KR101204875B1

KR101204875B1 - 꾸지뽕 발효산물을 함유하는 기능성 소스 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101204875B1
Application number: KR1020110120614A
Authority: KR
Inventors: 김병돈; 김재원
Original assignee: 김병돈; 김재원; 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2012-11-27

Abstract

본 발명은 구지뽕 발효산물을 이용하여 제조된 기능성 소스 및 이들의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항균 및 항산화 작용, 항당뇨, 항고지혈증, 항고혈압, 항세포독성 등의 다양한 효능을 가지는 구지뽕 열매의 발효산물을 포함하는 기능성 소스 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.

Description

꾸지뽕 발효산물을 함유하는 기능성 소스 및 그 제조방법{A functional sauce containing Fermentation Products of Cudrania tricuspidata and Manufacturing method thereo}

생활환경과 식생활의 서구화로 암, 심장질환, 동맥경화, 고혈압 등과 같은 다양한 생활습관병이 증가하고 있다. 이러한 질병의 원인으로 자유라디칼과의 관련성이 대두됨에 따라 이들에 의한 산화작용으로부터 생체를 보호하고 노화를 예방하기 위한 항산화 방어계를 강화시키는 생리활성 물질의 개발에 대한 연구가 진행되고 있다.

천연물은 대부분 식물, 동물, 미생물의 2차 대사산물과 1차 대사산물의 일부 (polysaccharide 등) 및 광물로 이루어져 있으며 이러한 천연물의 유용성을 평가하여 천연물 의약, 건강기능성 식품, 천연물 화장품, 천연 살충제 등의 고부가가치의 상품으로 개발하는 천연물산업(Natural Products Industry)에 대한 관심이 고조되어 이미 선진 각국에서는 이 분야의 연구개발에 역점을 두고 각종 천연물의 제품화와 산업화에 역량을 집중하고 있는 추세이다. 최근에는 항생제 대체물질로 이러한 천연물 중에서 유익미생물이나 그의 대사산물을 이용한 환경친화적인 바이오 원료를 이용한 항균, 항생제 대체물질에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.

발효는 최근 생물전환기술(bioconversion)이라는 명칭으로 활용되는 식품가공기술로 항암, 콜레스테롤 저하, 혈압강하, 혈전저해, 설사 방지 등의 생균제 효과에 대한 연구 결과가 계속 발표되고 있는 차세대 기술이다. 세계보건기구 산하 Codex에서는 유전자재조합 미생물을 이용한 생균제 사용에 대한 규정을 마련하기로 합의한 바 있어 안전성을 인정받은 발효 미생물은 21세기 바이오 산업의 핵심이 될 수 있으며, 이를 이용한 미생물의 산업적 가능성은 앞으로 하나의 새로운 산업분야로 자리 잡을 전망이다.

전통발효식품에 관여하는 고초균은 호기성 균으로 다양한 가수분해효소를 생산하면서 콩 발효식품에 크게 기여하고 있다. 발효과정을 거치면서 고초균에 의해 단백질 가수분해 효소, 탄수화물 가수분해 효소, 혈전분해 효소, 기능성 펩타이드 및 고분자 점질물 등의 생리활성물질을 생산된다(Kwon HY, Kim YS, Kwon GS, Kwon CS, Sohn HY. (2004) Isolation of immuno-stimulating strain Bacillus pumilus jb-1 from Chungkook-jang and fermentation characteristics of jb-1. Kor J Microbial Biotechnol 32: 291-296). 발효숙성 시 고초균이 생산하는 효소에 의하여 단백질과 당질이 분해되어 levan form fructan과 glutamic acid가 중합된 poly-γ-glutamic acid(PGA)로 구성된 끈끈한 점질물이 생성되며(Youn HK, Choi HS, Hur SH, Hong JH. (2001) Antimicrobial activities of viscous substance form Chongkukjang fermented with different Bacillus spp. J Fdhyg Safety 16: 188-193), 이러한 점질물은 발효제품의 품질특성에 중요한 영향을 미친다. 특히 PGA는 미생물 고분자물질의 일종으로 면역증진 효과, 항암효과 등의 생리활성기능을 가지고 있으며 또한 탄수화물과 단백질을 주로 분해하여 생성되는 생리활성 물질은 제품의 품질에 결정적인 영향을 줄뿐만 아니라 생물전환기술에 따른 다당류체, 올리고당, 아미노산류, 펩타이드류, 유기산류, 폴리페놀류 등의 유효 성분의 생성 및 증가에 따라 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다(Lee TS, Choi JY. (2005) Volatile flavor components in mash of Takju prepared by suing Aspergillus kawachii nuruks. Korean J Food Sci Technol 37: 944-950).

한편, 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata)는 뽕나무과에 속하는 낙엽교목으로 예로부터 나무 잎, 줄기, 뿌리는 습진, 폐결핵, 만성 요통, 타박상, 급성관절염 등의 하방치료에 사용되었으며, 동의보감에서는 꾸지뽕 열매가 강장, 자양, 숙취해소, 간과 신장보호효과 등이 있는 것으로 보고되었다. 또한 항균 및 항산화 작용, 항당뇨, 항고지혈증, 항고혈압, 항세포독성 등 주로 다양한 기능성 소재활용에 관한 연구가 보고되었다(Ottersen T, Vance B, Doorenbos NJ, Chang BL, El-Feraly FS. (1997) The crystal structure of cudranone, 2,6,3'-trihydroxy-4-methoxy-2'-(3-methyl-2-butenyl)-benzophenone: A new antimicrobial agent from Cudrania chochinchinensis. Acta Chem Scnad 31: 434-436; Chen F, Nakashima N, Kimura I, Kimura M. (1995) Hypoglycemic activity and mechanisms of extracts from mulberry leaves (folium mori) and cortex mori radicis in streptozotocin-induced diabetic mice. Ykugaku Zasshi 115: 476-482; Cha JY, Kim HJ, Jun BS, Cho YS. (2000) Effects of water extract of leaves from Morus alba and Cudrania tricuspidata on the lipid concentration of serum and liver in rats. J Korean Soc Agric Chem Biotechnol 43: 303-308; Lee IK, Kim CJ, Song KS, Kim HM, Koshino H, Uramoto M, Yoo ID. (1996) Cytotoxic benzyldihydroflavonols from Cudrania tricuspidata. Phytochem 41: 213-216: 1996).

최근 꾸지뽕 열매 당단백질을 활용한 생리활성이 보고되고 있으나(Oh PS, Lee HJ, Lim KT. (2009) Inhibitory effect of glycoprotein isolated from Cudrania tricuspidata bureau on histamine release and COX-2 activity in RBL-2H3 cells. Korean J Food Sci Technol 41: 405-412) 발효를 통한 생물전환기술로 기능성을 증대시킨 연구는 많이 이루어져 있지 않으며 꾸지뽕열매를 이용하여 기호성이 높고, 다양한 요리에 잘 어울릴 수 있는 소스류는 개발되지 않았다.

이에 본 발명자들은 바실러스 속 균주(고초균)를 이용하여 꾸지뽕열매를 발효시킴으로써 기호성을 떨어트리는 요소들을 저하시키고 항균 및 항산화 작용, 항당뇨, 항고지혈증, 항고혈압, 항세포독성 등의 다양한 기능성을 향상시키며, 향미를 개선할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 꾸지뽕 발효 산물을 함유하는, 다양한 효능을 가지는 기능성 소스 및 이의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 꾸지뽕 발효 산물 및 이의 제조 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 해결하기 위하여 꾸지뽕 나무 유래 추출물 하 배양시킨 바실러스 속 균주를 꾸지뽕 나무 열매 분말에 접종하여 고체 발효시킨 산물 및 이의 제조방법을 제공한다.

이 때, 상기 꾸지뽕 나무 유래 추출물은 꾸지뽕 나무 열매인 것이 바람직하고, 상기 바실러스 균주는 꾸지뽕 나무 열매 분말에 0.1~1.0%(v/w)로 접종되는 것이 바람직하다. 특히, 상기 고체 발효 산물은 농축, 동결건조 및 분말화되어 물과 혼합함으로써 꾸지뽕 소스를 제조할 수 있다.

한편, 사용되는 바실러스 속 균주는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸미루스(Bacillus pumilus), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)을 사용한다.

상기 꾸지뽕 소스는 항산화, 항균, 항당뇨, 항고지혈증, 항고혈압 및 항세포독성 효능을 가진다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 다음을 포함하는, 앞서 설명한 꾸지뽕 고체 발효 산물 제조 방법을 제공한다:

(i) 꾸지뽕 나무 추출물을 건조 및 분말화하는 단계;

(ii) 바실러스 속 균주를 접종하고 배양하는 단계; 및

(iii) 배양된 균주를 분리하여 꾸지뽕 나무열매 분말에 접종하고 고체 발효시키는 단계.

이 때,

(i)단계에서, 꾸지뽕 나무 유래 추출물은 꾸지뽕 나무 열매를 사용하는 것이 바람직하고,

(ii)단계에서, 바실러스 속 균주는 쏘이 브로스(soy broth)에 접종되어 30~50℃에서 24~36시간 동안 배양될 수 있으며,

(iii)단계에서, 배양된 균주의 접종은 꾸지뽕 나무열매 분말에 0.1~1.0%(v/w)로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 이 단계에서, 고체 발효시 꾸지뽕 나무열매 분말의 4~6 중량%의 증류수를 혼합하고, 30~50℃, 상대습도 70~90%에서 48~72시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 특히, 일 구체예로서, 상기 고체 발효는 폴리에틸렌 필름을 덮은 용기 내에서 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 또 다른 관점에서 다음을 포함하는 꾸지뽕 소스용 분말의 제조 방법을 제공한다

(a) 앞서 설명한 방법으로 수득한 고체 발효 산물을 건조시켜 분말화하는 단계;

(b) 상기 분말의 유용물질을 추출하는 단계; 및

(c) 상기 추출물의 농축물을 동결건조하여 분말화하는 단계.

이 때, (a)단계에서, 고체 발효 산물의 건조는 수분율이 6% 이하가 되도록 하는 것을 의미하고, 적외선 건조에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 고체 발효 산물의 건조는 35~50℃에서 3~6시간 동안 수행될 수 있다.

(b)단계에서, 분말 및 물을 1:7 ~ 1:9의 비율로 혼합하는 것이 좋고, 본 발명의 일 구체예에서는 1:8로 혼합하였다. 특히, (b)단계에서, 분말의 유용물질의 추출은 60℃에서 1차 및 2차 추출 후 90℃에서 3차 추출하는 것이 바람직하다. 이 때, 1차 및 2차 추출은 각각 3시간씩, 3차 추출은 2시간으로 수행한다.

이와 같이, 본 발명은 의하면 꾸지뽕 열매를 발효하여 기능성을 향상시킨 발효 꾸지뽕 열매의 기능성을 검증하며, 나아가 향미를 개선하고 현대인의 입맛에 맞고 기능성을 함유한, 다양한 요리에 잘 어울릴 수 있는 소스류를 제공하여 건강 기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 꾸지뽕나무 열매를 식품발효 미생물을 활용하여 발효하고 그 발효산물과 추출물을 대량가공 하는 기술 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 항균, 항산화 작용, 항당뇨, 항고지혈증, 항고혈압, 항세포독성 등의 다양한 효능을 가지고 있고, 특히, 항산화성 및 혈중 콜레스테롤 저하작용이 우수하다.

도 1은 본 발명의 꾸지뽕 발효산물 제조를 위한 공정의 일부를 나타낸 사진이다.
도 2는 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 전자공여능, 환원력, ABTS 라디칼 소거능, SOD 유사활성, 아질산염 소거능 및 ferrous ion 소거효과 를 조사한 결과이다.
도 3은 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 xanthnine oxidase 저해활성, HMG-CoA reductase 저해활성을 확인하였고, elastase 저해활성 및 tyrosinase 저해활성을 조사한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"추출물"은 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata)의 조추출물, 극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다. 특히, 본 발명에서는 꾸지뽕나무 열매를 이용하는 것이 바람직하다.

"조추출물"은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"기능성 소스"란, 일반 소스에 본 발명의 꾸지뽕나무 추출물을 첨가함으로써 일반 소스의 기능성을 향상시킨 소스를 의미한다. "기능성"은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 "기능성 식품"이라 정의한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 해당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 각각의 단계에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다

제 1공정 : 꾸지뽕나무 열매를 건조하는 단계 ( S10 )

본 단계는 재료 준비 단계로서 꾸지뽕나무 열매를 선별 세척 건조한다.

꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata)는 뽕나무과에 속하는 식물로서 아시아 전역에 분포하고 있으며, 알려진 생리활성물질로 베타-시토스테롤(sitosterol), 베타-시토스테롤 글루코사이드(sitosterol glucoside), 아르토카페신(artocapesin), 노르아르토카페신(norartocapesin), 5-0-메틸제니스테인(methylgenistein), 파이토알렉신즈(phytoalexins) 등이 있다.

본 발명에서는 특히, 꾸지뽕나무의 열매를 사용하는 것이 바람직하다. 꾸지뽕나무의 가지, 잎, 뿌리는 건조가 용이하지만 열매의 경우 80% 이상이 당과 단백질의 성분을 함유하는 관계로 열풍건조 시 젤리형태의 진득한 생태가 된다.

따라서 급속 동결건조 과정을 거치는 것이 열매를 분쇄하는데 용이하며, 영양분 손실을 최소화 되는 것을 제공한다.

제 2공정 : 건조된 꾸지뽕나무 열매를 분말화 하는 단계 ( S20 )

상기 제 1공정에서 건조된 꾸지뽕나무 열매를 1차적으로 파쇄기로 파쇄를 한 뒤 분쇄기로 30~80메쉬의 분말을 제공한다. 그리고 반복 분쇄과정을 거쳐 미세 분말화 될 수 있게 한다.

제 3공정 : 꾸지뽕나무 열매에 발효 미생물을 혼합하는 단계 ( S30 )

제 2공정에서 분말화한 꾸지뽕나무 열매에 발효시키기 위해, 우선 미생물인 바실러스(Bacillus) 속 균주를 멸균시킨 soy broth에 접종하여 40℃에서 24~36시간 동안 배양하여 배양액(109 cells/mL)을 제조한다.

상기 바실러스 속 균주는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸미루스(Bacillus pumilus), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등일 수 있다. 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이다.

이들의 예로서, 바실러스 리체니포르미스 F1017, 바실러스 리체니포르미스 F1232, 바실러스 리체니포르미스 F1267, 바실러스 리체니포르미스 F1268, 바실러스 리체니포르미스 F1200, 바실러스 푸미루스 F1337, 바실러스 소노렌시스 F1005, 바실러스 서브틸리스 F1004, 바실러스 서브틸리스 F1236 및 바실러스 서브틸리스 F1279 등을 들 수 있다.

본 발명자들은 재래 청국장으로부터 분리한 수종의 균주를 단일균주로 사용하여 항돌연변이 활성, 점질물, 유리아미노산 함량 및 관능검사를 행하여 우수균주로 Bacillus licheniformis를 선발하였으며(Lee MY. (2005) Quality and functional characteristics of chungkukjang fermented by Bacillus sp. isolated from commercial products. MS Thesis. Catholic University of Daegu. p 1-62), Bacillus subtilis 균주는 생리활성 물질인 PGA 점질물과 혈전분해효소를 생산하는 우량균주로 잘 알려져 있다(Seo JH. (2007) Modulation of functional properties of poly-γ-glutamic acid by chemical modification. Ph.D thesis, Keimyung University, Daegu, Korea).

상기 멸균시킨 soy broth에 상기 균주 배양액을 원심분리하여 균체를 침전시키고 다시 생리식염수로 씻어내는 작업을 2~3회 반복한 다음 분리한 균주를 0.1~1.0%(v/w)가 되게 꾸지뽕나무 열매 분말에 균일하게 접종하여 고체발효시킨다. 이때 증류수가 분말의 약 5중량% 함량이 되도록 넣어주어 혼합하는 것이 바람직하다.

제 4공정 : 인큐베이터에서 발효과정을 거치는 단계 ( S40 )

상기 분말 및 증류수 혼합물을 플라스틱 용기에 약 1 kg씩 담은 후, 표면에 두께 0.01 mm 폴레에틸렌 필름(polyethylene film)을 가볍게 덮어 약 40℃, 상대습도 70~90%를 유지하면서 48~72시간 발효시킨다. 발효실의 온도와 꾸지뽕나무 열매의 상태에 따라 당업자가 적절한 시간 동안 발효시킬 수 있다.

이처럼, 본 발명에서는 상기 꾸지뽕나무 열매 분말에, 유용성이 입증된 바실러스 속 균주를 대량 배양하여 수세한 균체를 분말에 균일하게 접종하며, 상기 미생물이 활동하기 좋은 습도(70~90%)를 유지하는 조건 등을 제공한다.

상기 공정 이후에 다음과 같은 추가의 공정을 수행한다.

삭제

제 5공정 : 발효가 끝난 꾸지뽕나무 열매를 건조하는 단계 ( S50 )

상기 발효를 거친 고체 발효산물을 적외선 건조장치에서 수분율이 6% 이하가 되도록 건조시킨다. 즉, 발효산물의 수분율이 6%이하가 되도록 건조하는 것은 발효산물이 이상균들과 접촉되어 이상발효 내지 부패가 되는 것을 방지하기 위한 방법이다.

또한 적외선 건조방법을 실시함으로써 외부 기상조건에도 거의 영향을 받지 않고 건조기간을 상당히 단축시킬 수 있으며 위생적으로 안전한 건조물을 제조하는 것을 제공하고자 한다.

제 6공정 : 건조된 발효 꾸지뽕열매 분말을 추출, 농축 및 분말화 하는 단계 ( S60 )

제 5공정에서 건조된 발효꾸지뽕열매 분말의 유용물질을 추출하기 위하여 환류 냉각관을 부착시키고 건조 발효산물에 물을 1:8의 비율로 넣고 영양분의 파괴를 최소화 하기 위하여 60℃ 맨틀상에서 3시간씩 2회 반복 추출하고 마지막으로 90℃에서 2시간 정도로 추출한 후 Whatman No. 1여과지로 여과한 다음 감압농축기로 농축한 후에 동결건조하여 분말화 한다.

특히, 상기 추출공정은 세포속에 잠재되어 있는 기능성 물질이나 영양분을 용매를 이용하여 밖으로 빠져나오게 하는 작업으로, 꾸지뽕나무 열매의 세포막이 발효과정에 파괴가 되었기 때문에 1차, 2차 추출시 60℃정도의 온도에서 추출을 하고, 추출 수율을 높이기 위하여 잔사를 다시 90℃ 온도에서 2시간 정도 추출하는 것을 특징으로 한다.

발효추출물의 형태에는 액상, 분말 등 제한이 없으나, 바람직하게는 분말화 하여 용도를 다양화시킨다. 더욱 바람직하게는 저장성을 향상시키기 위하여 동결건조 분말로 제조한다.

제 7공정 : 기능성 꾸지뽕 소스를 제조하는 단계 ( S70 )

상기 동결건조된 발효 꾸지뽕 추출분말을 물과 혼합시켜 기능성 꾸지뽕 소스를 제조할 수 있다.

상기 분말과 물의 혼합비율은 특별히 한정하지 않는다. 이는 당업자라면 용도 및 기호를 반영하여 적절히 조절할 수 있기 때문이다.

상기 소스에는 기호에 따라 첨가되어온 공지의 성분을 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 개별적인 성분은 얼마든지 추가될 수 있다. 이러한 조미성분의 예로는 설탕, 간장, 소금, 우스터 소스, 생마늘 분쇄물, 생양파 분쇄물, 미림 등이 있으며, 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 이용될 수 있다. 상기 조미성분의 구체적인 조성비는 첨가되는 각 성분에 따라 당업자가 적절히 조절할 수 있다.

또한, 본 발명의 발효 꾸지뽕 소스 조성물은 향신료 성분을 추가로 함유할 수 있다. 사용가능한 향신료 성분은 요구되는 기호성에 따라 매우 다양한 선택이 가능하며, 바람직하기로는 천연식물로부터 얻어지는 분말 또는 액상의 추출물의 형태로 이용된다. 대표적인 향신료 성분으로는 계피, 후추, 생강, 고추, 바닐라(Vanilla), 겨자, 양귀비씨(poppy seed), 백리향(Thyme), 딜(Dill), 아니스(Anise), 넛맥(Nutmeg), 사프란(Safferon), 로즈마리(Rosemary), 라벤더(Lavender), 세이지(Sage), 파프리카(Paprika), 클로브(Clove), 파슬리(parsley), 오레가노(Oregano), 월계수(Bay leaf), 로리에(laurier), 스타니스(Star anise), 올 스파이스(Allspice berry), 카레가루(Curry Powder), 베질(Basil), 박하(Mint), 마조람(Marjoram), 타라곤(Tarragon), 큐민(Cumin), 칠리가루(Chilly Powder), 코리안더(Coriander), 쟈스민(Jasmin), 파인스위트(Pine sweet) 등으로서 이들은 단독 또는 2종 이상의 혼합 성분으로 관능성을 저해하지 않는 범위내에서 첨가될 수 있다.

상기 방법에 의해 제조되는 본 발명의 소스조성물은 각종 다양한 식품 및 이들의 가공식품의 용도로 제공될 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 꾸지뽕나무 열매를 식품발효 미생물을 활용하여 발효하고 그 발효산물과 추출물을 대량가공 하는 기술 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 이하 실시예에서 확인할 수 있는 다양한 효능을 가지고 있다. 보다 상세하게는 항균, 항산화 작용, 항당뇨, 항고지혈증, 항고혈압, 항세포독성 등의 다양한 효능을 가지고 있고, 특히, 항산화성 및 혈중 콜레스테롤 저하작용이 우수하다.

본 발명의 소스는 꾸지뽕열매를 발효시켜 추출한 분말을 이용하여 다양한 요리에 잘 어울릴 수 있는 기호성 높은 건강기능성 소스로서, 상기 효능들을 가질 수 있으므로 국민건강의 증진에 도움을 줄 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 해당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다

재료 및 제조방법

1. 재료 및 균주

본 실험에서 사용된 꾸지뽕(Cudrania tricuspidata) 열매는 2010년 9월에 경북 경산 진량에서 수확한 열매를 주식회사 상로에서 공급받았으며, 꾸지뽕 열매는 동결건조(FD SFDSM12, Samwon, Korea)한 다음 균질기(Nihonseili, Kaisha Ltd, Japan)를 사용하여 80 mesh로 분쇄한 후 분말을 제조하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였으며, 균주로는 한국종균협회에서 분양받은 Bacillus subtilis KCTC 1021와, 재래청국장으로부터 우수균주로 선발된 Bacillus licheniformis 균주를 사용하였다.

2. 발효 꾸지뽕열매 추출물 및 소스 조제

동결건조처리한 꾸지뽕열매를 분쇄하여 두고, 우선, 발효 미생물인 Bacillus subtilis, Bacillus lichemiformis를 멸균시킨 BactoTM trypic soy broth에 접종하여 40℃에서 24~36시간 동안 배양하여 배양액(109 cells/mL)을 제조한다. 배양액은 원심분리하여 균체를 침전시키고 다시 생리식염수로 씻어내는 작업을 2~3회 반복한 다음 각각의 균주를 0.1~1.0%(v/w)가 되게 꾸지뽕 열매 분말에 균일하게 접종하고, 플라스틱 용기에 1 kg씩 담은 후, 표면에 두께 0.01 mm 폴레에틸렌 필름(polyethylene film)을 가볍게 덮어 40℃, 상대습도 70~90%에서 48~72시간 발효시켜 발효꾸지뽕을 제조하였다(도 1)
상기 발효를 거친 고체 발효 꾸찌뽕을 적외선 건조장치에서 수분율이 6% 이하가 되도록 건조시키고, 건조된 발효꾸지뽕열매 분말의 유용물질을 추출하기 위하여 환류 냉각관을 부착시키고 건조 발효산물에 물을 1:8의 비율로 넣고 영양분의 파괴를 최소화 하기 위하여 60℃ 맨틀상에서 각각 3시간씩 1차, 2차 추출을 하고, 추출 수율을 높이기 위하여 잔사를 다시 90℃ 온도에서 2시간 정도 추출하였다.
Whatman No. 1여과지로 여과하여, rotary vaccum evaporator(rotary vacuum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)로 감압농축한 후에 동결건조(FD SFDSM12, Samwon, Korea)하여 분말을 제조하였으며 -70℃에 두면서 실험에 사용하였다(수율: 57.28%, Bacillus subtilis; 55.57%, Bacillus lichemiformis).
상기 동결건조된 발효 꾸지뽕 추출분말을 물과 혼합시켜 기능성 꾸지뽕 소스를 제조하였다.

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실험방법

1. 수분 및 색도

수분함량은 적외선 수분측정장치(IRD-250, Woori Sci. Co. Korea)를 사용하여 측정하였으며, 색도은 색차계(Chromameter CR-200 Minolta, Tokyo, Japan)로 측정하였으며, 밝기를 나타내는 L*(lightness), 적색도를 나타내는 a*(redness), 황색도를 나타내는 b*(yellowness) 및 H°(hue angle value)를 측정하였다.

2. 폴리페놀 함량 측정

Dewanto 등(Dewanto V, Wu X, Adom KK, Liu RH. (2002) Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity. J Agric Food Chem 50: 3010-3014)의 방법에 따라 추출물 100 μL에 2% sodium carbonate 2 mL과 50% Folin-Ciacalteu reagent 100 μL을 가한 후 720 nm에서 흡광도를 측정하였으며 gallic acid(Sigma-Aldrich Co., USA)의 검량선에 의하여 함량을 산출하였다.

3. 플라보노이드 함량 측정

Saleh와 Hameed의 방법(Saleh ES, Hameed A. (2008) Total phenolic contents and free radical scavenging activity of certain Egyptian Ficus species leaf samples. Food Chem 114: 1271-1277)에 따라 추출물 100 mL에 5% sodium nitrite 0.15 mL을 가한 후 25℃에서 6분간 방치한 다음 10% aluminium choloride 0.3 mL를 가하여 25℃에서 5분간 방치하였다. 다음 1N NaOH 1mL를 가하고 vortex상에서 가한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였으며 rutin hydrate(Sigma-Aldrich Co., USA)의 검량선에 의하여 함량을 산출하였다.

4. DPPH free radical 에 의한 전자공여 활성 측정

Blois(Blios MS. (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 26: 1199-1200)의 방법에 따라 시액 0.2 mL에 0.4 mM DPPH(1,1diphenyl-2-picryl-hydrazyl)용액 0.8 mL를 가하여 10분간 방치 한 다음 525 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, electron donating ability(%) = 100 - [(OD of sample/OD of control) x 100]에 의하여 활성도를 산출하였다.

5. 환원력 측정

Saeedeh와 Asna(Saeedeh AD, Asna U. (2007) Antioxidant properties of various solvent extracts of mulberry (Morus indica L.) leaves. Food Chem: 102, 1233-1240)의 방법에 따라 시액 1 mL에 0.2 M phosphate buffer(pH 6.6) 2.5 mL와 1% potassium ferricyanide 용액 2.5 mL를 가한 후 50℃에서 30분간 반응시켰다. 다음에 10% trichloroacetic acid(TCA) 용액 2.5 mL를 가한 후 1,650 x g에서 10분간 원심분리 하였으며, 상징액 2.5 mL에 증류수 2.5 mL와 0.1% FeCl3 용액 0.5 mL를 가한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

6. ABTS radical 소거활성 측정

Re 등(Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radial cation decolorization assay. Free Radic Biol Med 26: 1231-1237)의 방법에 따라 7.4 mM ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt]와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온 및 암소에서 24시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 732 nm에서 흡광도가 0.700±0.030이 되도록 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)로 희석하여 사용하였다. 희석된 용액 950 μL에 추출물 50 μL를 가하여 암소에서 10분간 방응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, ABTS radical scavenging ability(%) = 100 - [(OD of sample/OD of control) x 100]에 의하여 활성을 산출하였다.

7. Superoxide dismutase ( SOD ) 유사활성 측정

Marklund & Marklund(Marklund S, Marklund G. (1974) Involvement of superoxide anion radical in the oxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biol Chem 47: 468-474)의 방법에 따라 추출물 200 μL에 pH 8.5로 조정한 tris-HCl buffer 용액 3 mL와 7.2 mM pyrogallol 200 μL을 가하고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, SOD-like activity(%) = 100 - [(OD of sample/OD of control) x 100]에 의하여 활성을 산출하였다.

8. 아질산염 소거능 ( nitrite scavenging activity ) 측정

Kato 등(Kato H, Lee I.E, Chuyen NV, Kim SB, Hayase F. (1987) Inhibition of nitrosamine formation by nondialyzable melanoidins. Agri Bio Chem 51: 1333-1338)의 방법에 따라 1 mM NaNO 용액 1 mL에 추출물 1 mL를 가하고 0.1 N HCl과 0.2 M citrate buffer(pH 2.5)를 가하여 총 부피를 10 mL로 조정하였다. 다음에 37℃에서 1시간 반응시킨 후 1 mL를 취하여 2% 초산용액 3 mL와 30% 초산용액으로 용해한 Griess reagent(1% sulfanilic acid : 1% naphthylamine = 1 : 1) 0.4 mL을 순차적으로 가한 후 실온에서 15분간 방치, 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 Griess reagent 대신 증류수를 사용하였으며 계산식, nitrite scavenging activity(%) = 100 - [(OD of sample/OD of control) x 100]에 의하여 산출하였다.

9. Ferrous ion chelating 효과 측정

Yen 등(Yen GC, Duhb PD, Tsaia HL. (2002) Antioxidant and pro-oxidant properties of ascorbic acid and garlic acid. Food Chem 79: 307-313)의 방법에 따라 시액 1 mL, 80% ethanol 0.8 mL, 2 mM FeCl2?4H2O[iron(II) chloride tetrahydrate] 용액 0.1 mL, 5 mM ferrozine[3-(2-pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-

triazine-4',4''-disulfonic acid]용액 0.1 mL를 첨가한 다음 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 대표적 chelating agent인 EDTA를 사용하였으며 계산식, ferrous ion chelating effect(%) = 100 - [(OD of sample/OD of control) x 100]에 의하여 산출하였다.

10. Xanthine oxidase ( XO ) 저해활성 측정

Stirpe와 Corte의 방법(Stirpe F, Corte Della E. (1969) The regulation of rat liver xanthine oxidase. Conversion in vitro of the enzyme activity from dehydrogenase (type D) to oxidase (type O). J Biol Chem 244: 3855-3863)의 방법에 따라 추출물 0.1 mL와 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 0.6 mL에 2 mM xanthine 기질액 0.2 mL를 첨가하고 xanthine oxidase (0.2 U/mL) 0.1 mL를 가하였다. 다음에 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 종결시킨 다음, 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 292 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, xanthine oxidase inhibition(%) = 100 - [(OD of sample/OD of control) x 100]에 의하여 산출하였다.

11. HMG - CoA reductase 저해활성 측정

Kleinsed 등(Kleinsek DA, Dugan RE, Baker TA, Porter JW. (1981) 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase from rat liver. Methods in enzymology 71: 462-479)의 방법에 따라 추출물 50 μL, 0.5 μM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 100 μL, 2 mM DTT 100 μL, 0.4 mM β-NADPH 100 μL에 crude HMG-CoA reductase 100 μL를 1.5 mL tube에 넣어 37℃로 조정된 water bath에서 5분간 반응시킨 후 기질인 0.3 mM HMG-CoA 100 μL를 넣은 후 340 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, HMG-CoA reductase inhibition(%) = 100 - [(OD of sample/OD of control) x 100]에 의하여 산출하였다.

12. Elastase 저해활성 측정

James(James AEK, Timothy DW, Gorden L. (1996) Inhibition of human leukocyte and porcine pancreatic elastase by homologues of bovine pancreatic tyrosinase inhibitors. Biochem 35: 9090-9096)의 방법에 따라 0.2 M tris/HCl buffer용액 (pH 8.0) 1.0 mL에 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroaniline(10.4 mM) 0.1 mL 및 추출물(T) 0.1 mL를 가한 후 25℃에서 5분간 반응시킨 다음 elastase(Pancreatic from porcine pancreas, 3-6 units/mg- protein, EC 3.4.21.36, Sigma, USA, 1 μg/mL) 0.1 mL를 가하여405 nm에서 0 time에서의 흡광도를 측정한 후 다시 25℃에서 20분간 반응한 후의 흡광도를 측정하였다. 대조군(C)은 시료 대신 buffer 용액을 사용하였다. 저해활성도는 계산식, inhibitory activity (%) = [1- {T(OD 20 min - OD 0 min)/C(OD 20 min - OD 0 min)}] x 100에 의하여 산출하였다.

13. Tyrosinase 저해활성 측정

Jung 등(Jung SW, Lee NK, Kim SJ, Han DS. (1995) Screening of tyrosinase inhibitor from plants. Korean J Food Sci Technol 27: 891-896)의 방법에 따라 0.175 M phosphate buffer 용액(pH 6.8) 0.2 mL, 5 mM L-DOPA용액 0.2 mL 및 추출물 0.5 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase(Tyrosinase from mushroom, ≥2,000 units/mg solid, EC 1.14.18.1, Sigma, USA, 110 units/mL) 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 3분간 반응시킨후 475 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 저해활성은 inhibitory activity(%) = [1- (SAbs - BAbs / CAbs)] x 100: “SAbs; 시료의 흡광도, BAbs; 효소대신에 증류수를 넣었을 때의 흡광도, CAbs; 시료 추출액 대신에 증류수를 넣었을 때의 흡광도”에 의하여 산출하였다.

14. 통계처리

모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 유의성 검증은 version 12의 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test를 행하였다.

실시예 1: 발효 꾸지뽕열매 물 추출물의 특성

(1) 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 수율

발효꾸지뽕열매 물 추출물의 동결건조물 수율은 꾸지뽕열매 물 추출물(WCT), 발효 꾸지뽕열매 물 추출물(WFCT), B. licheniformis 발효 꾸지뽕열매 물 추출물(WFCTB) 및 B. subtilis 발효 꾸지뽕열매 물 추출물(WFCTS)가 각각 49.15%, 54.09%, 56.04% 및 56.83%로 높은 수율을 나타내었으며, 균주 발효 시 증가하는 경향을 나타내었다(표 1).

구분	실험그룹
구분	WCT	WFCT	WFCTB	WFCTS
수율 (g/100 g-dry basis)	49.15±0.87	54.09±0.75	56.04±0.48	56.83±0.62

식물성 polyphenolic 화합물들은 수용성 또는 지용성으로 구분되어 있어 추출되는 용매에 따라 그 성분들이 달라지기 때문에 추출 수율에 있어서도 많은 차이를 나타내며, 80% 이상이 탄수화물 및 단백질로 구성되어 있는 꾸지뽕열매의 경우 비극성 용매에서 잘 용출된 결과라 판단되며, 발효 시 효소 가수분해에 따른 수용성 및 지용성 폴리페놀 화합물과 방향족 아민 등의 용출이 증가되어 수율이 높게 나타난 것으로 판단되었다.

(2) 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 색도

발효꾸지뽕열매 물 추출물 동결건조물의 밝기, 적색도 및 황색도 값 모두는 발효처리구 WFCT, WFCTB 및 WFCTS가 대조구 WCT에 비하여 감소하는 추세를 보인 반면 생상각 값은 높은 경향을 나타내다.

그룹	색도
그룹	밝기	적색도	황색도	색상각
WCT	48.29±0.13	10.54±0.04	12.40±0.06	54.80±0.10
WFCT	45.50±0.07	9.24±0.01	11.70±0.02	56.70±0.10
WFCTL	44.61±0.27	8.10±0.03	10.93±0.03	57.60±0.17
WFCTS	42.47±0.14	7.67±0.07	8.91±0.05	53.40±0.10

이와 같은 결과는 발효로 인하여 탄수화물과 단백질이 분해되어 생성된 당과 아미노산의 반응인 maillard 반응의 결과(Kwak EJ, Lim SI. (2007) Effect of food additives on inhibiting the browning of model solution for doenjang. J. Korean Soc. Food Sci Nutr 36: 589-594)에 따른 현상이라 판단된다.

(3) 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

발효꾸지뽕열매 소스의 제조 시 적정 농도 비율 및 소재 기능특성 활용을 결정하기 위하여 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 조사한 결과는 표 3과 같다.

구분	실험그룹
구분	WCT	WFCT	WFCTL	WFCTS
폴리페놀 함량 (mg/g, dry basis)	7.73±0.77	8.93±0.89	9.39±0.94	9.75±0.98
플라보노이드 함량 (mg/g, dry basis)	1.03±0.10	1.37±0.14	1.43±0.14	1.54±0.15

Total polyphenol 함랑은 WCT 7.73 mg/g(w/w), WFCT 8.93 mg/g(w/w)로 발효에 의하여 15.52%가 증가하였고, 균주발효군인 WFCTL(9.39 mg/g, w/w) 및 WFCTS(9.75 mg/g, w/w)는 WCT에 비하여 각각 21.47% 및 26.13%가 증가하였다.

Total flavonoid 함량은 WCT 1.03 mg/g(w/w), WFCT 1.37 mg/g(w/w)로 WFCT가 WCT에 비하여 33.01%가 증가하였으며, WFCTL(1.43 mg/g, w/w) 및 WFCTS(1.54 mg/g, w/w)는 WCT에 비하여 각각 38.83% 및 49.51%가 증가하였다.

Baek(Baek LM. (2009) Effect of soybean germination on the quality characteristics of Cheongkookjang inoculated with Bacillus licheniformis B-59 isolated from rice straw. MS Thesis. Catholic University of Daegu, Korea. P 34)은 B. licheniformis 균주로 40℃에서 48시간 발효시킨 청국장의 polyphenol 함량은 발효하기 전에 비하여 38.05%가 증가한다고 하였고, Lee 등(Lee SG, Kim HJ, Lee SP, Lee IS. (2009) Antioxidant and anticancer activities of defatted soybean grits fermented by Bacillus subtilis NUC1. J Korean Soc Food Sci Nutr., 38, 657-662)은 B. subtilis 균주로 40℃에서 24시간 발효시킨 탈지대두 grits 발효물의 80% ethanol 추출물은 total polyphenol 및 flavonoid 함량이 발효시키기 전에 비하여 3.8~4.8배 증가한다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다. 균주 발효군에서 total polyphenol 및 flavonoid 함량이 증가한 현상은 발효과정 중에 분해되거나 새롭게 합성되는 성분에 의한 결과로 판단된다(Kwon HY, Kim YS, Kwon GS, Kwon CS, Sohn HY. (2004) Isolation of immuno-stimulating strain Bacillus pumilus jb-1 from Chungkook-jang and fermentation characteristics of jb-1. Kor J Microbial Biotechnol 32: 291-296).

(4) 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 항산화능

발효꾸지뽕열매 소스의 제조 시 적정 농도 비율 및 소재 기능특성 활용을 결정하기 위하여 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 전자공여능, 환원력, ABTS 라디칼 소거능, SOD 유사활성, 아질산염 소거능 및 ferrous ion 소거효과 를 조사한 결과를 도 2에 도시하였다.

전자공여능은 1000 mg% 농도에서 WFCTS(51.70%) > WFCTL(46.80%) > WFCT(44.52%) > WCT(41.10%) 순의 활성을 나타내었으며, 전반적으로 B. subtilis 발효군인 WFCTS에서 높은 활성을 나타내었고, 환원력에서도 유사한 경향을 나타내었다(도 2 a,b).

ABS 라디칼 소거활성 및 SOD 유사활성은 모두 농도증가에 비례하여 활성이 증가 되었으며, 500 mg%에서의 ABS 라디칼 소거능은 균주발효군인 WFCTL(73.89%) 및 WFCTS(75.62%)가 WCT(62.67%) 및 WFCT(69.63%)에 비하여 유의적으로 높은 활성을 나타내었고 전반적으로 모든 농도에서 유사한 경향을 보였다(도 2 c). 1000 mg%에서의 SOD 유사활성은 WFCTL(28.00%) > WFCTS(23.30%) > WFCT (20.30%) > WCT (18.95%) 순으로 WFCTL에서 높은 활성을 나타내었다(도 2 d).

아질산염 소거능 및 체내에서 세포의 지질 및 단백질의 산화를 촉진하는 Fe2+의 chelating 효과 모두 농도증가에 비례하여 활성이 증가 되었으며, 1000 mg%에서의 아질산염 소거능은 WFCTL(39.66%) > WFCTS(34.66%) > WFCT(31.73%) > WCT(25.31%) 순으로 WFCTL 및 WFCTS가 WCT에 비하여 각각 14.35% 및 9.35%가, WFCT에 비하여 각각 7.93% 및 2.93%가 증가하였다(도 2 e).

Ferrous ion chelating 효과는 1000 mg% 농도에서 WFCTS(56.23%) > WFCTL(54.34%) > WFCT(51.05%) > WCT(49.64%) 순으로 B. subtilis 발효군인 WFCTS군에서 다소 높은 활성을 나타내었다(도 2 f).

Takashi 등(Takashi Y, Yamamoto M, Tamura A. (1978) Studies on the formation of nitrosamines; The effects of some polyphenols on nitrosation of diethylamine. J Food Hyg Soc 19: 224-229)은 polyphenol 과 flavonoid 화합물은 종류에 따라 차이는 있으나 아질산염을 효과적으로 분해하여 nitrosamine의 생성을 억제한다는 보고하여 본 연구와 일치하였다. 따라서 발효 꾸지뽕열매 추출물은 체내에 생성된 Fe2+를 효과적으로 제거시킬 수 있는 천연물로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

ABTS 라디칼 소거활성은 수소공여항산화제(hydrogen-donating antioxidants)와 연쇄절단형 항산화제(chain-breaking antioxidants) 모두를 측정할 수 있으며 수용상(aqueous phase)과 유기상(organic phase) 모두에 적용 가능한 측정방법이다(Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radial cation decolorization assay. Free Radic Biol Med 26: 1231-1237).

SOD는 항산화계 효소로 세포내 활성산소종을 H₂O₂로 전환시키며, 생성된 H₂O₂는 peroxidase나 catalase에 의해 물과 산소로 분해된다. SOD 유사물질은 효소는 아니나 저분자 phytochemicals로 SOD와 유사한 역할을 함으로서 superoxide의 산화반응을 억제하여 생체를 보호하는 역할을 한다(Kitani K, Minami C, Amamoto T, Kanai S, Ivy GO, Carrillo MC. (2002) Pharmacological interventions in aging and age-associated disorders: potentials of propargylamines for human use. Ann NY Acad Sci 959: 295-307).

발암에 관련된 물질로 알려진 nitrite 및 nitrite로 전환이 가능한 nitrate는 일정농도 이상 섭취 시 amine류와 반응하여 발암물질인 nitrosamine을 생성한다. 또한 혈액중의 hemoglobin이 산화되어 methemoglobin을 형성하여 각종 중독을 일으키는 것으로 알려져 있어 아질산염소거능은 항암작용을 간접적으로 알 수 있는 하나의 지표로 이용된다(Na GM, Han HS, Ye SH, Kim HK. (2004) Physiological activity of medicinal plant extracts. Kor J Food Preserv 11: 388-393).

(5) 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 항 산화 , 항 콜레스테롤, 미백 및 주름개선 효과

발효꾸지뽕열매 소스의 제조 시 적정 농도 비율 및 소재 기능특성 활용을 결정하기 위하여 발효꾸지뽕열매 물 추출물의 xanthnine oxidase 저해활성, HMG-CoA reductase 저해활성을 확인하였고, elastase 저해활성 및 tyrosinase 저해활성을 조사한 결과를 도 3에 도시하였다.

500 mg% 농도에서의 xanthin oxidase 저해활성은 WCT, WFCT, WFCTL 및 WFCTS가 각각 38.97%, 44.23%, 51.37% 및 54.34%로 WFCT는 WCT에 비하여 5.26%가 증가하였으며 WFCTL 및 WFCTS는 각각 12.40% 및 15.37%가 증가하였다(도 3 a).

500 mg% 농도에서의 HMG-CoA reductase 저해활성에서는 WCT, WFCT, WFCTL 및 WFCTS가 각각 40.23%, 38.32%, 50.36% 및 47.51%로 B. licheniformis 및 B. subtilis 균주 발효군인 WFCTL 및 WFCTS에서 활성이 증가하였다(도 3 b).

500 mg% 농도에서의 Tyrosinase 저해활성에도 균주발효군 WFCTL(48.23%) 및 WFCTS(46.78%)가 WCT(22.34%)에 비하여 각각 25.89% 및 10.44%가, WFCT(36.34%)에 비하여 각각 11.89% 및 10.44%가 증가되어 발효 처리시 저해활성이 증가하는 것으로 나타났다(도 3 c).

500 mg% 농도에서의 Elastase 저해활성에는 WFCT(40.65%)가 WCT(35.32%)에 비하여 5.33%가 증가하였다. 반면에 균주발효군 WFCTL(55.67%) 및 WFCTS(57.54%)는 WCT에 비하여 각각 20.35% 및 22.22%가, WFCT에 비하여 각각 15.02% 및 16.89%가 증가하였다(도 3 d).

Xanthine oxidase는 xanthine 또는 hypoxanthine으로부터 uric acid를 형성하여 염증 및 심한 통증을 동반하는 통풍과, 신장에 침착 시 신장질환을 유발하는 효소로 알려져 있어 xanthine oxidase의 저해는 활성산소의 생성을 억제하므로 항산화, 노화 및 항암 등 생물학적으로 중요한 효소라고 할 수 있다. Hatano 등(Hatano T, Yasuhara T, Yoshihara R, Okuda T. (1991) Inhibitory effects of galloylated flavonoids on xanthine oxidase. Planta Med 57: 83-84)은 galloyl기를 함유한 flavonoid 화합물이 xanthine oxidase를 경쟁적으로 저해한다고 하여 본 연구에서 균주 발효군에서 저해활성이 증가한 것은 total polyphenol 및 flavonoid 함량이 증가한 것과 더불어 발효 중에 생산된 물질에 기인된 결과라 사료된다.

HMG-CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) reductase는 콜레스테롤 생합성 단계에서 작용하는 조절 효소로서 스테롤이나 isoprenoid계 화합물의 생합성 경로의 중간단계인 mevalonic acid의 합성을 매개하는 역할을 한다(Endo A. (1992) The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res 33: 1569-1582). 따라서 HMG-CoA reductase 활성이 저하되면, LDL-receptor의 활성이 증가되어 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시킨다고 보고되고 있다(Sitory CR. (1990) Pharmacology and mechanism of action or the HMG-CoA reductase inhibitors. Pharm Res 22: 555-562).

또, Tyrosinase는 tyrosine을 DOPA(dihydroxyphenylalanine)로의 전환에 관여할 뿐만 아니라 DOPA를 DOPA를 DOPA-quinone으로 전환시킴으로서 적색의 melanin 색소를 생성하는 중간반응에 관여한다(Jimenez M, Kameyama K, Maloy WL, Tomita Y, Hearing VJ. (1988) Mammalian tyrosinase: biosynthesis, processing, and modulation by melanocyte-stimulating hormone. Proc Natl Acad Sci USA, 85: 3830-3834).

Elastase는 진피 내 피부 탄력을 유지하는 기질 단백질인 elastin의 분해에 관여하며, 또한 체내의 elastin을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 활성이 높아져 조직파괴의 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실 등을 유발한다(DeWitt DL, Rollins TE, Day JS, Gauger JA, Smith WL. (1981) Orientation of the active site, and antigenic determinants of prostaglandin endoperoxide of synthase in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 256: 10375-10382). 따라서 elastase 저해제는 피부의 주름을 개선하는 효과가 있다.

실시예 2: 꾸지뽕 소스 제조

상기에서 얻은 발효 꾸지뽕 추출분말에 물을 가하여 꾸지뽕 소스를 제조하여 관능평가를 실시하였다. 5점 평점법(1점 : 매우나쁨, 5점 : 매우좋음)으로 측정하고 이들의 평균값을 나타내었다

구 분	색	맛	향	종합적 기호도
소스	3.53±0.28	3.75±0.42	3.51±0.57	3.74±0.38
발효꾸지뽕소스	3.65±0.33	4.05±0.68	4.12±0.49	4.22±0.41

본 발명의 발효꾸지뽕 소스가 색, 맛, 향 등 종합적으로 우수한 관능값을 나타내었다.

Claims

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다음을 포함하는, 바실러스 균주를 이용한 발효 꾸지뽕 소스 제조 방법:
(i) 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 꾸지뽕 나무 열매 분말에 0.1~1.0%(v/w)로 접종하는 단계;
(ii) 상기 분말의 5중량%의 증류수를 첨가하고 40℃ 및 70~90% 상대습도에서 48~72시간 발효시키는 단계;
(iii) 상기 발효 산물을 건조시키고, 유용물질을 60℃에서 각각 3시간씩 1차, 2차 추출 후 90℃에서 2시간 동안 3차 추출한 후, 농축 및 분말화하는 단계; 및
(iv) 상기 분말에 물을 혼합시켜 소스를 제조하는 단계.
제9항에 있어서, (iii)단계에서, 고체 발효 산물의 건조는 수분율이 6% 이하가 되도록 적외선 건조에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 건조는 35~50℃에서 3~6시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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