KR101314762B1 - 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물의 제조방법 및 이를 이용한 발효식품 - Google Patents
인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물의 제조방법 및 이를 이용한 발효식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물의 제조방법 및 이를 이용한 발효식품에 관한 것으로서, 더욱 바람직하게는 인삼의 지상부 중에서 인삼 뿌리와 차별적 성분과 조성을 갖는 인삼열매 또는 씨앗에서 추출한 추출물을 발효 균주로 발효시켜 소화/흡수율의 향상 및 기대치 않은 약리활성 효과(면역활성/억제, 항산화 등)를 기대할 수 있는 기능성 물질을 얻도록 한 것이다.
상기 인삼열매 또는 씨앗의 발효물을 얻기 위한 공정은 인삼열매 또는 씨앗을 미립분쇄기로 미세하게 파쇄한 후, 잡균의 성장을 막기 위해 고온 및 고압 용기인 오토클레이브(autoclave)에서 감압 멸균하고, 파쇄된 인삼열매 또는 씨앗을 증류수와 함께 약탕기를 이용하여 100 ℃에서 끓여 열수 추출을 하여 추출물을 얻는 공정과, 상기 추출물을 원심분리하여 세균 및 이물질을 제거하여 상층액을 필터로 여과하여 히터(Heater)로 건조시키는 공정과, 상기 건조된 인삼열매 또는 씨앗의 분말에 발효균주 L. plantarum, B. subtilis, L. casei 중에서 어느 하나를 선택하여 발효시켜서 발효물을 얻는 공정을 포함한 것을 특징으로 한다.
상기 인삼열매 또는 씨앗의 발효물을 얻기 위한 공정은 인삼열매 또는 씨앗을 미립분쇄기로 미세하게 파쇄한 후, 잡균의 성장을 막기 위해 고온 및 고압 용기인 오토클레이브(autoclave)에서 감압 멸균하고, 파쇄된 인삼열매 또는 씨앗을 증류수와 함께 약탕기를 이용하여 100 ℃에서 끓여 열수 추출을 하여 추출물을 얻는 공정과, 상기 추출물을 원심분리하여 세균 및 이물질을 제거하여 상층액을 필터로 여과하여 히터(Heater)로 건조시키는 공정과, 상기 건조된 인삼열매 또는 씨앗의 분말에 발효균주 L. plantarum, B. subtilis, L. casei 중에서 어느 하나를 선택하여 발효시켜서 발효물을 얻는 공정을 포함한 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물의 제조방법 및 이를 이용한 발효식품에 관한 것으로서, 더욱 바람직하게는 인삼의 지상부 중에서 인삼 뿌리와 차별적 성분과 조성을 갖는 인삼열매 또는 씨앗을 발효균주로 발효시켜서 추출한 발효물에 함유되어 있는 발효액 균주를 이용하여 소화/흡수율의 향상 및 기대치 않은 약리활성 효과(면역활성/억제, 항산화 등)를 기대할 수 있도록 하기 위한 것이다.
인삼은 다년생 반음지성 식물로 오가피과에 속하는 것으로서 중국, 한국의 다양한 의서에서 그 효능이 널리 알려져 있어 예로부터 많은 분야의 한약재로 사용하고 있다.
현대에 와서 인삼에 대해 널리 연구한바, 인삼에는 다량의 진세노사이드(Ginsenoside)가 함유되어 있는 것으로 알려져 예로부터 사용되는 약재 이외에도 근래에는 식품에 적용하여 건강식품의 재료로 많이 사용하고 있다.
인삼은 보통 재배기간이 4년 이상 소요되며, 또한 최고 품질의 인삼을 얻기 위해서는 6년간 재배하여야 하는데 재배기간이 오래 걸리고, 또한 재배하는 동안 각종 병충해, 자연재해 등 여러 가지 이유로 인해 최초 재배량보다 수확량이 적게 되어 가격이 비싸며, 인삼을 얻기까지 많은 시간이 소요되는 단점이 있다.
인삼은 땅 밑에 뿌리와 뇌두가 있으며, 땅 위에는 줄기, 잎, 열매로 이루어져 있다. 더욱 상세하게는 땅 밑의 세근, 지근 및 주근의 뿌리와 뇌두, 뇌두에서 연결된 줄기(경), 줄기로부터 뻗은 잎, 줄기 끝의 열매(화, 과실) 및 상기 줄기와 열매 사이를 이어주는 부분으로 작은 가지인 화병이 있다(도 1 참조).
인삼은 3년차 이상에서 인삼의 꽃이 피기 시작하며, 5월경에는 초록빛 색깔의 열매가 생기게 된다. 7월 중순이 되면 인삼의 초록빛 열매가 무르익으면서 붉게 변하면서 결실하게 된다.
인삼재배 농가에서는 인삼의 뿌리를 주로 활용하기 때문에 생식 성장보다는 뿌리의 성장을 촉진하기 위해 인삼열매가 생기기 시작하면 인삼열매를 따서 버리고 있는 실정이다. 이때 현장에서는 화경의 일부를 잘라서 화경과 인삼열매를 같이 한덩어리 상태로 따서 버리고 있다.
진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼에 함유된 사포닌(Saponin)을 의미하며, 인삼에는 다양한 종류의 진세노사이드 성분이 함유되어 있다. 인삼의 진세노사이드는 파낙사디올(Panaxadiol, PD)계, 파낙사트리올(Panaxatriol, PT)계, 올레안(Oleanane)계 등이 있다. 또한, 인삼에는 상기 진세노사이드 성분 이외에도 비진세노사이드 물질로서 전분 등의 탄수화물, 폴리아세틸렌의 항산화성방향족 화합물, 간장을 보호하는 고미신(Gomisin N-A), 유사인슐린 작용을 하는 산성 펩티드 등이 있다.
진세노사이드의 주요 약리작용은 중추신경계를 비롯하여, 내분비계, 면역계, 대사계등에 영향을 미쳐 신체조절기능에 다양한 효과를 발휘한다. 그 이외에도 진세노사이드(ginsenoside)는 지방분해력이 크고, 영양분흡수와 소화를 촉진시키며, 세포내의 효소활성화로 신진대사촉진, 에너지를 증가시켜 원기회복, 피로, 무력감, 식욕부진 개선, 혈청단백질 합성을 촉진 등의 효과가 있다고 알려져 있다.
인삼뿌리보다 인삼열매에 월등히 많은 진세노사이드 Re는 중추신경억제 작용, DNA 및 RNA 촉진작용, 프라스민 활성화 작용, 부신피질자극호르몬 분비 촉진작용을 하는 것으로 알려져 있고, Rd 는 부신피질 호르몬 분비촉진작용을 하며, Rb2는 중추신경억제 작용, DNA 및 RNA 합성 촉진 작용, 프라스민 활성화 작용, 부신피질자극호르몬 분비촉진작용, 항당뇨 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
그러나 상기 인삼열매 및 인삼화경은 인삼뿌리의 성장을 위해 인삼에서 제거된 후 그냥 버려지고 있어 인삼열매, 인삼화경에 함유된 진세노사이드의 이용이 부족한 실정이다.
본 발명은 상기와 같이 "진세노사이드 Re"라는 사포닌 성분이 많이 함유된 인삼열매 또는 씨앗을 발효 균주로 발효시켜 얻은 발효물에 함유되어 있는 발효액 균주로 면역활성/억제, 항산화, 생리활성물질의 비당화 즉, 당 제거가 효과적으로 일어나는 발효식품을 제조하고자 함을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 인삼열매 또는 씨앗에 plantarum, B. subtilis 및 L. casei의 발효균주를 첨가하여 효과적으로 발효시켜서 매우 밀도가 높고 생장활성을 유지하는 발효물 및 발효식품을 제조하고자 함을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 갖는 본 발명의 인삼열매 또는 씨앗을 발효시킨 발효물 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법에 대하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 인삼열매 또는 씨앗을 미립분쇄기로 미세하게 파쇄한 후, 잡균의 성장을 막기 위해 오토클레이브(autoclave 고온/고압 용기)에서 감압 멸균하고, 파쇄된 인삼열매 또는 씨앗을 증류수와 함께 약탕기를 이용하여 100℃에서 끓여 열수 추출을 하여 열수 추출물을 얻는 공정과,
상기 열수추출물을 원심분리하여 세균 및 이물질을 제거하여 상층액을 필터로 여과하여 히터(Heat/IR convection system)로 건조시키는 공정과,
상기 건조된 인삼열매 또는 씨앗에 발효균주 L. plantarum, B. subtilis, L. casei 중에서 어느 하나를 선택하여 발효시켜서 발효물을 얻는 공정을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 발효균주는 MRS-agar plate에 접종하여 stock plate를 만들고 MRS broth에 3회 계대 배양 후 원심분리 (3,000g, 20min)한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 추출물에 발효균주를 첨가하여 멸균 시험물질 mL 당 107~108수준으로 유산균을 접종하여 20~45℃에서 12, 24, 36, 48시간 동안 배양한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 발효시킨 인삼열매 또는 씨앗에 발효균주 액을 첨가하여 멸균 시험물질 mL 당 107~108수준으로 유산균을 접종하여 37℃에서 72시간 동안 배양한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 인삼열매 또는 씨앗을 발효시킨 발효물을 이용하여 환, 분말, 과립 또는 티백으로 발효식품을 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 인삼열매 또는 씨앗을 발효균주인 L. plantarum, B. subtilis, L. casei 중에서 어느 하나를 선택하여 발효시켜서 추출한 발효물에 함유되어 있는 발효액 균주는 발효과정에서 많은 변화가 일어나기 때문에 고기능성 물질로 변환될 가능성이 매우 높다. 따라서, 상기 인삼열매 또는 씨앗을 발효균주로 발효시킨 발효물은 항산화 및 면역활성이 좋아 약리활성이 높은 고기능성 소재인 당 제거 식품에 매우 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 인삼을 나타낸 정면도이다.
이하, 본 발명에 따른 인삼열매 또는 씨앗을 발효균주를 이용하여 발효시킨 발효액의 바람직한 실시 예를 상세히 설명하며, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지기술 등은 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 자세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 인삼열매 또는 씨앗을 발효시키기 위해 유용한 발효균주 선정 및 발효 조건을 탐색하여 식품으로 제조하고자 하는 목적으로 개발하였다. 특히, 인삼은 동일 분량의 인삼열매 또는 씨앗을 분석한 결과, 사포닌이 뿌리보다 2배 이상 함유돼 있는 것으로 보고되고 있으며, 인삼열매 또는 씨앗에는 항산화 효과가 있는 비타민E가 같은 분량의 잣·깨보다 2~3배 많이 들어 있고, 치매·당뇨병·아토피성 피부염 등에 효과를 보이는 아연도 함유되어 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 인삼열매 또는 씨앗이 주목을 받기 시작한 것은 '진세노사이드 Re'라는 인삼열매의 독특한 사포닌이 당뇨병과 비만을 예방한다는 연구에서 비롯되었으며, 국내에서도 인삼열매 또는 씨앗의 성분과 효능에 대한 연구가 본격화되고 있다.
최근 인삼열매 또는 씨앗에서 올리브유의 올레인산과 비슷한 특성을 보이는 물질이 발견되어, 이 물질을 유용하게 활용하면 올리브유와 유사한 혈행 개선 효과 등을 기대할 수 있을 것으로 예측되며, 또한, 쥐를 이용한 실시 예에서 인삼열매 또는 씨앗 투여 시 높은 스태미너 효과가 관찰되어 유용한 기능성 소재로도 흥미로운 연구의 대상이 되고 있다.
인삼열매 또는 씨앗은 사포닌 성분과 함께 항산화 효과가 뛰어난 비타민E와 안토시아닌 성분이 풍부하게 함유돼 있어 노화 방지 효과가 인삼 뿌리보다 더 좋을 것으로 생각되며, 인삼열매 또는 씨앗에는 사포닌의 주 성분인 진세노사이드 Re가 식물성 에스트로겐과 비슷한 역할을 해 여성 갱년기 증상을 완화하는데도 도움을 주는 것으로 알려져 있다.
일반적으로 약용 식물은 줄기, 잎, 뿌리, 열매에 모두 약효가 있다고 보고 전초(全草)를 사용하는데, 인삼열매 또는 씨앗에도 사포닌, 안토시아닌 등 기능성 성분이 함유돼 있어 기능성 소재로서 활용도가 높을 것이다.
따라서 본 발명은 인삼열매 또는 씨앗의 발효를 통한 생리 활성물질의 비당화 즉 당제거가 효과적으로 일어나는 유용한 균주를 선발하고자 연구를 거듭하였다.
학술적으로 인삼의 사포닌 성분은 장내 미생물에 의해 대사되어 흡수가 일어나게 되므로, 본 발명을 통해 구축되는 결과에 따라 향 후 개발될 기능성 식품의 소화/흡수율의 향상 및 기대치 않은 약리활성 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물을 얻기 위한 실시예에 대하여 설명한다.
1) 인삼열매 또는 씨앗의 가공
인삼열매 또는 씨앗의 각 100g을 미립분쇄기로 미세 파쇄한 후 잡균의 성장을 막기 위해 오토클레이브(outoclave; 고압용기)에서 감압 멸균하고, 1.5 L 멸균 3차 증류수와 함께 약탕기를 이용하여 100℃에서 2시간 끓여 열수 추출을 하여 추출 원액을 고농도 (100%) 및 저농도 (추출원액(25%):멸균증류수(75%))로 분류하여 원료로 사용하였다.
그리고 발효 전 추출물 및 발효 후 추출물의 생리활성 효능검색을 위해 각 추출물을 5000rpm에서 15분간 원심분리하여 세균 및 이물질을 제거하였고 상층액을 0.22 ㎛ filter로 여과한 후 히터(Heat/IR convection system)로 건조시켜 세포 및 비세포 활성 실시 예에 사용하였다.
Stock solution으로서 100 mg/mL을 준비하였고 실시 예의 실험 전까지 -20℃ 에서 보관하였다.
또한, 상기 본 발명의 인삼열매 또는 씨앗을 발효시키기 위한 발효균주를 선별하고, 발효시 조건에 대해서 살펴보고자 한다.
2) 발효균주 선별
아래와 같은 식물계 유산균 및 장관계 유산균 (Lactobacillus spp.) 중 각각 2종씩 및 청국장균을 사용하여 생체 친화도가 높은 균주를 사용하였다. 모든 균주는 실험의 일관성과 정확성을 위해 한국미생물보존센터 (KCCM)로부터 구매하여 제시된 배양 방법을 준용하여 사용하였다.
식물계 유산균 : L. plantarum (KCCM 11322), L. brevis (KCCM 11509)-김치, 채소절임, 사일리지 등 채소류의 발효 시 생육하는 유산균이다.
* L. plantarum은 김치균으로서 김치가 익는 중기/후기에 작용하는 균이며 다른 해로운 균을 사멸하는 특징을 갖고 있는 균이다. 따라서 본 실시예에서 일차적 대상으로 고려하여, 세밀한 관찰을 수행하였다.
장관계 유산균 : L. casei (KCCM 12452), L. fermntarum (KCCM 35461)-사람이나 가축의 장관계에서 활동하는 유산균이다.
청국장균 : Bacillus subtilis (KCCM 41459)-콩 발효에 최적화된 균주이며, 타 균주에 비해 단백분해 능이 뛰어나 발효 후 소화흡수가 빠르게 일어난다.
3) 발효조건
- 상기 균주들을 MRS-agar plate에 접종하여 stock plate를 만들고 MRS broth에 3회 계대 배양 후 원심분리 (3,000 g, 20 min)한 다음 cell pellet을 준비하였다. 배양 발효실험은 멸균 시험물질 mL 당 107~108 수준으로 유산균을 접종하여 20~45℃ 에서 12, 24, 36, 48 시간 동안 최적 배양 조건을 확보하였다. 본 실시 예에서는 25℃와 35℃ 에서 비교할 수준의 pilot 결과로부터 2 points의 온도와 0, 12, 24, 48, 72시간의 경시적 변화를 두고 최적의 발효조건을 탐색하였다. 유산균 계대배양에 사용된 배지는 다음과 같다.
* Lactobacillus -> MRS media (Difco)
* Bacillus -> Nutrient media (Difco)
- 최적발효조건은 균주의 생장능을 관찰하기 위해 고체배지 (solid agar)에서 dropping후 생장 수준과 streaking 후 생장패턴을 비교하여 탐색하였다.
4) 활성실험
o 인삼/증포 열수추출물 (원액)과 발효 후 얻어진 발효물질간 성분 변화는 TLC (thinelayer chromatography)법과 IR (infrared) 법을 사용하여 상호 비교 관찰을 하였다. 본 발명에서 주어진 활성물질의 대상이 포괄적이므로 전체 비교를 수행하였다.
o 항균활성실험
-항균활성실험은 Disc diffusion 실험을 적용하여 충치균인 Sterptococcus mutant, Streptococcus sobrinus 및 여드름 등 피부에 일반적으로 존재하여 다양한 피부질환을 유발하는 Staphylococcus epidermidis에 대한 항균활성을 탐색하였다.
본 실시예를 위해 원액 및 발효 후 얻어진 배양액 상층액을 원심분리 및 membrane filter (Milipore)로 제균하여 순수 상등액을 얻었다 (항균실험은 본 연구실에서 최적화 된 Disc diffusion법을 사용함).
o 면역활성실험
-면역활성실험은 Balb/c mice의 비장세포(splenocyte)를 사용하여 평가하였다. 즉, 비장에 모여 있는 면역세포 (T 세포 및 B 세포)의 분화/증식효과를 토대로 실험물질에 의한 면역세포반응 유무와 더불어 면역활성효과가 있는지를 평가하였다. 인삼의 효과에서 면역증진효과가 다양하게 보고되고 있으므로 본 실시 예에서는 실험물질의 mitogenic effect를 평가하고자 하였다.
o 항산화실험
-항산화실험은 비세포실험으로서 DPPH assay 및 Protein degradation inhibition assay를 수행하였다.
DPPH assay
- 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH, 0.1 M)을 함유한 methanol 용액 (3 ml)을 제조하여 각 농도별(1-100 ㎍/mL) 시험물질을 넣고 실온에서 0, 1, 2, 5, 15분간 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Hydroxyl radical (OH.) 유도 산화반응 억제효능-Protein degradation inhibition assay
- Bovine serum albumin (BSA) 용액 제조(0.5 mg/ml PBS)
- 농도별(1-100㎍/ml) 시험물질에 이어 100μM Cu2+ 및 2.5 mM H2O2를 (2.5 mM) 가하고 37℃에서 산화반응 유도하였다.
- 10% SDS-PAGE로 전기영동 후 0.1% Coomassie blue로 염색 한 후 산화반응으로 소실된 BSA 단백질 band 분석하였다.
이하에서는 본 발명에 따른 발효물을 얻기 위한 발효균주의 실험결과에 대하여 살펴보기로 한다.
1) 발효균주 평가
발효균주의 생장능 평가
다양한 적정 발효균주를 탐색하기 위해 다양한 평가를 수행하였다. 즉, 본 실시 예에 사용된 5종의 균주 (L. fermentum, L. plantarum, L. brevis, B. subtilis, L. casei)를 25℃ 와 35℃ 군으로 나누고 저농도/고농도 및 0~72시간 별 균주의 생장 및 생장억제 여부를 판단하였다.
실시 예에 사용된 물질은 시료에 107∼108/mL 수준으로 접종하여 각 시간별 발효가 종료된 시점에서 확보하였다. 실험결과 객관적 평가는 아래의 [표 1]과 같다.
상기의 [표 1]에서와 같이 발효균주의 생장능은 L. plantarum과 B. subtilis에서 우수한 것으로 판단되었고, 이러한 특징은 인삼과 증포에서 특별한 차이점은 없을 것으로 생각된다.
② 발효균주의 활성능 평가 (I)
각 발효균주의 healthy 상태를 확인하기 위해 고체배지 위 dropping 방법을 통해 동일 배양조건에서 생장하는 패턴을 관찰하여 비교분석을 하였다. 각 균주는 발효균주 생장능 평가와 동일한 조건으로 배양한 결과물을 사용하였다. 본 실시 예는 발효균주와 발효물질 간의 상호적합성을 알려주는 정보가 될 것으로 판단하였다. 실험결과 객관적 평가는 아래의 [표 2][표 3]과 같다.
상기 [표 2][표 3]의 결과는 72시간 배양시간 동안 각 시점별 균주의 활성도를 평가하는 방법으로서 균주의 시점별 특이성을 확인하고 배양기간의 증감에 따른 환경적응성을 아울러 평가할 수 있다.
따라서 본 실시 예에서 나타난 결과 배양시간의 안정성은 25 ℃ 배양조건에서 발효균주 L. plantarum, B.subtitlis 및 L. casei에서 높을 것으로 예상되며, 35 ℃ 배양조건에서는 B. subtilis에서 우수할 것으로 판단되었다.
③ 발효균주의 활성능 평가 (II)
각 발효균주의 healthy 상태를 확인하기 위해 수행한 각 시점별 균주를 혼합하여 고체배지위 streaking 방법을 통해 전반적인 활성능을 평가하였다. 본 실시 예에서는 발효 후 각 균주의 성장패턴 및 colonization의 경향성을 확인하고자 하였다.
상기 [표 4]의 결과로부터 전반적인 발효균주가 발효물질을 효과적으로 발효하고 활성을 유지하는지를 예측할 수 있다. 결과에 나타난 바와 같이 매우 밀도가 높게 생장활성을 유지하는 균주는 L. plantarum, B. subtilis 및 L. casei 등인 것으로 연구되었다.
④ 발효균주 선정 결과
상기 [표 4]의 결과를 토대로 아래와 같이, 인삼열매/증포 또는 씨앗의 발효액에 용이한 균주로서 L. plantarum과 B. subtilis를 선정하였다. 그 다음의 균주로는 L. casei을 선정하였다.
2) 발효물질의 효능평가
① 항균실험
발효물질의 항균력을 확인하기 위해 3종의 균주 (Sterptococcus mutant, Streptococcus sobrinus, Staphylococcus epidermidis)를 대상으로 disc diffusion 방법을 제공하였다. 실험의 타당성 확인을 위해 양성대조군으로서 2 종의 항생제 (Streptomycin/Tetracyclin)를 비교하였다. 발효물질은 발효균주로서 적합할 것으로 판단되는 L. plantarum, B. subtilis 시료를 동결건조하여 발효전 시료와 비교분석하였다. 그러나 [표 6]에 나타난 바와 같이 본 실험물질의 항균력은 관찰되지 않았다.
② DPPH 항산화실험
DPPH 소거 활성 측정은 항산화 활성을 측정하는데 사용하는 실험으로서 DPPH라는 산화제로 산화를 개시한 후 Sample에 의해서 radical에 대한 소거 능력을 측정하는 실험이다.
아래의 결과에서 같이 반응 개시 후 10분내 인삼/증포 발효물질의 각 발효균주 별 라디칼 소거능력 여부를 확인 한 결과 증포 발효물질에서 우수한 항산화효과가 있음을 확인하였다. 이러한 효과는 증포 추출물 및 발효물질에서 매우 우수한 항산화효과가 예측되었다.
③ Hydroxyl radical (OH.) 유도 산화반응 억제효능
본 실험은 금속촉매이온반응을 유도하여 생성된 산화물질이 단백질 (bovine serum albumin)을 공격하게 하는 실험법이며, 인삼/증포 발효물질의 각 발효균주 별 처치 경우 산화물질에 의한 단백질 degradation을 억제하는지 확인하고자 하였다. 아래 SDS PAGE에서 나타난 바와 같이 비발효 및 인삼/증포 발효물질 처치 시 유효한 산화반응 억제효과가 있음이 확인되었으나 35℃ 배양조건에서 B. subtilis 발효 시 산화반응 억제효과가 사라지는 특징을 발견하여 본 결과의 배경 대한 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
④ 발효물질의 면역활성실험
인삼열매 또는 씨앗의 발효물질이 면역세포에 반응하여 면역활성효과를 나타내는지를 확인하였다. 본 실시 예에서는 면역세포들이 모여 있는 Balb/c mouse의 비장을 적출하여 비장세포를 준비하여 T cell과 B cell에 대한 증식효과 (mitogenic effect)를 입증하고자 하였다.
위의 결과에서와 같이 인삼열매 또는 씨앗의 발효 및 비발효 물질에서 면역활성 반응이 관찰되었고, 이 효과는 증포의 경우에서보다 민감하게 반응할 것으로 사료되었다.
3) 발효물질의 TLC (thin layer chromatography) 분석
본 실시예에서는 인삼열매 또는 씨앗의 발효전 발효후의 성분패턴의 변화를 예측해 보고자하였다. 결과에서 나타난 바와 같이 발효전 (Cont) 추출물은 발효 후 패턴의 변화가 관찰되었고 B. subtilis에서 보다 강하게 나타났다.
본 실시 예를 통해 유용한 발효균으로 판단되는 L. plantarum과 B. subtilis는 우리에게 친숙한 김치균 및 청국장균으로 분류되어있어 향 후 인삼열매 추출 발효물의 산업화에 매우 적합할 것으로 연구되었다.
특히, L. plantarum은 발효과정에서 잡균의 생장을 저해하는 특징을 가져 발효기간의 다양성을 제공할 수 있을 것이며, B. subtilis는 발효 시 다수의 영양소가 이온화되거나 유기산, 비타민류 및 펩타이드가 좋은 구조로 바뀌는 등의 기능성화를 증진시켜주어 최종 발효물의 활용에 다양성을 제공할 것으로 연구되었다.
최근 보고에 따르면 홍삼을 발효하였을 때 특이 사포닌과 사포닌 대사물이 생성되어 장내 흡수율이 높아져 생리활성이 최대화될 수 있다. 이는 우리가 인삼을 섭취할 때 활성성분인 사포닌이 장의 미생물에 의해 대사되어 흡수됨을 고려할 때 본 실시예에서와 같이 유용한 발효균을 통한 추출물 발효는 그 활용도가 매우 클 것으로 판단된다. 본 실시 예에 사용된 인삼 열매에는 뿌리에 비해 2배 이상의 사포닌이 함유되어있음이 알려져 있어 발효과정을 거칠 때 고기능성 물질로 변환될 가능성이 매우 높다. 이와 같은 예상은 본 실시예에서 수행한 항산화 및 면역활성 결과에서 확인할 수 있다. 또한, TLC결과에서 발효 전 대비 발효 후의 물질의 전개도를 비교할 때 발효 후 특징적인 전개가 관찰되어 향후 물질 분석이 이루어진다면 매우 흥미로운 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 결론적으로 본 실시 예에서 얻어진 발효균에 의한 발효물질이 산업적 및 경제적으로 큰 파급효과를 가질 것으로 예상되며, 특히 항산화 및 면역활성 등의 약리활성이 고기능성 소재로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시예로써 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물이 당뇨개선에 효율적임을 나타내는 실험에 대하여 설명하고자 한다.
1) 인삼열매 또는 씨앗의 가공
본 발명의 인삼열매 또는 씨앗을 발효균주로 발효시키기 위한 인삼열매 또는 씨앗의 가공은 전술한 실시 예와 동일하게 가공하여 준비한다.
2) 발효균주의 선별
그리고 발효균주는 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 구매한 L. plantarum (KCCM 11322)를 사용하였다.
* 사용균주 L. plantarum (KCCM 11322)
-김치, 채소절임, 사일리지 등 채소류의 발효 시 생육하는 유산균
-L. plantarum은 김치균으로서 김치가 익는 중기/후기에 작용하는 균이며 다른 해로운균을 사멸하는 특징을 갖고 있는 균으로서 시전연구에서 실험물질의 발효에 최적조건을 가지는 것으로 판단되었다.
3) 발효조건
-발효균주인 L. plantarum를 MRS-agar plate에 접종하여 stock plate를 만들고 MRS broth에 3회계대 배양 후 원심분리 (3,000 g, 20 min)한 다음 cell pellet을 준비하였다. 배양 발효실험은 멸균 시험물질 mL 당 107~108수준으로 유산균을 접종하여 37℃ 에서 72℃ 시간 동안 최적 배양 조건을 확보하였다.
-발효의 정도관리: 균주의 생장능을 관찰하기 위해 고체배지 (solid agar)에서 dropping후 생장 수준과 streaking 후 생장패턴을 확인하면서 발효를 성공적으로 수행하였다.
4) 실험동물 및 투여
- 식약청 가이드라인 "생약(한약)제제의 효력시험 지침 -당뇨병-"을 참고함
- 비만형 제2형 당뇨병모델: 8주령의 수컷 C57BL/KsJ-leprdb/leprdb (db/db) 마우스와 대조군으로 C57BL/KsJ db/m+ lean 마우스를 사용함
- 제1형 당뇨병모델 (IDDM):
- 최초 입수 후 일주일간의 안정화기간을 주고, 각 군당 5마리의 male C57BL/6 (5~6주령)를 각 군으로 분리 후 STZ (streptozotocin)에 의한 IDDM 유발을 위해 40mg/kg을 5일간 연속 투여하여 IDDM을 유도하였음. 본 실시예에서 3회 투여 시 약 80%의 반응을 보였으며, 5일 째 100%의 반응이 관찰됨 (혈당농도 >200 mg/dl).
- 공복혈당을 측정하여 200~250 mg/dl 이상의 동물만을 선발
- 계획된 시점까지 (1형당뇨모델-28일, 2형당뇨모델-35일)간 시험물질 투여
- 실험기간 내 경구투여 (0.5 g/kg)
① 실험동물 요약
② 체중 및 사료/음수섭취량 측정
- 시험물질을 투여하면서 매주 체중 측정
- 매주 사료 및 음수섭취량 측정
③ 혈당변화 검사
- 시험물질을 투여하면서 1주 간격으로 미정맥 채혈
- ACCU-CHEK goTM을 이용하여 경시별 혈당농도 측정
④ 인슐린내성 검사 (insulin tolerance test; ITT)
- 마지막 시험물질 투여 후 1일 전 18시간 절식
- Insulin (5 U/kg)을 피하주사
- 0, 30, 60, 90, 120, 150분에 채혈
- ACCU-CHEK goTM을 이용하여 경시별 혈당농도 측정
⑤ 내당능 검사 (intraperitoneal glucose tolerance test; IGTT)
- 마지막 시험물질 투여 후 1일 전 18시간 절식
- Glucose (2 g/kg)를 투여
- 0, 30, 60, 90, 120, 150분에 채혈
- ACCU-CHEK goTM을 이용하여 경시별 혈당농도 측정
⑥ 혈액화학적 분석
- 부검시 혈액으로부터 CardioCheck tool을 이용하여 PTS PANELS Lipid Panel Test Strip (Polymer Technology System, USA)에 reading되는 triglycerides [TG], total cholesterol, high-density lipoproteins [HDL]) 등을 분석
⑦ 혈중 인슐린 분석
- 부검시의 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 Mouse Insulin ELISA Kit (Shibayagi, Japan)의 제조사 지침에 따라 혈중 인슐린을 분석
⑧ 장기중량 및 조직병리학적 검사
- 마지막 시험물질 투여 후 부검하여 췌장 (pancreas), 콩팥 (kidneys) 및 간 (liver) 적출, 콩팥과 간중량 측정
- 췌장에 대한 paraffin 조직절편 만들고 Hematoxylin & Eosin으로 염색하여 병리조직학적 관찰
⑨ Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 분석
- 각 군별로 처리된 mouse splenocyte 로부터 Trizol 방법(Invitrogen, USA)을 통해 총 RNA를 추출하였으며, 아래에 기재한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시
- 정량 real-time PCR 반응은 SYBR Green PCR master mix (Qiagen, USA)가 포함된 20μ1 반응혼합액내에서 Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Australia)을 이용하여 수행
- 예상되는 PCR 생성물 형성을 확인하기 위해 융해곡선(melting curve) 분석을 사용하였고, 모든 분석에서 생성된 생성물은 길이가 정확한지 확인하기 위해 1.2% 아가로스젤 전기영동에 의한 추가 테스트를 수행함
- 샘플의 비교 발현 수준은 Rotor-Gene 6000 Series Software 1.7을 사용하여 계산하였고, β-액틴에 대한 비교 값으로 표현하여 각 실험 사이의 변이를 보정하였으며, 실험 샘플들에 대한 데이터는 내부조절유전자의 백분율로서 나타냄
⑩ Spleen cell 계수 분석
-부검시 확보한 비장을 RBC lysis buffer를 이용하여 single splenocyte로 분리한 후 Hematocytometer기에서 읽혀지는 4 points cell 수를 계수하여 그의 평균값을 cells/mL로 측정 분석함
⑪ 평가
-각 대조군과 비교하여 시험물질 (FGSE)의 효능을 평가
-측정된 수치는 오차 등을 근거로 t-test, ANOVA test 등 적절한 통계법을 선택하여 분석
5) 연구결과
① 당뇨모델에서의 혈당조절 효과
시험물질의 작용기전이 다양하게 존재할 수 있으므로 본 실시에서는 인슐린의존형 (제1형) 및 인슐린비의존형 (제2형)의 동물모델을 이용하여 물질에 대하여 특징적으로 나타나는 효능을 검색하였다. 실험에 사용된 모델은 제1형 당뇨병 모델로서 저용량 streptozotocin 반복투여에 의한 췌장의 베타세포 사멸을 유도하여 사용하였으며, 제2형 당뇨병 모델로서 mouse의 4번 염색체에 leptin 수용체 유전자인 Lepr에서 point mutation이 일어나 당뇨가 유발된 개체를 사용하였다. 실험결과, [표 7]에서 나타난 바와 같이, 실험물질 FGSE는 제1형 당뇨에서 우수한 효능을 가질 것으로 예상되었으며 제2형 당뇨병 모델에서는 5주간 투여의 결과 무처치 db/db 군보다 혈당의 농도가 낮게 관찰되어 물질에 대한 일부의 당조절 효능을 가질 것으로 예상되나, 유의할 수준을 보이지 않고 고혈당 수준인 400~500 mg/dL를 유지하는 것으로 볼 때 제2형 당뇨병 모델의 경우 보다 장기적인 투여 (8주~12주) 후의 결과로 부터 판단을 하여야 한다.
Measurement of blood glucose in type 1(A) and type 2(B) diabetes mice.
The levels of blood glucose were measured for 28 or 35 days after 6-hour fasting at each time points. STZ; streptozotocin, FGSE; study compound.
② 당뇨모델에서의 체중조절 효과
제1형 당뇨병은 주로 소아나 30세 이하의 젊은이에게 다발하며, 다식, 다뇨, 다갈, 체중감소 등의 당뇨병 증상이 심하게 나타나는 특징을 가진다.
반면, 제2형 당뇨병은 비만 등의 원인으로 인슐린 저항성이 높아지게 되어 최종적으로 인슐린을 생산하는 췌장의 베타세포가 그 기능을 잃게 된다. 따라서 당뇨병 환자에게서 체중의 조절은 매우 중요한 인자로 인지되고 있어 본 실시예에서는 실험기간 내 각 개체의 체중변화를 주의 깊게 관찰하였다. 실험 기간 중 STZ로 제1형 당뇨병이 유발된 마우스에서 공통적으로 소변의 양과 물 섭취가 증가하는 것으로 관찰되었으며 정상군에서 체중의 증가와 반대로 STZ 단독 투여군에서 체중의 증가가 관찰되지 않았고 오히려 체중이 감소하는 전형적인 제1형 당뇨변 특징을 나타내었다.
반면 STZ+FGSE 투여군에서는 체중의 감소가 관찰되지 않았고 관찰 마지막 시점에서 증가하는 패턴으로 회향하는 경향을 나타내었다. 이와는 반대로 돌연변이에 의해 제2형 당뇨가 유발된 db/db mice의 경우 지속적인 체중의 증가가 관찰되었으나 FGSE 투여 군에서 체중의 증가가 투여 전의 체중을 유지하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 FGSE가 체중조절에 관여하고 있음을 반증하는 것이며, 특히 비만의 정도를 낮추어 줄 수 있는 체중조절에 대한 기능적 효능을 가지는 것으로 생각된다.
Measurement of body weight in type 1(A,C) and type 2(B,D) diabetes mice.
The levels of boyd weight were measured for 28 or 35 days after 6-hour fasting at each time points. STZ; streptozotocin, FGSE; study compound.
③ 당뇨모델에서의 내당능 (intraperitoneal glucose tolerance test) 분석
내당능은 생체가 포도당을 대사할 수 있는 능력을 의미하며, 측정은 포도당의 투여 경로에 따라 경구당부하검사, 복강당부하검사 및 정맥주사 당부하감사 등으로 나뉘며 본 연구에서는 복강투여에 의한 복강당부하검사를 수행하였다. 내당능 장애(impaired glucose tolerance, IGT)는 식후 혈당(postprandial hyperglycemia)의 특징을 나타내며, 당뇨병에 대한 명백한 위험인자이다.
또한 내당능 장애는 당뇨병 고유의 합병증 동반 여부와 상관없이 심혈관 질환의 위험인자이다. 현재까지 다수의 연구들을 통해 식후 고혈당이 당뇨병 및 심혈관질환의 독립적인 위험인자임이 밝혀졌다. 제2형 당뇨병을 엄격하게 치료하는 데는 많은 어려움이 따르므로, 당뇨병을 예방하는 것이 증가하는 유병률을 해결하기 위한 하나의 방법이 될 것이다. 당에 대한 내성은 췌장 베타세포가 인슐린 저항성을 상쇄할 수 있는 동안은 정상이다. 그러나 베타세포가 인슐린 저항성을 충분하게 상쇄하지 못하면 내당능 장애가 유발되어 특징적으로 식후 고혈당이 중등도로 증가한다. 이것은 당독성(glucose toxicity)을 유발하기에 충분하며, 나아가 인슐린 작용의 손상뿐 아니라 당부하에 대한 베타세포의 반응을 손상시켜 내당능 장애가 제2형 당뇨병으로 진행하는 데에 기여한다. 따라서 인슐린 저항성 또는 베타세포의 생산을 저하시키거나 식후 고혈당을 감소시켜 당뇨병 전단계인 내당능 장애를 조절할 수 있다면 제2형 당뇨병을 예방하거나 줄일 수 있을 것이다.
실험결과 비만형 제2형 당뇨모델인 db/db mice에서 FGSE 투여 시 무처치 db/db군 보다 효과적으로 내당능이 감소하는 것으로 나타났으며 이러한 결과는 FGSE 장기투여 시 제2형 당뇨 개선효과가 있을 것으로 기대된다.
Measurement of intraperitoneal glucose tolerance test in type 2 diabetes
mice. The levels of blood glucose were measured using ACCU-CHEK goTM for total 150 min (0, 30, 60, 90, 120, 150) after peritoneal injection of glucose.
④ 당뇨모델에서의 인슐린내성 검사 (insulin tolerance test) 분석
인슐린저항성을 측정하기 위하여 실시한 인슐린부하검사 (insulin tolerance tests; ITT)는 부검 전 8시간 금식 후 대상 쥐의 기저 혈당 측정 후 피하로 체중 kg 당 5 IU의 human insulin (Sigma, USA)을 투여 후 총 150분 동안 혈당을 측정하여 인슐린감수성을 비교하였다. 인슐린 저항성은 인슐린 비의존형 당뇨병인 제2형 당뇨병의 주요 병인이 될 뿐 아니라 비만, 고혈압, 이상지혈증 및 동맥경화증과 같은 대사질환의 발생과 밀접히 연관되어 있어 소위 인슐린 저항성 증후군 혹은 대사성 증후군의 근간을 이루는 것으로 알려져 있다. 당뇨병의 원인은 크게 인슐린 분비 부족과 인슐린 효과 감소(인슐린 저항성)로 나눌 수 있는데, 인슐린 내성 검사는 비교적 안전하고 재현성이 좋으며, 인슐린 저항성을 평가하기 위한 검사이다.
본 발명의 실시 예에서는 인슐린을 피하 주사 후 150분 동안 혈당을 관찰하여 인슐린내성 여부를 확인하고자 하였다.
[표 9]에서 나타난 바와 같이 무처치 db/db군에서 인슐린 내성이 있는 것으로 생각되며 반면 FGSE 투여 시 경시적으로 혈당이 감소하는 경향을 보여 db/db mice의 인슐린 내성이 개선되었음을 알 수 있었다.
Measurement of blood glucose in type 2 diabetes mice. The levels of blood glucose were measured using ACCU-CHEK goTM for total 150 min (0, 30, 60, 90, 120, 150) after subcutaneous injection of insulin.
⑤ 혈중 인슐린 ELISA 분석
본 실시예에서는 췌장의 베타세포에서 분비되는 인슐린의 혈중 분포농도를 측정하여 시험물질인 FGSE에 의한 효능의 여부를 관찰하고자 하였으며, 측정치의 정량을 위해 항원-항체 sandwich 방법인 Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)를 사용하여 비교적 정확한 상호간 비교분석을 하고자 하였다. 혈액샘플은 부검 시 확보하여 분리한 혈청을 사용하였다.
측정결과 [표 10]에 나타난 바와 같이 FGSE에 의한 인슐린 증가가 유의하게 관찰되었으며 제1형 및 제2형 당뇨병 모델 모두에서 동일한 패턴의 결과를 관찰하였다. 이러한 결과는 FGSE 투여 시 인슐린이 절대적으로 요구되는 제1형 당뇨병 환자에게 매우 유익한 치료결과를 예상할 수 있으며, 인슐린 내성이 개선된 상태의 제2형 당뇨병 환자에게서도 유익한 혈당 조절이 가능함을 예측할 수 있다.
Quantitative measurement of mouse insulin. The levels of serum insulin were analyzed using mouse insulin ELISA kit. Serum samples were obtained from each group of type 1 and type 2 diabetes models when sacrificed. NT; non-treated db/db mice.
⑥ 장기 무게 (organ weight)
장기투여로 인한 각 기관의 형태 및 무게변화를 분석하기 위해 부검 시 간, 신장, 비장 및 췌장의 무게를 측정하여 아래와 같이 비교 분석하였다. 관찰결과 뚜렷한 장기의 형태변화는 없었으나 아래 [도 12] 결과에서와 같이 무처치 db/db 군 비 FGSE 군에서 간 및 취장의 무게가 대조군 (db/m+)과 유사하게 관찰되어 FGSE에 의한 장기의 개선효과도 있을 것으로 예측되었다.
Comparison of organ weights in type 2 diabetes mouse model. NT; non-treated db/db mice.
⑦ 혈액화학적 분석 (total cholesterol, HDL cholesterol, triglyceride)
당뇨와 같은 대사증후군에서 나타나는 혈액화학적 특징이 질환의 중등도를 감지하는 중요한 지표로 활용됨으로 본 연구에서는 총 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 TG 등을 측정하여 FGSE에 의한 lipoprofile을 분석하였다. 일반적으로 비만 및 당뇨병 환자에서 HDL 콜레스테롤이 감소하는 것으로 나타나 총 콜레스테롤과 연동하여 분석이 가능하다. 아래 표1에서 제시하는 바와 같이 FSGE투여 시 무처치 db/db 군 보다 총 콜레스테롤의 수준이 50% 이하로 감소되어 성인병의 주요 원인으로 알려진 고지혈증, 동맥경화 등의 개선에 도움을 줄 수 있었다. 하지만 본 실시예에서 관찰된 db/db mice 모두에서 혈당이 최고점에 달해 FGSE의 장기투여 (8-12주)시 나타나는 결과로부터 보다 포괄적인 개선효과를 판단해야 할 것으로 사료된다.
혈중 총 코레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 중성지방 측정 결과
⑧ 면역세포 증식효과
제2차 면역기관인 비장에 존재하는 면역세포의 수를 계수하여 FGSE에 의한 면역활성 여부를 관찰하고자하였다. 당뇨병은 몸 안의 면역기능에 이상을 초래하여 세균에 대한 면역 능력을 감소시켜 여러 병균의 감염에 약하게 하는 등 전반적인 면역력 저하가 나타난다. 따라서 FGSE에 의한 면역부활이 가능하다면 다른 개념의 당뇨 개선 물질로 접근할 수 있을 것이다. 본 실시예는 single cell로 분리된 비장세포(면역세포)를 계수하여 각 군별 비교를 하였으며, [표14]에 나타난 바와 같이 무처치 db/db 군에 비해 FGSE 투여군에서 약 1.5 x 106 cells/mL의 면역세포가 더 존재하고 있는 것으로 관찰되었다. 이는 FGSE가 면역부활의 효능을 가지는 것을 반증하는 결과로 볼 수 있다. 또한, 비장에 존재하는 T 및 B 세포 증식관련 사이토카인의 mRNA expression level을 분석한 결과 FGSE에 의해 IL-2 및 TNF-a mRNA가 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. [표14]에서 관찰된 면역세포수의 증가와 상호일치하는 결과를 나타내었다.
비장 면역세포수
mRNA expression of T and B cell proliferation cytokine. mRNA expression of T cell and B cell proliferation cytokine, interleukin-2 and tumor-necrosis factor alpha, respectively, were analyzed using quantitative real-time PCR method in spleen of type 2 diabetes mice. Cytokines from low (1g/kg) and high (5g/kg) HGSE group were analyzed, quantitatively. Ctrl; control, NT; non-treated db/db.
⑨ 제1형 당뇨병 모델에서 사이토카인 mRNA 발현 분석
제1형 당뇨병은 장기 특이적인 자가면역 질환으로서, 다양한 속도로 진행되는 T 림프구와 대식세포 매개의 췌장 베타 세포 파괴로 인해 절대적인 인슐린의 부족을 보이게 된다. 특히 제1형 당뇨병의 경우 췌장 섬조직으로 유입되는 면역세포에 의해 분비되는 사이토카인이 베타세포에 해를 입히는 것으로 알려져 있으며, 이러한 과정은 보조 T 세포 (Th cell) 중 Th1 세포로의 분화에 따르는 것으로 결국 Th1/Th2의 균형이 깨지면서 제1형 당뇨병이 발생하게 된다. 따라서 본 연구에서는 FGSE를 투여한 군에서 적출한 비장조직의 mRNA를 분석하여 Th1/Th2 사이토카인의 발현 수준을 측정하고자 하였다. 분석결과 무처치 db/db 군에서 보다 FGSE 투여군에서 Th2 사이토카인인 interleukin-4 (IL-4)가 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다[표 15]. 이러한 결과는 FGSE 투여 시 Th2의 분화가 활발하여져 베타세포에 해로운 Th1 사이토카인인 interferon-gamma (IFN-)의 농도가 상대적으로 감소하는 것으로 생각된다.
mRNA expression of Th1/Th2 cytokines. mRNA expression of Th1 (IFN-) and Th2 (IL-4) cytokines was analyzed using quantitative real-time PCR method with spleen mRNAs obtained from STZ-induced type 1 diabetes mice (HGSE group, 5g/kg) were analyzed, quantitatively. Ctrl; control.
⑩ 췌장 조직염색 분석 (H&E staining)
췌장조직의 변화에 대한 관찰을 위해 부검일 획득한 췌장을 10% neutralized formalin에 고정한 후 paraffin embedding과정을 거쳐 hematoxylin-eosin (H&E) staining을 수행하여 광학현미경하에서 사진 캡쳐 및 비교를 하였다 (Olympus BX50, Japan).
본 실시에서 사용한 인삼열매 또는 씨앗의 발효물은 사전연구로부터 최적화된 발효조건을 바탕으로 제조하여 사용하였다. 특히 연구에 사용된 균주는 우리의 식생활에 항상 함께하는 김치균으로 잘 알려진 L. planatarum을 이용하여 72시간 동안 발효하였다. 전술한 바와 같이 일반적으로 약용 식물은 줄기, 잎, 뿌리, 열매에 모두 약효가 있다고 보고 전초(全草)를 사용하는데, 인삼 열매에도 사포닌, 안토시아닌 등 기능성 성분이 함유돼 있어 기능성 소재로서 활용성이 높을 것이다.
특히, 합병증의 정도가 심한 당뇨병의 경우 장기간에 걸친 고혈당 및 대사이상은 동맥경화, 신경장해, 각막증 및 신증 등을 유발하여 치명적 질환으로 발전해가는 특징을 가진다. 이러한 당뇨병 치료에 다양한 화학합성 제제가 임상적으로 사용되고 있으나 내성의 위험성이 존재하여 안전하고 효능이 확보된 천연기능성 물질의 개발이 요구되어왔다.
최근 인삼(뿌리)에 의해 당뇨병성 신증, 췌장기능회복, 인슐린 분비촉진 및 STZ 유도 당뇨병 모델에서 혈당강하 등의 효능이 있는 것으로 알려지고 있고, 이외에 다양한 당뇨개선 능에 대한 연구가 진행되고 있다. 인삼연구에서 일반적으로 적용되는 부분은 인삼뿌리 부분 (홍삼포함)으로서 인삼열매 또는 씨앗에 대한 연구는 미비한 실정이다. 당뇨병은 인슐린의 존형인 제1형 당뇨병과 인슐린비 의존형인 제2형 당뇨병으로 분류되어 치료법이 다양하게 존재한다. 제2형 당뇨병은 췌장에서 인슐린을 만들기는 하지만 충분한 양이 아니거나, 인슐린에 대한 반응이 저하돼있는 경우로 인슐린 치료가 반드시 필요하지는 않는 경우이며 성인성 당뇨병으로 분류되어 서구화된 식습관에 의해 우리나라에서도 증가일로 (전체당뇨병의 95% 차지)에 있는 비교적 일반적인 당뇨병의 일종이다. 반면 제1형 당뇨병은 인슐린을 만드는 췌장의 베타세포가 망가져 인슐린을 거의 만들지 못하기 때문에 인슐린 치료가 절대적으로 필요한 경우이다. 따라서 본 연구에서는 인삼열매 또는 씨앗을 최적화로 발효시키기 위한 발효균인 L. planatarum을 이용하여 발효하여 추출한 발효물을 연구물질로 사용하여 당뇨개선 능에 대한 포괄적 연구를 수행하였으며, 제1형 및 제2형 당뇨병 동물모델을 사용하여 연구물질인 FGSE의 다양한 당뇨개선 효능을 관찰하였다. 연구결과를 요약하면 아래와 같다.
위의 [표 17]에 나타낸 바와 같이 임상적으로 사용되고 있는 화학요법과 같은 극적 효과를 기대할 수준은 아니지만 FGSE는 전반적으로 당뇨개선 능을 가질 것으로 예측된다. 특히 인슐린 분비 촉진 기능이 우수할 것으로 사료됨으로 제1형의 경우 적극적으로 활용될 수 있는 기능성 소재로의 개발도 가능 할 것으로 생각되며 비만형 모델에서 FGSE 투여 시 체중의 증가를 억제하는 체중 조절 능을 보여 제2형 당뇨병 치료법의 중요한 보조요법으로 활용이 가능할 것으로 판단된다. 기전적으로는 FGSE가 Th2 사이토카인을 분비유도하여 췌장의 베타세포에 손상을 유발하는 Th1 사이토카인을 근본적으로 억제하는 약리학적 특징도 가지는 것으로 판단된다.
따라서 본 발명은 인삼열매 또는 씨앗을 발효시킨 발효물은 인슐린 분비 촉진에 의한 혈당강하효과 및 체중조절 효과로부터 제1형 및 제2형의 당뇨개선에 포괄적으로 사용할 수 있는 특징적 발효식품을 얻을 수 있다.
이때 상기 발효식품은 인삼열매 또는 씨앗을 상기 발효균주를 이용하여 발효시킨 발효물로 환, 분말, 과립, 티백으로 제조하면 된다.
Claims (6)
- 인삼열매 또는 씨앗을 미립분쇄기로 미세하게 파쇄한 후, 잡균의 성장을 막기 위해 고온 및 고압 용기인 오토클레이브(autoclave)에서 감압 멸균하고, 파쇄된 인삼열매 또는 씨앗을 증류수와 함께 약탕기를 이용하여 100℃에서 끓여 열수 추출을 하여 추출물을 얻는 공정과, 상기 추출물을 원심분리하여 세균 및 이물질을 제거하여 상층액을 필터로 여과하여 히터(Heater)로 건조시키는 공정과, 상기 건조된 인삼열매 또는 씨앗에 발효균주 L. plantarum, B. subtilis 또는 L. casei 중 어느 하나를 첨가하여 발효시켜서 발효물을 얻는 공정을 포함한 것을 특징으로 하는 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물의 제조방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 발효균주는 MRS-agar plate에 접종하여 stock plate를 만들고 MRS broth에 3회 계대 배양 후 원심분리한 것을 특징으로 하는 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물의 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기에 인삼열매 또는 씨앗에 발효균주 액을 첨가하여 멸균 시험물질 mL 당 107~108수준으로 유산균을 접종하여 37℃에서 72시간 동안 배양한 것을 특징으로 하는 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물의 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기에 발효시킨 인삼열매 또는 씨앗에 발효균주 액를 첨가하여 멸균 시험물질 mL 당 107~108수준으로 유산균을 접종하여 20~45℃에서 12, 24, 36, 48시간 동안 배양한 것을 특징으로 하는 인삼열매 또는 씨앗을 발효시켜 추출한 발효물의 제조방법. - 상기 제 1항, 제3항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항을 이용하여 얻어진 인삼열매 또는 씨앗의 발효물로 환, 분말, 과립, 티백으로 제조한 발효식품.
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