모두 Gibco, Grand Island, NY, USA)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's minimum essential medium)에서 배양하였다. HepG2 세포가 80-90% 가득 찼을 때 세포를 회수하여 계대배양하였다.
실시예 4 : 웨스턴 블랏 분석
세포를 DW(대조군), 비타민 C(양성 대조군), 또는 흑삼 발효물(10, 25 또는 50μg/ml)로 1시간 동안 전처리 한 후 H2O2로 1시간 처리하였다. 그 다음, 상기 세포를 차가운 PBS(pH 7.4)로 3회 세척하고 10mM Tris-HCL, 50mM 소듐 클로라이드(sodium chloride), 30mM 소듐 파이로포스페이트(sodium pyrophosphate), 50mM 소듐 플루오라이드(sodium fluoride), 100μM 소듐 오쏘바나데이트(sodium orthovanadate), 2mM 아이오도아세트산(iodoacetic acid), 5mM ZnCl2, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 0.5% Triton X-100을 함유하는 전체 세포 용해 완충액(pH 7.4) 200μl로 세포를 용해시켰다. 상기 세포 용해물을 격렬히 교반시키고, 소니케이터로 10초 동안 균질화한 뒤 얼음에 1시간 동안 두었다. 상기 균질물을 4℃에서 10분간 13,000×g로 원심분리하였다. 상층액을 수거하고 BCA 단백질 분석(Pierce Biotechnology)으로 확인한 동량의 총 단백질을 2X 로딩 완충액과 혼합한 뒤 95℃에서 5분간 가열하였다. 각 세포 용해물에서 동량의 단백질(30μg)을 12% SDS-폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔 전기영동으로 분리시키고 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 상온에서 1시간 동안 5% 무지방 건조 우유가 함유된 1X PBST 완충액(PBS에 0.1% Tween-20)으로 블락킹한 뒤 적절한 일차 항체와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 일차 항체와 반응 시킨 뒤, 상기 멤브레인을 PBST로 3회 세척하고, 상온에서 한 시간 동안 홍당무과산효소가 결합된 항-토끼 또는 항-염소 항체와 함께 인큐베이션 한 뒤, PBST로 다시 3회 세척하였다. 최종 검출은 ECLTM(enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블라팅 시약(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)으로 수행하였다.
실시예 5 : 통계 분석
데이터는 마이크로소프트 엑셀을 이용하여 평균 ± SD(standard deviation) 값으로 나타내었다. 상기 값은 변량 분석(analysis of variance) 이후 Bonferroni's test(GraphPad Prism software version 5.01; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 이용하여 대조군과 비교하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05 이다.
실험예 1 : 흑삼 발효물의 세포 독성 확인
HepG2 세포에서 흑삼 발효물의 세포 독성 효과를 평가하기 위해 MTT 분석을 이용하였다. HepG2 세포를 24-웰 플레이트에 1×105 세포/웰로 접종하고 24시간 배양 후, 상기 세포에 24시간 동안 물(DW; 대조군) 또는 다양한 농도의 흑삼 발효물(10, 25, 50, 100 및 200㎍/ml)을 처리하였다. 그 다음, 1mg/ml의 MTT 50μl를 첨가하고 상기 플레이트를 4시간 더 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 200μl를 각 웰에 첨가하였다. 상온에서 10분간 반응시킨 후, PowerWave XS 마이크로플레이트 리더(BioTek Instruments, Winooski, VA, USA)를 이용하여 570nm의 OD(optical density)로 측정하여 포르마잔(formazan) 산물을 검출하였다. 상기 데이터는 무처리 대조군과 비교하여 세포 생존률 퍼센트로 나타내었다.
그 결과 10 내지 200μg/ml 농도의 흑삼 발효물 처리는 농도 의존적으로 세포 생존률을 억제하였다(도 1). 50μg/ml 흑삼 발효물을 처리한 세포의 생존률은 대조군 세포와 비교하여 약 70%였으나, 25μg/ml 농도까지는 세포 생존률에서 유의적인 차이를 보이지는 않았다. 상기 세포 생존률 데이터를 기초로, 50μg/ml 이하 농도의 흑삼 발효물을 사용하여 다음 실험을 수행하였다.
실험예 2 : 흑삼 발효물의 ROS 생성 억제 효과 확인
흑삼 발효물이 ROS 생성 억제 효과를 보이는지 여부를 확인하기 위하여 DCF-DA 분석으로 H2O2를 처리한 HepG2 세포 내 ROS 수준을 확인하였다. HepG2 세포를 1×104 세포/웰로 96-웰 어두운 플레이트에 접종하고, 37℃의 암 조건에서 1시간 동안 DCF-DA(DMSO에 용해) 20μM로 전처리하였다. 차가운 1X PBS(phosphate-buffered saline)로 세척한 후, 상기 세포에 1mM H2O2가 있거나 없는 조건에서 DW(대조군), 비타민 C(양성 대조군), 또는 다양한 농도의 흑삼 발효물(5, 10, 25 및 50μg/ml)을 12시간 처리하였고, 다시 차가운 1X PBS로 2회 세척하였다. 형광은 형광 다검출 리더기(BioTek Instruments)를 이용하여 485nm 여기 및 535nm 방사 조건으로 검출하였다. 항산화제로 잘 알려져 있는 비타민 C(100μg/ml)를 양성 대조군으로 사용하였다.
그 결과 세포에 1mM H2O2를 처리하였을 때, DW를 처리한 대조군과 비교하여 ROS 생성이 2.1배 증가하는 것이 관찰되었다. 반면에 HepG2 세포에서 H2O2가 존재하는 조건에서 흑삼 발효물 전처리는 농도 의존적으로 H2O2 매개 ROS 생산을 감소시켰으며, 심지어 H2O2가 없는 조건에서도 흑삼 발효물의 농도 의존적 효과가 관찰되었다(도 2). 이러한 결과는 흑삼 발효물이 세포에서 과도하게 생성된 ROS를 직접적으로 소거할 수 있는 항산화제로서 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.
실험예 3 : 항산화 효소 활성에 대한 흑삼 발효물의 효과
흑삼 발효물의 항산화 활성이 세포의 항산화 효소 활성이 증가되어 나타난 것인지를 조사하기 위해, H2O2를 처리한 HepG2 세포에서 CAT, GPx 및 Mn-SOD를 포함하는 항산화 효소의 활성을 측정하였다. 먼저, HepG2 세포를 2×105 세포/웰로 6-웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양한 후, 상기 세포에 24시간 동안 DW(대조군), 비타민 C(양성 대조군), 또는 다양한 농도의 흑삼 발효물(10, 25 및 50㎍/ml)을 처리하였다. CAT 및 GPx 효소 분석을 위해, 상기 세포를 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 1ml에서 균질화시키고, 그 후 4℃에서 20분, 12,000 rpm으로 원심분리하였다. Mn-SOD(manganese-superoxide dismuatse) 분석을 위해, 세포를 65mM 인산 완충액(pH 7.8) 1ml에서 균질화시키고, 그 후 4℃에서 20분, 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 상기 CAT 및 GPx 활성 확인에서는 세포 용액 상층액을 사용하였고, Mn-SOD 활성 확인에서는 세포 펠렛을 사용하였다. 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 BCA 단백질 분석(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 이용하여 확인하였다. 결과는 상응하는 대조군과 비교하여 단백질 mg 당 효소 활성으로 나타내었다.
먼저 CAT 활성을 확인하는 구체적인 방법으로, 반응 혼합물은 최종 1.0 ml 부피의 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 3% (vol/vol) H2O2 12μl 및 세포 용해물 20μg을 포함한다. 상기 표본을 37℃에서 5분간 인큐베이션하고 240nm에서 5분 동안 표본의 흡광도를 관찰하였다. 흡광도의 변화는 H2O2의 분해 수준에 비례한다.
그 다음 GPx 활성을 확인하는 구체적인 방법으로, 세포질 분획을 포함하는 상층액 총 20μg을 1mM EDTA, 1mM NaN3(sodium azide), 5mM GSH, 1mM NADPH 및 1 유닛 글루타티온(glutathion) 환원제와 함께 상온에서 5분동안 인큐베이션시켰다. 2.5mM의 H2O2 25μl를 첨가하여 반응을 시작시켰다. GPx 활성은 340nm에서 NADPH 산화율로서 측정하였다.
마지막으로 Mn-SOD 활성을 확인하는 구체적인 방법으로, 잔류 펠렛(즉, 미토콘드리아 분획)을 0.1% 트리톤 X-100에 용해시키고 Mn-SOD 활성을 확인하는데 사용하였다. Mn-SOD 활성 분석을 위해, 4mM KCN 용액 60μl를 Cu/Zn-SOD(copper- and zinc-containing superoxide dismutase)를 억제하도록 분석 혼합액에 첨가하였다. 상기 표본은 37℃에서 10분간 75mM Na-잔틴(xanthine) 15μl 및 10mM 하이드록실아민 하이드로클로라이드(hydroxylamine hydrochloride)로 전처리하였다. 그 다음, 잔틴 옥시다아제 0.1 유닛을 첨가하고 상기 표본은 37℃에서 20분간 추가적으로 인큐베이션시켰다. 1% 설프아닐아마이드(sulfanilamide) 및 0.02% 에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(ethylenediamine dihydrochloride)를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 상온에서 20분 동안 세워둔 후, 450nm에서 최종 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 효소 활성은 단백질 mg 당 유닛으로 나타내었다.
그 결과, 세포에 H2O2(1mM)를 단독으로 처리했을 때, CAT, GPx 및 SOD-2의 활성은 DW를 처리한 대조군의 수준보다 현저히 감소하였다. 하지만, 흑삼 발효물 처리는 상기 세 효소의 활성을 증가시켰다(도 3). 특히, 50μg/ml의 흑삼 발효물을 처리한 후 CAT 및 GPx의 활성 수준은 대조군(DW)의 수준보다 훨씬 높았으며 심지어 항산화제로 잘 알려진 비타민 C(양성 대조군; 100μg/ml) 처리에서 관찰된 수준보다도 높은 것을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명의 흑삼 발효물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항산화 효소의 활성을 증가시키는 우수한 효능이 있어 항산화용 조성물로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 4 : 항산화 효소 발현에 대한 흑삼 발효물의 효과
효소 활성 촉진 효과에 더하여, HepG2 세포에서 상기 항산화 효소의 단밸질 발현에 대한 흑삼 발효물의 효과를 확인하였다. 세포에 H2O2를 단독으로 처리했을 때, CAT, GPx 및 Mn-SOD 단백질 발현 수준은 DW를 처리한 대조군과 비교하여 감소하였다. 하지만, 흑삼 발효물 처리는 농도 의존적으로 상기 효소들의 단백질 발현을 회복 및 증가시켰다(도 4). 결론적으로 본 발명의 흑삼 발효물은 CAT, GPx 및 Mn-SOD의 활성을 증가시킬 뿐만아니라 상기 효소들의 발현 수준도 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 흑삼 발효물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항산화 효소의 활성을 증가시키고 효소의 발현 수준을 증가시키므로 항산화용 조성물로 이용될 수 있다.
실험예 5: MAPK 인산화에 대한 흑삼 발효물의 효과
상기 흑삼 발효물에 의해 유도된 항산화 효소 발현 증가 효과가 MAPK 경로와 관련이 있는지를 확인하기 위해, ERK, JNK 및 p38과 같은 MAPK 하위군(subfamily)의 인산화 수준을 조사하였다. H2O2를 단독으로 처리하였을 때 모든 MAPK의 인산화가 촉진된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 이와 같이 H2O2에 의해 촉진된 MAPK의 인산화는 흑삼 발효물의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하였다(도 5). 결론적으로 흑삼 발효물에 의해 항산화 효소의 발현이 증가하는 것은 MAPK의 인산화를 억제하여 나타나는 효과라는 것을 알 수 있다.
항산화 효소 활성 유도는 다양한 산화적 스트레스 관련 질병에 대응하여 사람의 건강을 지키기 위한 우수한 방어 전략으로서 고려될 수 있다. 따라서, 그동안 수 많은 생활성 식물 물질들이 항산화 능력이 있는지 연구되었는데, 본 발명에서는 ROS 생산, 항산화 효소의 활성 및 발현의 조절, 및 MAPK를 포함하는 신호 경로를 통하여, HepG2 세포에서 H2O2로 유도된 산화적 스트레스에 대한 흑삼 발효물의 보호 효과를 처음으로 밝혔으며, 이에 본 발명의 흑삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 우수한 항산화 효과를 가져 항산화용 조성물로 이용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발효물은 진세노사이드(ginsenoside) Rg2, Rg3, Rh1, Rh2 및 Rf를 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 발효물은 1,000 내지 2,000㎍/ml의 조사포닌(crude saponin)을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 발효물은 1 내지 5㎍/ml의 진세노사이드 Rg2, 10 내지 50㎍/ml의 진세노사이드 Rg3, 5 내지 30㎍/ml의 진세노사이드 Rh1, 0.1 내지 1㎍/ml의 진세노사이드 Rh2, 및 0.5 내지 3㎍/ml의 진세노사이드 Rf을 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 발효물은
    1) 인삼을 증숙시키고 건조시키는 과정을 반복하여 흑삼을 제조하는 단계;
    2) 상기 흑삼을 물로 추출하는 단계; 및
    3) 제조된 흑삼 추출물을 효모로 발효시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항산화는 항산화 효소의 활성을 증가시키거나 항산화 효소의 단백질 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항산화 효소는 CAT(catalase), GPx(glutathione peroxidase) 및 Mn-SOD(manganese-superoxide dismutase)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것인, 조성물.
  9. 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 포함하는 항산화용 건강기능식품.
  10. 흑삼 발효물(fermented black ginseng)을 포함하는 항산화용 화장료 조성물.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190010068A (ko) * 2017-07-20 2019-01-30 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 흑삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부주름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물
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