KR20210007102A - 항비만 및 항고지혈효과를 가진 꾸지뽕 열매 발효식초 및 그 제조방법 - Google Patents

항비만 및 항고지혈효과를 가진 꾸지뽕 열매 발효식초 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명을 꾸지뽕 열매를 발효시켜 얻은 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 꾸지뽕 열매 발효식초에 관한 것이다. 본 발명의 꾸지뽕 열매 발효식초는 지방구의 생성을 억제하고, 트리글리세라이드, 콜레스테롤 및 렙틴을 감소시키며, 유리 글리세롤 방출을 촉진하고, 중성지방을 분해하며, 지방세포 분화와 관련된 유전자의 발현을 감소시키고, 비만관련 효소의 활성을 저해하는 것으로 확인된 바와 같이 우수한 항비만 및 항고지혈효과를 가진다.

Description

항비만 및 항고지혈효과를 가진 꾸지뽕 열매 발효식초 및 그 제조방법{Cudrania tricuspidata fruit-fermented vinegar with antiobesity and antihyperlipidemic effect and producing method thereof}
본 발명은 꾸지뽕 열매를 발효시켜 얻은 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 발효식초와 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata)는 뽕나무과(Moraceae)에 속하는 낙엽활엽소교목 또는 관목으로 굿가시나무라고도 한다. 꾸지뽕나무는 한국, 일본, 중국 등지에 분포하고, 100~700m 높이의 양지바른 기슭이나 비탈, 바위틈, 밭둑, 바닷가에서 서식하며 주로 야산에서 볼 수 있다. 꾸지뽕나무는 약 10여종이 있으며 잎은 주로 뽕잎 대용으로 사용하고, 열매는 쨈이나 술을 담그며, 나무의 껍질과 뿌리는 약용이나 종이의 원료로 이용된다.
꾸지뽕은 한방에서는 주로 잎을 습진, 유행성 이하선염, 페결핵, 타박상, 만성요통, 급성관절염 등의 치료에 사용하고 있으며, 민간에서도 열매와 수피를 강장, 이뇨, 진해, 악창, 중풍 등의 치료에 이용하였다. 동의보감에서는 자양, 강장효능, 음위, 불면증, 시력감퇴에 효과가 크고, 뿌리와 줄기껍질은 여성질환에 좋다고 기록되어 있으며 민간요법으로 꾸준히 사용되어 왔다. 이러한 꾸지뽕나무에 관한 연구도 계속 이루어지고 있으며 지질산화 억제작용, 항균활성 연구, 항암활성 연구, 항당뇨 효과 등 다양한 효능 연구가 보고되어 있다.
꾸지뽕나무의 열매는 취과로 단단하고 초록색이었다가 9~10월에 약간 물렁해지면서 붉은색으로 익으며, 잎을 자르면 흰 액이 나오고 열매는 단맛이 난다.
꾸지뽕 열매는 플라보노이드의 일종인 루틴, 모린, 모르틴을 위시하여 가바, 아스파라긴산 등 유효성분을 함유하고 있는데, 루틴 성분은 모세혈관을 튼튼하게 해주며 당뇨나 혈압에도 좋은 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 특히 가바는 신경전달 물질로서 불안, 우울, 불면증, 기억력 개선에 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.
이러한 효능에도 불구하고 꾸지뽕 열매는 다량의 수분을 함유하고 있어 세균, 진균 등 미생물 오염가능성이 높아 쉽게 변질되므로 냉동시켜 보관하여야 하고, 열매를 건조하여 수분을 제거할 경우 변색과 함께 고유의 풍미가 사라지고 상품성이 저하되어 제품개발에 문제점을 안고 있다.
식초는 가장 오랜 역사를 가진 발효조미료이다. 음식에 맛과 향을 더하는 조미료로 식초절임, 드레싱 등으로 발달되어 왔다. 소득수준이 높아지고 건강한 삶을 추구하면서 조미료 중심의 식초가 음료로 개발되면서 식초시장이 다변화되고 빠른 성장을 보이고 있다. 마시는 식초음료가 식초시장을 주도하고 있고, 조미식초도 지속적인 성장을 보이고 있다. 조미식초는 합성식초 중심에서 과일, 곡류 등을 원료로 한 발효식초로 이동하고 있고, 주정발효 중심에서 천연발효로 기능성을 높이고 있다.
발효식초의 초산은 젖산을 분해하여 피로를 해소하고 지방을 분해하여 비만을 방지하는 기능을 한다. 구연산을 비롯한 다양한 유기산과 비타민, 미네랄 등은 인체의 면역력 증강, 콜레스테롤 억제, 혈압강하 등 성인병 예방에 효과적이다. 최근에는 미국, 일본 등은 물론 국내에서도 식초다이어트가 인기를 더해가고 있다. 발효식초는 식초음료를 비롯해 식초절임식품, 식초드레싱, 식초다이어트 등으로 사용되면서 식초의 저변을 넓히고 있다. 웰빙에 대한 욕구증대와 더불어 기능성 높은 발효식초 시장은 지속적으로 확대될 것이며 재배 농작물을 이용한 발효식초 및 식초음료 제조 판매는 기업의 매출 증대 및 고용창출로 이어질 것이다.
꾸지뽕을 이용한 식초도 개발되고 있으며, 꾸지뽕나무 또는 이의 발효물을 이용하여 식초를 제조하거나, 꾸지뽕 열매 추출물을 이용하여 식초를 제조하는 기술도 알려져 있다.
대한민국 특허등록 제10-1204875호 대한민국 특허공개 제10-2015-0089129호 대한민국 특허등록 제10-1463979호 대한민국 특허공개 제10-2015-0131482호 대한민국 특허등록 제10-1693668호 대한민국 특허등록 제10-1796770호 대한민국 특허공개 제10-2018-0047239호 대한민국 특허등록 제10-1895521호
본 발명은 꾸지뽕 열매를 발효시켜 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 꾸지뽕 열매 발효식초를 제조하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 꾸지뽕 열매 1kg에 92~98℃의 온수 1.5~2.5ℓ를 혼합하여 해동한 후 마쇄하여 꾸지뽕 쥬스를 얻는 단계; 상기 꾸지뽕 쥬스에 꾸지뽕 쥬스 1ℓ당 설탕 0.2~0.3kg을 혼합하여 꾸지뽕 쥬스의 당도를 높이는 단계; 상기 당도를 높인 꾸지뽕 쥬스를 85℃에서 80~100분 동안 살균하는 단계; 상기 살균된 꾸지뽕 쥬스를 25~30℃로 냉각하는 단계; 상기 냉각된 꾸지뽕 쥬스에 사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin) 주모 배양물을 총량의 4~6부피%가 되도록 접종하고, 23~27℃에서 9~11일 동안 발효시켜 꾸지뽕 와인을 얻는 단계; 상기 꾸지뽕 와인을 80~90℃에서 20~40분 동안 살균한 후 냉각하는 단계; 상기 냉각된 꾸지뽕 와인과 분리균주로 제조한 초산균(Acetobacter aceti) 종초(산도 7.0~7.4)를 1:0.8~1.2의 부피비로 혼합하고 28~32℃에서 발효시키는 단계; 및 발효 7일 후부터 7일 간격으로 발효식초 ℓ당 230~270㎖의 살균된 꾸지뽕 와인을 유가식으로 첨가하면서 총 21~42일 동안 발효시켜 꾸지뽕 열매 발효식초를 얻는 단계에 의하여 제조되는, 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 꾸지뽕 열매 발효식초의 제조방법을 제공한다.
상기 방법은 사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈을 접종하고 2일 차에 셀룰라아제를 250~350ppm 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된, 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 꾸지뽕 열매 발효식초를 제공한다.
본 발명의 꾸지뽕 열매 발효식초는 지방구의 생성을 억제하고, 트리글리세라이드, 콜레스테롤 및 렙틴을 감소시키며, 유리 글리세롤 방출을 촉진하고, 중성지방을 분해하며, 지방세포 분화와 관련된 유전자의 발현을 감소시키고, 비만관련 효소의 활성을 저해한다. 따라서 본 발명의 꾸지뽕 열매 발효식초는 꾸지뽕 열매의 유용한 성분을 함유하면서 우수한 항비만효과와 항고지혈효과를 가진다.
도 1은 발효시간에 따른 꾸지뽕 열매 발효식초의 산도변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 꾸지뽕 열매 발효식초의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 3은 꾸지뽕 열매 발효식초의 3T3-L1 세포에서의 지방구 생성 억제효과를 확인한 결과이다.
도 4는 꾸지뽕 열매 발효식초의 3T3-L1 세포에서의 트리글리세라이드 감소효과를 확인한 결과이다.
도 5는 꾸지뽕 열매 발효식초의 3T3-L1 세포에서의 유리 글리세롤 방출효과를 확인한 결과이다.
도 6은 꾸지뽕 열매 발효식초의 3T3-L1 세포에서의 총 콜레스테롤 감소효과를 확인한 결과이다.
도 7은 꾸지뽕 열매 발효식초의 3T3-L1 세포에서의 렙틴 방출 감소효과를 확인한 결과이다.
도 8은 꾸지뽕 열매 발효식초의 지방세포분화관련 유전자 발현 감소효과를 확인한 결과이다.
도 9는 꾸지뽕 열매 발효식초의 중성지방 분해능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 지방분해효소 기질로 p-니트로페닐 부티레이트를 사용하여 꾸지뽕 열매 발효식초의 항고지혈효과를 분석한 결과이다.
도 11은 지방분해효소 기질로 p-니트로페닐 팔미테이트를 사용하여 꾸지뽕 열매 발효식초의 항고지혈효과를 분석한 결과이다.
도 12는 지방분해효소 기질로 p-니트로페닐 데카노에이트를 사용하여 꾸지뽕 열매 발효식초의 항고지혈효과를 분석한 결과이다.
도 13은 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 췌장 리파아제의 활성을 분석한 결과이다.
도 14는 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 췌장 리파아제의 잔여 효소활성을 확인한 결과이다.
도 15는 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 췌장 리파아제의 효소 저해활성을 확인한 결과이다.
도 16은 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 α-아밀라제의 활성을 분석한 결과이다.
도 17은 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 α-아밀라제의 잔여 효소활성을 확인한 결과이다.
도 18은 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 α-아밀라제의 효소 저해활성을 확인한 결과이다.
도 19는 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 β-글루코시다제의 활성을 분석한 결과이다.
도 20은 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 β-글루코시다제의 잔여 효소활성을 확인한 결과이다.
도 21은 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 β-글루코시다제의 효소 저해활성을 확인한 결과이다.
도 22는 꾸지뽕 열매 발효식초 내 p-하이드록시벤질 알코올의 지방분해효소 저해활성을 동역학적으로 분석한 결과이다.
도 23은 꾸지뽕 열매 발효식초 내 p-하이드록시벤질 알코올의 당분해효소 저해활성을 동역학적으로 분석한 결과이다.
본 발명의 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 꾸지뽕 열매 발효식초는,
꾸지뽕 열매 1kg에 92~98℃의 온수 1.5~2.5ℓ를 혼합하여 해동한 후 마쇄하여 꾸지뽕 쥬스를 얻는 단계;
상기 꾸지뽕 쥬스에 꾸지뽕 쥬스 1ℓ당 설탕 0.2~0.3kg을 혼합하여 꾸지뽕 쥬스의 당도를 높이는 단계;
상기 당도를 높인 꾸지뽕 쥬스를 85℃에서 80~100분 동안 살균하는 단계;
상기 살균된 꾸지뽕 쥬스를 25~30℃로 냉각하는 단계;
상기 냉각된 꾸지뽕 쥬스에 사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin) 주모 배양물을 총량의 4~6부피%가 되도록 접종하고, 23~27℃에서 9~11일 동안 발효시켜 꾸지뽕 와인을 얻는 단계;
상기 꾸지뽕 와인을 80~90℃에서 20~40분 동안 살균한 후 냉각하는 단계;
상기 냉각된 꾸지뽕 와인과 분리균주로 제조한 초산균(Acetobacter aceti) 종초(산도 7.0~7.4)를 1:0.8~1.2의 부피비로 혼합하고 28~32℃에서 발효시키는 단계; 및
발효 7일 후부터 7일 간격으로 발효식초 ℓ당 230~270㎖의 살균된 꾸지뽕 와인을 유가식으로 첨가하면서 총 21~42일 동안 발효시켜 꾸지뽕 열매 발효식초를 얻는 단계에 의하여 제조된다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
꾸지뽕 열매 1kg에 92~98℃의 온수 1.5~2.5ℓ를 혼합하여 해동하고, 해동된 꾸지뽕 열매를 마쇄하여 꾸지뽕 쥬스를 얻는다. 이때 온수는 약 95℃의 온수를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 꾸지뽕 열매 1kg에 온수 2ℓ를 혼합하는 것이 보다 바람직하다.
상기 꾸지뽕 쥬스 1ℓ당 설탕 0.2~0.3kg을 혼합하여 쥬스의 당도를 높인다. 당도는 6°Brix에서 24°Brix로 높이는 것이 바람직하다. 꾸지뽕 쥬스 1ℓ당 설탕 0.22~0.24kg을 혼합하는 것이 보다 바람직하다.
상기 당도를 높인 꾸지뽕 쥬스를 85℃에서 80~100분 동안 살균한다. 90분 동안 살균하는 것이 보다 바람직하다. 오토클레이브를 사용하여 살균하는 것이 바람직하다.
상기 살균된 꾸지뽕 쥬스를 25~30℃로 냉각하고 사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin) 주모 배양물을 총량의 4~6부피%가 되도록 접종한다. 총량의 5부피%가 되도록 접종하는 것이 보다 바람직하다. 접종 후 23~27℃에서 9~11일 동안 발효시키며, 25℃에서 10일 동안 발효시키는 것이 보다 바람직하다. 발효기간 중에는 매일 2회 교반하여 과육의 장기 공기 노출을 방지한다.
사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈을 접종하고 2일 차에 셀룰라아제(cellulase)를 250~350ppm 첨가할 수 있다. 셀룰라아제로는 아스퍼질러스 나이거 셀룰라아제(Aspergillus niger cellulase)를 사용하는 것이 보다 바람직하며, 셀룰라아제는 300ppm의 양으로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 셀룰라아제를 첨가하면 배당체형 유용성분이 용출되어 향기성분 함량이 증가한다.
상기 발효에 의하여 꾸지뽕 와인이 얻어진다.
상기 꾸지뽕 와인을 80~90℃에서 20~40분 동안 살균한 후 냉각한다. 85℃에서 30분간 살균하는 것이 보다 바람직하다.
상기 냉각된 꾸지뽕 와인과 분리균주로 제조한 초산균(Acetobacter aceti) 종초(산도 7.0~7.4)를 1:0.8~1.2의 부피비로 혼합하고 28~32℃에서 초산발효를 진행한다.
발효 7일 후부터는 7일 간격으로 발효식초 ℓ당 230~270㎖의 비율로 살균된 꾸지뽕 와인을 유가식으로 첨가하면서 초산의 함량을 점진적으로 증가시킨다.
총 21~42일 동안 발효시켜 꾸지뽕 열매 발효식초를 얻는다. 30일 동안 발효하는 것이 보다 바람직하다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
냉동 꾸지뽕 열매 2kg에 약 95℃의 온수 4ℓ를 혼합하여 해동하고 해동된 꾸지뽕 열매를 믹서기로 마쇄하였다.
총량 6ℓ의 꾸지뽕 쥬스에 설탕 1.38kg을 첨가하여 당도를 높였다.
당도를 높인 꾸지뽕 쥬스는 오토클레이브를 사용하여 85℃에서 1시간 30분 동안 살균하였다.
살균 후 25~30℃로 냉각시킨 후 사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈 주모 배양물을 총량의 5부피%가 되도록 접종하여 25℃에서 10일 동안 발효시켰다. 발효기간 중에는 매일 2회 교반하여 과육의 장기 공기 노출을 방지하였다.
사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈 주모 배양물을 접종하고 2일차에 아스퍼질러스 나이거 셀룰라아제를 300ppm 첨가하였다.
10일 동안 발효시켜 꾸지뽕 와인을 얻었다.
발효기간 중 꾸지뽕 와인의 품질변화를 하기 표 1에 나타내었다.
사카로마이세스 세레비지애
(일)		 효소
(일)		 내용 pH 당도
(°Brix)		 총 산도
(%)		 알코올
(%)
0 - 사카로마이세스 세레비지 애접종 전(꾸지뽕 쥬스상태) 샘플링 5.44 24.0 0.18 0.00
1 0 효소첨가후 샘플링 4.38 23.8 0.22 1.1
2 1 사카로마이세스 세레비지애 접종 후 2일차 샘플링(장미향이 남) 3.94 23.0 0.66 2.2
4 3 사카로마이세스 세레비지애 접종 후 4일차 샘플링(오래된 수박향이 남) 3.73 16.0 0.79 6.1
6 5 사카로마이세스 세레비지애 접종 후 6일차 샘플링(술향이 진해짐) 3.77 12.0 0.60 11.6
8 7 사카로마이세스 세레비지애 접종 후 8일차 샘플링 3.81 10.0 0.55 12.1
10 9 사카로마이세스 세레비지애 접종 후 10일차 샘플링 3.82 9.5 0.58 14.0
상기와 같이 10일 동안 발효시켜 얻은 꾸지뽕 와인(10일차)을 여과하고, 여과한 꾸지뽕 와인을 85℃에서 30분 동안 살균한 후 냉각하였다.
꾸지뽕 와인과 분리균주로 제조한 초산균(Acetobacter aceti) 종초(산도 7.2)를 1:1의 부피비로 혼합하고 30℃ 인큐베이터에서 초산발효를 진행하였다.
발효 7일 후부터는 7일 간격으로 발효식초 ℓ당 250㎖의 비율로 저온살균 꾸지뽕 와인을 유가식으로 첨가하면서 초산의 함량을 점진적으로 증가시켰다.
30일 동안 발효시켜 꾸지뽕 열매 발효식초를 얻었다.
[실험예]
시료의 제조
꾸지뽕 열매 발효식초의 기능성 분석을 위하여 30일 동안 발효시킨 꾸지뽕 열매 발효식초를 회전감압 농축기로 알코올을 제거한 후 동결건조하여 반고체상의 농축물을 제조하여 시료로 제공하였다.
<실험예 1>
실시예 1에서 제조된 꾸지뽕 열매 발효식초의 발효시간(일)에 따른 산도변화를 확인하였다.
발효 0일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일, 56일 및 63일에 총 산도를 측정하여 그 결과를 하기 표 2와 도 1에 나타내었다.
발효시간(일) 총 산도(%)
0 4.212
7 5.088
14 5.724
21 6.864
28 7.387
35 7.398
42 7.692
49 8.964
56 9.75
63 11.232
<실험예 2>
세포독성 확인(세포 생존율 측정)
꾸지뽕 열매 발효식초의 세포독성을 확인하기 위하여 3T3-L1 세포를 이용한 MTT 분석(assay)을 실시하였다.
96-웰 플레이트에 3T3-L1 세포를 4×103 cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 3T3-L1 세포에 시료인 꾸지뽕 열매 발효식초를 0㎍/㎖, 30㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 300㎍/㎖, 500㎍/㎖ 및 750㎍/㎖ 농도로 희석하여 48시간 동안 배양하였다. 각 웰에 MTT 용액을 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 MTT 용액을 제거하고 DMSO를 넣고 15분 후 ELISA 판독기를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교를 위한 대조구(control)에는 배지를 처리하였다. 측정된 흡광도를 대조구에 대한 비율로 계산하여 도 2에 나타내었다.
도 2의 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 상기 각 농도에서 세포 생존율이 100%, 102%, 103%, 103%, 100%, 95% 및 87%로 확인되었다.
<실험예 3>
지방세포내 지방구 생성 억제효과 확인
꾸지뽕 열매 발효식초가 3T3-L1 세포가 전지방세포에서 지방세포로의 분화과정에 작용하여 지방구의 생성을 억제하는지 확인하기 위하여, 분화시키는 동안 3T3-L1 지방세포에 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리한 후 오일 레드 오(Oil Red O) 염색액을 이용하여 3T3-L1 세포 내에 생성된 지방구 염색하여 흡광도를 측정하였다.
지방세포 분화시 세포내 지방 축적을 유도하기 위한 유도인자로 인슐린, DEX(dexamethasone, 덱사메타손) 및 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, 3-이소부틸-1-메틸잔틴)를 사용였다. 인슐린은 인슐린 신호전달 활성화(insulin signaling activation)를 통해 지방생성 유전자(adipogenic gene)들의 발현을 활성화시킨다. DEX는 PPARγ, CEBPα 조절자(regulator)로 작용한다. IBMX는 세포의 cAMP 농도를 증가시키며 이에 따른 PPARs, CEBPs의 전사활성을 활성화시켜 지방생성 유전자 발현을 활성화시킨다. 배지 내에 인슐린, DEX, IBMX와 같은 유도인자를 첨가하면 성장이 멈추고 지방세포로의 분화가 시작된다. 세포 내에 생성된 지방은 분화 마지막 단계까지 계속 지방구를 형성하게 되는데 시간이 지날수록 지방구끼리 결합하여 그 크기가 점점 증가하게 되며, 지방구에 존재하는 중성지방은 3T3-L1 지방전세포로부터 지방세포로 분화하는 단계에서 생성된다.
3T3-L1 세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 3T3-L1 세포를 6-웰 플레이트에 1×105 cells/well로 분주하고 80~90% 융합(confluent) 상태가 되면 분화유도물질인 5㎍/㎖ 인슐린, 1μM DEX, 0.5mM IBMX 및 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 분화를 유도하였다. 2일 후 5㎍/㎖ 인슐린과 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교환하고, 이로부터 2일에 한번씩 10% FBS를 함유한 DMEM 배지로 보충하면서 4일 후 실험에 이용하였다.
6-웰 플레이트에 분주된 3T3-L1 세포를 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 150㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초와 함께 8일 동안 분화유도를 하였다. 분화유도를 끝낸 후 PBS로 세척하고, 10% 포르말린 용액으로 30분 동안 고정하고 증류수로 1회 세척하였다. 0.3% 오일 레드 오 용액으로 1시간 동안 처리하여 3T3-L1세포 내에 생성된 지방구를 염색한 후, 60% 이소프로판올로 1회 세척하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교를 위한 대조구(control)에는 배지를 처리하였다.
각 값은 대조구의 흡광도에 대한 비율(%)로 값을 계산하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 3의 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리하지 않은 세포군에서는 전지방세포에 비해 지방 분화유도세포 내 축적된 지방구가 265%로 증가하였고, 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리한 군에서는 240%, 195% 및 142%로 감소하였다.
<실험예 4>
트리글리세라이드 감소효과 확인
대부분의 지방구는 트리글리세라이드(trigylceride)와 페릴리핀 A(perilipin A)와 같은 단백질로 구성되어 있다. 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하였을 때 지방구를 구성하는 트리글리세라이드의 감소효과를 다음과 같이 확인하였다.
도 4는 3T3-L1 세포에서 트리글리세라이드에 대한 꾸지뽕 열매 발효식초의 억해효과를 확인한 결과이다.
트리글리세라이드 함량은 분석 키트에 지시되어 있는 정량법에 따라 수행하였다. 6-웰 플레이트에 분주된 3T3-L1 세포를 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 150㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초 시료와 함께 8일 동안 분화유도를 하였다. 분화유도를 끝낸 후 PBS로 2회 세척하고, 분석 키트에 지시되어 있는 방법대로 시약을 첨가하여 추가로 상온에서 배양한 후 ELISA 판독기를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하여 분석 키트로 트리글리세라이드 수준을 확인하였다. 비교를 위한 대조구(control)에는 배지를 처리하였다. 각 값은 대조구에 대한 비율(%)로 계산하여 도 4에 나타내었다. 도 4에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 4에서 확인되는 바와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하지 않은 지방세포군에서는 트리글리세라이드 함량이 210%로 증가하였다. 반면, 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리한 군에서는 185%, 163%, 133%로 감소하였다.
<실험예 5>
유리 글리세롤 방출효과 확인
중성지방의 분해정도를 확인하기 위하여 유리 글리세롤 함량을 측정하였다.
지방세포 내 축적된 중성지방인 트리글리세라이드는 유리 지방산과 유리 글리세롤(free glycerol)로 분해되어 혈관 내로 분비되어 간으로 이동하여 축적된다. 지방세포에서 트리글리세라이드의 분해는 호르몬-감수성 리파아제(Hormone-sensitive lipase)에 의해 주로 매개되어지는 것으로 알려져 있는데 세포 내 지방의 함량을 조절하는 중요한 단계로 여겨지고 있다. 3T3-L1 지방세포에서 트리글리세라이드가 분해되어 생성되는 유리 글리세롤의 함량은 지방세포 내 중성지방의 분해정도를 간접적으로 확인할 수 있는 인자 중 하나이다.
분화된 3T3-L1 세포에 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 150㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 배양한 배지를 튜브에 넣고 70℃에서 10분 동안 가열하여 세포로부터 유리된 효소들을 불활성화시켰다. 50㎕의 배지를 글리세롤 시약에 첨가하여 1분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 단백질량을 BCA 키트로 정량하여 세포수를 보정하였다. 비교를 위한 대조구(control)에는 배지를 처리하였다. 각 값은 대조구에 대한 비율(%)로 계산하여 도 5에 나타내었다. 도 5에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 5에서 확인되는 바와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리하였을 때 유리 글리세롤 방출이 117%, 137%, 159%로 증가하였다.
<실험예 6>
총 콜레스테롤 감소효과 확인
총 콜레스테롤(total cholesterol)은 중성지방(triglyceride), 인지질(phospholipid)과 같이 농도가 비정상적으로 증가하여 높은 농도로 유지되면 고질혈증과 같은 질환의 발생을 일으킨다. 전지방세포에서 분화유도 후 시료가 처리된 지방세포 내에 생성된 총 콜레스테롤 함량을 측정하였다.
총 콜레스테롤 함량은 분석 키트에 지시되어 있는 정량법에 따라 수행하였다.
분화된 3T3-L1 세포에 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 150㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리하고 PBS로 세척하여 세포용해물(cell lysate)을 만든 후 분석 키트에 지시되어 있는 정량법에 따라 처리한 후 ELISA 판독기를 이용하여 콜레스테롤 함량을 측정하였다. 비교를 위한 대조구(control)에는 배지를 처리하였다. 각 값은 대조구에 대한 비율(%)로 계산하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리하지 않은 지방세포군에서는 콜레스테롤 함량이 165%로 증가하였다. 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리한 군에서는 콜레스테롤 함량이 150%, 139%, 118%로 감소하였다.
<실험예 7>
렙틴 방출 감소효과 확인
렙틴(Leptin)은 주로 지방세포에서 생성, 분비되는 단백질로 여러 가지 대사활동으로 에너지 소비를 증가시켜 비만을 조절한다. 지방세포 내 지방축적량이 높을수록 렙틴의 분비량이 증가하는 것으로 알려져 있으며, 인 비트로(In vitro)에서도 지방세포의 지방축적에 비례하여 렙틴의 분비가 증가한다고 보고되고 있다.
렙틴 함량은 분석 키트에 지시되어 있는 정량법에 따라 수행하였다.
분화된 3T3-L1 세포에 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 150㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리하고 분석 키트에 지시되어 있는 정량법에 따라 처리한 후 ELISA 판독기를 이용하여 렙틴 함량을 측정하였다. 비교를 위한 대조구(control)에는 배지를 처리하였다. 각 값은 대조구에 대한 비율(%)로 계산하여 도 7에 나타내었다. 도 7에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 7에서 확인되는 바와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리하지 않은 지방세포군에서는 렙틴 함량이 205%로 증가하였다. 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 처리한 군에서는 렙틴 함량이 168%, 147%, 123%로 감소하였다.
<실험예 8>
지방세포 분화관련 유전자의 발현 감소효과 확인
꾸지뽕 열매 발효식초에 의한 지방축적 감소가 어떤 기작에 의해 유도되는지 확인하기 위해 전지방세포의 분화를 유도하는 과정에 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하고 관련 단백질들의 발현을 확인하였다.
지방세포에서 형태학적, 생화학적으로 완전히 성숙된 지방세포로 분화되는 과정은 호르몬, 사이토카인, 전사인자 등 여러 인자들의 상호조절을 통해 이루어지며, 지방세포가 cAMP같은 지방생성 신호(adipogenetic signal)를 받으면 전사인자 CCAAT/증폭체결합단백질[enhancer-binding protein(C/EBP)]β와 C/EBPδ의 발현이 유도되고 이들이 지방생성의 주요조절자인 PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor)의 발현을 유도하여 분화를 진행시키는 것으로 알려져 있다. 분화과정에 관여하는 전사인자들 중 가장 잘 알려진 C/EBP 군(family)과 PPAR 군은 지방세포 유전자 조절 부위와 상호작용함으로써 지방세포분화를 촉진시킨다. C/EBPα는 분화시 여러 지방조직특이성 유전자들이 발현되기 전에 증가하여 에너지 항상성을 조절하며, PPAR는 지방생성의 주요 조절자로서 렙틴, FAS(fatty acid synthase), aP2(fatty acid binding protein) 등의 지방생성 유전자들의 발현을 조절한다.
처리가 끝난 3T3-L1 세포에 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 세포내 단백질을 분리한 후 BCA 키트로 단백질을 정량하였다. SDS-PAGE에 로딩하여 전기영동한 후 단백질은 PVDF 막(membrane)으로 트랜스퍼(transfer buffer)를 사용하여 트랜스퍼시켰다. 5% 무지방 탈지우유용액(non-fat skim milk solution)으로 블로킹한 후 1차 항체와 2차 항체를 부착하였다. 항체반응이 끝난 막에 ECL 검출키트로 처리하고 X-선 필름에 노출하여 현상하여 생성된 밴드(band)를 이용하여 발현량을 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8의 결과에서와 같이, PPARγ의 경우 전지방세포에 비해 6.2배 증가하였으며, 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 4.8배 4.8배, 2.9배로 발현량이 감소하였다. CEBPα의 경우 전지방세포에 비해 4.1배 증가하였으며, 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 2.9배, 2.0배, 1.2배로 발현량이 감소하였다. LPL의 경우 전지방세포에 비해 6.0배 증가하였으며, 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 3.1배, 3.3배, 1.8배로 발현량이 감소하였다. FAS의 경우 전지방세포에 비해 6.7배 증가하였으며 꾸지뽕 열매 발효식초를 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때, 6.0배, 5.1배, 2.4배로 발현량이 감소하였다.
<실험예 9>
중성지방 분해능 확인
본 발명의 꾸지뽕 열매 발효식초의 중성지방 억제 및 분해능을 트리부티린 플레이트 분석법(Tributyrin plate assay)으로 분석하였다.
트리부티린 플레이트 분석법은 1% 트리부티린 용액을 적정량으로 희석하여 2% 아가 용액과 함께 최종 부피가 5㎖가 되도록 트리부티린 플레이트를 준비하고, 트리부티린 플레이트에 지름 3mm 웰(well)을 만들어 다양한 농도의 시료를 넣고 37℃에서 반응시킨 후 클리어 존(Clear zone)을 측정하여 시료의 지방분해활성(lipolytic activity)을 분석하는 방법이다.
실험 시료로는 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초를 사용하였다. 비교를 위한 대조구(control)에는 증류수(DW)를 처리하였다.
1% 트리부티린 용액과 2% 아가 용액을 최종 부피 5 ㎖가 되도록 혼합하여 트리부티린 플레이트를 제조하였다. 트리부티린 플레이트에 직경 3mm의 웰을 만들고 웰에 상기 시료를 침적시킨 후 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 클리어존을 측정하여(mm) 시료의 지방분해활성을 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 9에서 확인되는 바와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초는 중성지방을 5㎍/㎖에서 1.7±0.1 mm, 10㎍/㎖에서 1.9±0.2mm, 20㎍/㎖에서 2.0±0.2mm, 50㎍/㎖에서 2.4±0.3mm, 100㎍/㎖에서 2.6±0.1mm 분해시켰다. 꾸지뽕 열매 발효식초의 중성지방 분해능은 농도에 비례하여 증가하였고, 분해능은 가장 높은 농도에서 2.6mm로 가장 높았다.
<실험예 10>
지방분해효소 기질을 이용한 항고지혈효과 확인
본 발명의 꾸지뽕 열매 발효식초의 항고지혈효과를 분석하기 위하여 지방분해효소 기질을 이용한 지방분해활성 분석법(Lipolytic activity assay)으로 지방분해 및 억제효능을 확인하였다.
지방분해활성 분석법은 지방분해효소 기질로는 10mM 농도의 p-니트로페닐 부티레이트(p-nitrophenyl butyrate), p-니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate) 및 p-니트로페닐 데카노에이트(p-nitrophenyl decanoate)를 사용하고, 기질용액에 다양한 농도의 시료를 넣고 60℃에서 15분 동안 반응시킨 후 405nm에서 10분 동안 p-니트로페놀(p-nitrophenol, PNP)을 측정하여 측정하여 Vmax값 또는 OD 405값으로 분석하는 지방분해활성의 분광광도분석법(spectrophotometric assay)이다.
실험 시료로는 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초를 사용하였다. 비교를 위한 음성대조구에는 증류수(DW)를 처리하고, 양성대조구에는 리파아제(lipase)를 처리하였다.
지방분해효소의 기질인 10mM 농도의 p-니트로페닐 부티레이트, p-니트로페닐 팔미테이트 및 p-니트로페닐 데카노에이트 용액에 상기 시료를 넣고 60℃에서 15분 동안 반응시킨 후 405nm에서 10분 동안 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 방출되는 p-니트로페놀(PNP)을 측정하여 Vmax (mU/min)값으로 분석하였다.
기질로 p-니트로페닐 부티레이트를 사용하였을 때의 결과를 도 10에 나타내고, p-니트로페닐 팔미테이트를 사용하였을 때의 결과를 도 11에 나타내고, p-니트로페닐 데카노에이트를 사용하였을 때의 결과를 도 12에 나타내었다. 도 10 내지 12에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
증류수만 처리한 음성대조구의 효능은 0 Vmax (mU/min), 리파아제를 처리한 양성대조구의 효능은 p-니트로페닐 부티레이트에서 0.22±0.01mU/min, p-니트로페닐 팔미테이트에서 0.37±0.05mU/min, p-니트로페닐 데카노에이트에서 0.33±0.03mU/min로 측정되었다.
기질로 p-니트로페닐 부티레이트를 사용하였을 때, 꾸지뽕 열매 발효식초는 5㎍/㎖ 농도에서 0.0134±0.0014mU/min, 10㎍/㎖ 농도에서 0.0299±0.0016mU/min, 20㎍/㎖ 농도에서 0.1447±0.0428mU/min, 50㎍/㎖ 농도에서 0.2335±0.0354mU/min, 100㎍/㎖ 농도에서 0.2912±0.0458mU/min의 활성이 나타났다.
기질로 p-니트로페닐 팔미테이트를 사용하였을 때, 꾸지뽕 열매 발효식초는 5㎍/㎖ 농도에서 0±0mU/min, 10㎍/㎖ 농도에서 0.0037±0.0009mU/min, 20㎍/㎖ 농도에서 0.0089±0.0012mU/min, 50㎍/㎖ 농도에서 0.0104±0.0014mU/min, 100㎍/㎖ 농도에서 0.0191±0.0016mU/min의 활성이 나타났다.
기질로 p-니트로페닐 데카노에이트를 사용하였을 때, 꾸지뽕 열매 발효식초는 5㎍/㎖ 농도에서 0±0mU/min, 10㎍/㎖ 농도에서 0±0mU/min, 20㎍/㎖ 농도에서 0±0mU/min, 50㎍/㎖ 농도에서 0.0059±0.0013mU/min, 100㎍/㎖ 농도에서 0.0071±0.0010 mU/min의 활성이 나타났다.
상기 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초의 항고지혈 효과는 p-니트로페닐 부티레이트 기질에서만 농도에 비례하여 효능이 증가하였고 가장 높은 농도에서 0.29mU/min의 활성을 보였다.
<실험예 11>
비만 관련 효소활성 저해효과 확인
본 발명의 꾸지뽕 열매 발효식초의 비만 관련 효소 활성을 저해하는 효과를 다음과 같이 확인하였다.
비만 관련 효소로는 지방의 소화 및 흡수 지표인 췌장 리파아제, 및 당의 소화 및 흡수 지표인 아밀라제와 글루코시다제를 사용하였다.
효소활성 저해능은 하기의 식으로 계산하였다:
저해활성(%)= [(무시료 대조구의 흡광도 -시료첨가 대조구의 흡광도)/무시료 대조구의 흡광도]×100
1. 췌장 리파아제(Pancreatic lipase, PL) 효소 저해능 분석
지방의 소화 및 흡수 지표인 췌장 리파아제에 시료를 처리하여 효소활성 저해능을 분석하였다.
실험 시료로는 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 사용하였다. 비교를 위한 음성대조구에는 증류수(DW)를 처리하고, 양성대조구에는 인간유래 췌장 리파아제를 처리하였다.
(1) 효소활성
10mM 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산[3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, MOPS)과 5mM CaCl2를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 6.8)에 인간유래 췌장 리파아제 10mU를 첨가하여 효소용액을 제조하였다. 인간유래 췌장 리파아제의 효소(10mU)는 실온에서 다양한 시료로 10분 동안 전처리하였다. 10분 동안 전처리한 후, 혼합물을 3mM p-니트로페닐 부티레이트에 첨가하여 반응을 개시하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 배양 후 반응혼합물의 활성을 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서의 흡광도 값을 판독하여 확인하였다. 효소 활성은 분당 p-니트로페닐 부티레이트 1nM을 분해시킬 수 있는 활성을 1mU으로 표현하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었으며, 도 13에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 13의 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하고 405nm에서 흡광도를 측정한 결과, 5㎍/㎖에서 2.42±0.03, 10㎍/㎖에서 2.33±0.06, 20㎍/㎖에서 2.21±0.03, 50㎍/㎖에서 2.11±0.04, 100㎍/㎖에서 1.24±0.03의 흡광도가 확인되었다.
(2) 잔여 효소활성
상기 흡광도 값을 토대로 10mU의 췌장 리파아제 효소활성을 100%로 하였을 때 각 시료를 첨가하였을 때의 효소활성을 비교한 비율(%)로 잔여 효소활성을 확인하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었으며, 도 14에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 14의 결과에서와 같이, 10mU의 췌장 리파아제 효소활성을 100%로 하였을 때 꾸지뽕 열매 발효식초를 5㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 98.55±5.05%, 10㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 94.89±3.57%, 20㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 90.18±4.78%, 50㎍/㎖ 농도로 처리하면 잔여활성이 85.97±4.11%, 100㎍/㎖ 농도로 처리하면 잔여활성이 49.18±2.15%이었다.
(3) 효소 저해효능
상기 잔여 효소활성을 분석하여 꾸지뽕 열매 발효식초의 지방분해효소 저해효능을 분석하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었으며, 도 15에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 15의 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초의 지방분해효소 저해효과는 5㎍/㎖ 농도에서 1.45±5.05%, 10㎍/㎖ 농도에서 5.11±3.57%, 20㎍/㎖ 농도에서 9.82±4.78%, 50㎍/㎖ 농도에서 14.03±4.11%, 100㎍/㎖ 농도에서 50.82±2.15%로 확인되었다. 이와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초의 지방분해효소 저해효과는 1~51%로, 지방분해효소 저해제인 립스타틴(lipstatin)의 저해율 90%에 비해 낮은 저해효과를 보였다.
2. α-아밀라제(α-Amylase) 효소 저해능 분석
당의 소화 및 흡수 지표인 α-아밀라제에 시료를 처리하여 효소활성 저해능을 분석하였다.
실험 시료로는 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 사용하였다. 비교를 위한 음성대조구에는 증류수(DW)를 처리하고, 양성대조구에는 10mU 인간유래 α-아밀라제를 처리하였다.
(1) 효소활성
α-아밀라제를 실온에서 다양한 농도의 시료로 10분 동안 처리하였다. 처리된 혼합물에 1% 스타치(starch)를 첨가하여 반응시킨 후 0.1% DNS를 첨가하여 100℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응 후 -20℃에서 1분 동안 냉각시킨 후 반응액의 당분해효소활성을 마이크로플레이트 판독기로 540nm에서의 흡광도 값을 판독하고 표준품과 비교분석하여 확인하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었으며, 도 16에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 16의 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하고 540nm에서 흡광도를 측정한 결과 5㎍/㎖ 농도에서 0.2665±0.0092, 10㎍/㎖ 농도에서 0.2613±0.0052, 20㎍/㎖ 농도에서 0.2523±0.0062, 50㎍/㎖ 농도에서 0.2255±0.0056, 100㎍/㎖ 농도에서 0.1933±0.0068의 흡광도가 확인되었다. 시료 대신 증류수(DW)를 처리한 음성대조구의 흡광도는 0.1330±0.0122이며, 양성대조구인 인간유래 α-아밀라제의 흡광도는 10mU 농도에서 0.2959±0.0086로 나타났다.
(2) 잔여 효소활성
상기 흡광도 값을 토대로 10mU의 α-아밀라제 효소활성을 100%로 하였을 때 각 시료를 첨가하였을 때의 효소활성을 비교한 비율(%)로 잔여 효소활성을 확인하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었으며, 도 17에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 17의 결과에서와 같이, 10mU의 인간유래 α-아밀라제 효소활성을 100%로 하였을 때 꾸지뽕 열매 발효식초를 5㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 81.96±0.02%, 10㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 78.73±2.55%, 20㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 73.21±2.05%, 50㎍/㎖ 농도로 처리하면 잔여활성이 56.75±2.76%, 100㎍/㎖ 농도로 처리하면 잔여활성이 36.99±2.51%이었다.
(3) 효소 저해효능
상기 잔여 효소활성을 분석하여 꾸지뽕 열매 발효식초의 α-아밀라제 저해효능을 분석하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었으며, 도 18에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 18의 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초의 α-아밀라제 저해효과는 5㎍/㎖ 농도에서 18.04±0.02%, 10㎍/㎖ 농도에서 21.27±2.55%, 20㎍/㎖ 농도에서 26.79±2.05%, 50㎍/㎖ 농도에서 43.25±2.76%, 100㎍/㎖ 농도에서 63.01±2.51%로 확인되었다. 이와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초의 α-아밀라제 저해효과는 농도에 비례하여 증가하였고, 가장 높은 농도에서 63%의 저해효과를 보였다. 이는 α-아밀라제 저해제인 아카보즈(acarbose) 10mg/㎖ 농도가 가지는 α-아밀라제 저해율 약 60% 보다 다소 높은 저해효과를 보였다.
3. β-글루코시다제(β-glucosidase) 효소 저해능 분석
당의 소화 및 흡수 지표인 β-글루코시다제에 시료를 처리하여 효소활성 저해능을 분석하였다.
실험 시료로는 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 농도의 꾸지뽕 열매 발효식초 시료를 사용하였다. 비교를 위한 음성대조구에는 증류수(DW)를 처리하고, 양성대조구에는 0.1U β-글루코시다제를 처리하였다.
(1) 효소활성
10mM PBS(phosphate-buffered saline, pH 6.8)에 β-글루코시다제를 첨가하여 효소용액을 제조하였다. 0.1U β-글루코시다제를 실온에서 다양한 농도의 시료로 10분 동안 전처리하였다. 처리된 혼합물에 3mM p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)를 첨가하고 37℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 후 반응액의 당분해효소활성을 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서의 흡광도 값을 판독하여 확인하였다. 효소활성은 분당 p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드 1nM을 분해시킬 수 있는 활성을 1mU으로 표현하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었으며, 도 19에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 19의 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초를 처리하고 405nm에서 흡광도를 측정한 결과 5㎍/㎖ 농도에서 0.315±0.006, 10㎍/㎖ 농도에서 0.285±0.016, 20㎍/㎖ 농도에서 0.273±0.008, 50㎍/㎖ 농도에서 0.191±0.008, 100㎍/㎖ 농도에서 0.174±0.010의 흡광도가 확인되었다.
(2) 잔여 효소활성
상기 흡광도 값을 토대로 0.1U의 β-글루코시다제 효소활성을 100%로 하였을 때 각 시료를 첨가하였을 때의 효소활성을 비교한 비율(%)로 잔여 효소활성을 확인하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었으며, 도 20에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 20의 결과에서와 같이, 10mU의 인간유래 α-아밀라제 효소활성을 100%로 하였을 때 꾸지뽕 열매 발효식초를 5㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 99.19±0.25%, 10㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 89.72±3.37%, 20㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 잔여활성이 86.01±1.08%, 50㎍/㎖ 농도로 처리하면 잔여활성이 59.95±1.36%, 100㎍/㎖ 농도로 처리하면 잔여활성이 54.66±2.06%이었다.
(3) 효소 저해효능
상기 잔여 효소활성을 분석하여 꾸지뽕 열매 발효식초의 β-글루코시다제 저해효능을 분석하였다. 그 결과를 도 21에 나타내었으며, 도 21에서 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
도 21의 결과에서와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초의 β-글루코시다제 저해효과는 5㎍/㎖ 농도에서 0.81%, 10㎍/㎖ 농도에서 10.28%, 20㎍/㎖ 농도에서 13.99%, 50㎍/㎖ 농도에서 40.05%, 100㎍/㎖ 농도에서 45.34%로 확인되었다. 이와 같이, 꾸지뽕 열매 발효식초의 β-글루코시다제 저해효과는 1~45%로, β-글루코시다제 저해제인 사이클로펠리톨(cyclophellitol)의 저해율 약 90%에 비해 낮은 저해효과를 보였다.
<실험예 12>
동역학을 이용한 비만 관련 효소 활성 저해 분석
꾸지뽕 열매 발효식초 내 유효성분인 p-하이드록시벤질 알코올(p-Hydroxybenzyl alcohol)의 지방분해효소 및 당분해효소 저해활성의 동역학(kinetics)을 분석하였다.
체지방 감소 관련 항비만 활성에 대한 타겟으로 지방 소화 및 흡수 저해기전, 당 소화 및 흡수 저해기전을 선정하였고 이에 대한 당의 소화 및 흡수 지표인 글루코시다제, 지방의 소화 및 흡수 지표인 췌장 리파아제의 동역학적 활성을 분석하여 표적에 대한 저해패턴을 도출하였다.
동역학 분석은 라안위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plot)을 활용하여 미카엘리스-멘텐 상수(The Michaelis-Menten constant)(Km), 최대속도(maximal velocity)(Vmax)를 구하고 촉매속도상수(catalytic rate constants)(Kcat)와 Kik, Kiv 저해상수(inhibition constants)를 도출하고 이들 값을 토대로 저해특성[경쟁적(competitive), 비경쟁적(noncompetitive), 무경쟁적(uncompetitive) 또는 혼합 저해 특성(mixed inhibition type)]을 결정하였다.
1. 꾸지뽕 열매 발효식초 내 p -하이드록시벤질 알코올의 지방분해효소 저해활성의 동역학 분석
p-하이드록시벤질 알코올은 동물유래 지방분해효소의 활성을 50% 저해하는 농도가 2.34μM(IC50)이고, 인간유래 지방분해효소의 활성을 50% 저해하는 농도가 3.70μM(IC50)인 것으로 분석되었다.
p-하이드록시벤질 알코올이 지방분해효소를 저해하는 활성의 동역학 분석을 통해 Km(기질농도), Vmax(최대반응속도), Kcat(시간당 전환 기질농도), Kcat/Km를 분석하고 저해 패턴 분석을 위해 이를 이용한 Kik(기질의 저해상수), Kiv(반응속도의 저해상수), Kik/Kiv 값을 도출하였고, 그 결과를 도 22와 표 3에 나타내었다.
표적 효소의 저해에 대하여 라인위버-버크 플롯을 사용하였고, 플롯은 인간유래 췌장 리파아제에 대한 저해제인 HBA를 첨가하지 않은 경우(control), 10㎍(0.8μM) 또는 20㎍(1.6μM)의 HBA를 첨가한 경우에 대하여 1/속도(1/V) 대 1/기질(1/S)로 표현하였다. 표 3에서 V max와 K m 값은 도 22에 나타낸 데이터로부터 라인위버-버크에 따라 계산하였고, 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
효소 HBA
(μM)		 K m
(mM)		 V max
(mU/min)		 K cat
(s-1)		 K cat/K m
(mM/s)		 K ik K iv K ik/K iv
인간유래
췌장
리파아제		 0 0.620
±
0.020		 0.120
±
0.004		 1.15
±
0.04		 1.839
±
0.013		 0.578
±
0.352
mM		 0.052
±
0.004
mM		 11.14
0.8 0.547
±
0.026		 0.070
±
0.003** 		0.67
±
0.03** 		1.223
±
0.005**
1.6 0.509
±
0.063* 		0.040
±
0.002** 		0.38
±
0.02** 		0.753
±
0.070**
(HBA 무처리군(0μM)과 비교하여 *P < 0.05, **P < 0.01이다.)
도 22와 표 3의 결과에서와 같이, p-하이드록시벤질 알코올을 처리하지 않았을 때 Km, Vmax, Kcat, Kcat/Km 값은 순서대로 0.620±0.020mM, 0.120±0.004mU/min, 1.15±0.04/s, 1.839±0.013mM/s이었다. 동일한 조건에서 p-하이드록시벤질 알코올 0.8㎍을 처리하였을 때 Km, Vmax, Kcat, Kcat/Km 값은 순서대로 0.620±0.020mM, 0.120±0.004mU/min, 1.15±0.04/s, 1.839±0.013mM/s, 동일한 조건에서 p-하이드록시벤질 알코올 1.6㎍을 처리하였을 때 Km, Vmax, Kcat, Kcat/Km 값은 순서대로 0.620±0.020mM, 0.120±0.004 mU/min, 1.15±0.04/s, 1.839±0.013mM/s 이었다.
Km, Vmax, Kcat, Kcat/Km 값을 토대로 Kik, Kiv, Kik/Kiv 값을 도출하였을 때 p-하이드록시벤질 알코올이 고농도로 존재할 때 Kik, Kiv, Kik/Kiv 값은 순서대로 0.578±0.352mM, 0.052±0.004 mM, 11.14이었다.
Kik와 Kiv 값이 결정되면 Kik/Kiv 값을 도출하여 저해제 특성을 결정할 수 있다. Kik/Kiv 값이 1~2이면 무경쟁적 저해 특성(uncompetitive type)으로 결정하고 2~5이면 혼합 저해 특성(mixed competitive type)으로 결정하며, 5 이상이면 경쟁적 또는 비경쟁적 저해 특성(competitive or noncompetitive type)으로 결정한다.
Kik/Kiv 값이 11.14인 것으로 볼 때 p-하이드록시벤질 알코올이 인간유래 지방분해효소를 경쟁적 또는 비경쟁적 저해 특성(competitive or noncompetitive type) 또는 무경쟁적 저해 특성(uncompetitive type)으로 저해하였음을 알 수 있다.
2. 꾸지뽕 열매 발효식초 내 p -하이드록시벤질 알코올의 당분해효소 저해활성의 동역학 분석
p-하이드록시벤질 알코올이 당분해효소의 활성을 50% 저해하는 농도는 9.08μM(IC50)인 것으로 분석되었다.
p-하이드록시벤질 알코올이 당분해효소를 저해하는 활성의 동역학 분석을 통해 Km(기질농도), Vmax(최대반응속도), Kcat(시간당 전환 기질농도), Kcat/Km를 분석하고 저해 패턴 분석을 위해 이를 이용한 Kik(기질의 저해상수), Kiv(반응속도의 저해상수), Kik/Kiv 값을 도출하였고, 그 결과를 도 23과 표 4에 나타내었다.
표적 효소의 저해에 대하여 라인위버-버크 플롯을 사용하였고, 플롯은 인간유래 췌장 리파아제에 대한 저해제인 HBA를 첨가하지 않은 경우(control), 10㎍(0.8μM) 또는 20㎍(1.6μM)의 HBA를 첨가한 경우에 대하여 1/속도(1/V) 대 1/기질(1/S)로 표현하였다. 표 4에서 V max와 K m 값은 도 23에 나타낸 데이터로부터 라인위버-버크에 따라 계산하였고, 각 값은 3회 측정에 대한 평균±SD를 나타낸다.
효소 HBA
(μM)		 K m
(mM)		 V max
(mU/min)		 K cat
(s-1)		 K cat/K m
(mM/s)		 K ik K iv K ik/K iv
α-글루코시다제 0 1.18
±
0.03		 0.079
±
0.001		 2658.9
±
60.5		 2252.3
±
3.8		 0.112
±
0.008
μM		 0.052
±
0.002
μM		 2.16
0.8 1.09
±
0.02** 		0.064
±
0.001** 		2162.5
±
29.7** 		1975.5
±
2.5**
1.6 0.93
±
0.02** 		0.050
±
0.001** 		1692.0
±
36.9** 		1813.5
±
3.4**
(HBA 무처리군(0μM)과 비교하여 *P < 0.05, **P < 0.01이다.)
도 23과 표 4의 결과에서와 같이, p-하이드록시벤질 알코올을 처리하지 않았을 때 Km, Vmax, Kcat, Kcat/Km 값은 순서대로 0.18±0.03mM, 0.079±0.001mU/min, 2658.9±60.5/s, 2252.3±3.8mM/s 였다. 동일한 조건에서 p-하이드록시벤질 알코올 0.8㎍을 처리하였을 때 Km, Vmax, Kcat, Kcat/Km 값은 순서대로 1.09±0.02mM, 0.064±0.001mU/min, 2162.5±29.7/s, 1975.5±2.5 mM/s, 동일한 조건에서 p-하이드록시벤질 알코올 1.6㎍을 처리하였을 때 Km, Vmax, Kcat, Kcat/Km 값은 순서대로 0.93±0.02mM, 0.050±0.001mU/min, 1692.0±36.9/s, 1813.5±3.4 mM/s 이었다.
Kik/Kiv 값이 2.16이고 1/Km 및 1/Vmax이 증가하는 특징을 가지는 것으로 볼 때 p-하이드록시벤질 알코올은 당분해효소를 혼합 저해 특성(mixed competitive type) 또는 무경쟁적 저해 특성으로 저해하였음을 알 수 있다.

Claims (3)

  1. 꾸지뽕 열매 1kg에 92~98℃의 온수 1.5~2.5ℓ를 혼합하여 해동한 후 마쇄하여 꾸지뽕 쥬스를 얻는 단계;
    상기 꾸지뽕 쥬스에 꾸지뽕 쥬스 1ℓ당 설탕 0.2~0.3kg을 혼합하여 꾸지뽕 쥬스의 당도를 높이는 단계;
    상기 당도를 높인 꾸지뽕 쥬스를 85℃에서 80~100분 동안 살균하는 단계;
    상기 살균된 꾸지뽕 쥬스를 25~30℃로 냉각하는 단계;
    상기 냉각된 꾸지뽕 쥬스에 사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin) 주모 배양물을 총량의 4~6부피%가 되도록 접종하고, 23~27℃에서 9~11일 동안 발효시켜 꾸지뽕 와인을 얻는 단계;
    상기 꾸지뽕 와인을 80~90℃에서 20~40분 동안 살균한 후 냉각하는 단계;
    상기 냉각된 꾸지뽕 와인과 분리균주로 제조한 초산균(Acetobacter aceti) 종초(산도 7.0~7.4)를 1:0.8~1.2의 부피비로 혼합하고 28~32℃에서 발효시키는 단계; 및
    발효 7일 후부터 7일 간격으로 발효식초 ℓ당 230~270㎖의 살균된 꾸지뽕 와인을 유가식으로 첨가하면서 총 21~42일 동안 발효시켜 꾸지뽕 열매 발효식초를 얻는 단계에 의하여 제조되는, 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 꾸지뽕 열매 발효식초의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    사카로마이세스 세레비지애 퍼미빈을 접종하고 2일 차에 셀룰라아제를 250~350ppm 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 꾸지뽕 열매 발효식초의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항의 방법에 의하여 제조된, 항비만 및 항고지혈효과가 우수한 꾸지뽕 열매 발효식초.


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