KR101915071B1

KR101915071B1 - 커피 로부스타 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 개선용 식품 조성물

Info

Publication number: KR101915071B1
Application number: KR1020160162874A
Authority: KR
Inventors: 김동구; 신지영; 경인구; 최수영; 유승현; 박진일; 정의숙; 박종형; 함승훈; 전희연; 김준영; 엄기동; 최양규
Original assignee: 주식회사 코시스바이오
Priority date: 2016-12-01
Filing date: 2016-12-01
Publication date: 2018-11-20
Also published as: KR20180062789A

Abstract

본 발명은 모나스쿠스 속(Monascus sp.) 균 및 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 내장지방 감소, 지질 및 지방산 합성 억제 및 분해, 혈당 감소 효과 등을 통하여 비만을 매우 효과적으로 예방 및 개선시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 비만 예방 및 치료 효능을 가지는 커피 로부스타 발효 추출물의 식품 및 의약으로서의 기초적인 자료를 제공한다.

Description

커피 로부스타 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 개선용 식품 조성물{Food Composition for Preventing and Improving Obesity Comprising Extracts from Fermented Coffee Robusta}

본 발명(Disclosure)은, 커피 로부스타 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 개선용 식품 조성물 및 비만 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

여기서는, 본 발명에 관한 배경기술이 제공되며, 이들이 반드시 공지기술을 의미하는 것은 아니다(This section provides background information related to the present disclosure which is not necessarily prior art).

비만은 에너지 흡수 및 소비의 만성적인 불균형으로 인하여 지방이 축적되는 질병이다. 2형 당뇨병, 이상지혈증, 고혈압 및 심혈관 질환과 같은 주요 건강 문제를 야기하는 비만은 전세계 인구에서 증가하고 있는 추세에 있다. 비만이 증가하면서 이을 치료하기 위하여 고가의 비효율적인 약물치료가 일반화되고 있는 것이 현실이다. 현재, 항-비만 치료를 위해서 천연물이나 한방 치료제가 대안으로 조명되고 있으며, 우리 몸에 특이적인 생리활성을 나타내는 기능성 식료품으로 건강개선식품 및 기능성식품이 개발 되고 있다.

천연물에 대한 관심이 증가되면서 식료품 첨가물과 건강식품 보충물로 미생물 배양물 및 발효물을 이용하고 있다. 최근에는 액상 균사체 배양의 항산화 활성 및 면역활성과 같은 생리활성 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 그러므로, 유용한 균사체를 영양분으로서 천연물과 함께 배양시킬 수 있다면 균사체의 생물전환을 통하여 천연물의 유용한 성분의 증가시킬 수 있으며 생리활성도 증가시키는 시너지 효과를 얻을 수 있다. 또한, 천연물과 함께 균사체를 발효시키는 경우 균사체 및 천연물의 유용한 천연 성분을 모두 섭취할 수 있는 잇점을 가진다.

코페아 로부스타(Coffee robusta 또는 Coffee Canephora)는 다양한 효과 및 생리 활성들을 가지는 것으로 보고되었다. 커피 로부스타는 멜라노이딘(melanoidin)과 기능성 성분으로 알려진 많은 양의 클로로겐산(chlorogenic acid)을 함유하고 있으며, 멜라노이딘은 생체내에서 항산화 활성을 나타는 물질로 알려져 있다.

자낭균류 곰팡이인 모나스쿠스 루버(Monascus ruber)는 아시아 국가에서 식품, 의약으로 이용되고 있다. 이와 같은 곰팡이는 상업적으로 중요한 생산품을 생산하기 위하여 반세기 이상 점진적으로 이용되어 왔으며, 색소 생성 미생물 및 미세조류는 자연계에서 일반적으로 널려 있다. 모나스쿠스 루버는 항균 및 면역억제활성을 가지는 모나코린 케이(monacolin K)를 생산하는 것으로 보고되었다. 모나스쿠스 종들을 단일배양으로 홍국미(red mold rice)를 생산하는 경우 발효과정에서 이용하는 발효 배지, 배양 조건 및 모타스쿠스 종들에 따라 2차 대사물 생산에 매우 크게 영향을 주는 것으로 보고되고 있다.

건강 기능성 물질로 젖산균에 대한 관심이 증가하고 있다. 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)는 자연계에서 폭 넓게 존재하는 기생 미생물로서 생화학 및 제약 산업분야에서 다양한 유용한 생산물의 생산에 이용되고 있다. 또한, 이 균은 다양한 생리 활성 물질의 기능을 개선시키기 위해서 이용되고 있다.

부작용이 없으며 생체활성 특히 항비만 활성을 가지는 천연물에 대한 관심이 높아지면서 이와 관련 연구가 활발히 진행되고 있다. 예컨대, 멜리사 추출물이 항비만에 효과가 있으며(미국등록특허번호 제9,155,773호, 2015.10.13), 팜오일 페놀계 성분이 포함된 추출물이 항비만 치료에 이용되고 있다(미국특허공개번호 제2015-0164969호, 2015.06.18). 또한, 커피를 이용한 비만 예방 및 치료 개선에 이용되고 있는 문헌으로는 “커피추출물, 중국차 추출물, 녹차 추출물, 홍차 추출물, 코코아 추출물로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 추출물을 포함하는 항비만용 조성물(일본특허공개번호 제2002-173435호, 2002.06.21)”“감잎 분말, 메밀잎 분말 및 구기자잎 분말, 타우린 및 원두커피 분말로 구성된 항비만용 커피 분말 조성물(한국특허등록번호 제10-0595057호, 2006.06.22)”“커피 분말, 폴리페놀계 물질 또는 바이오플라보노이드계 물질, 폴리페놀계 물질 또는 바이오플라보노이드계 물질을 함유하는 식물의 열수추출물 분말 또는 에탄올추출물 분말 및 식품첨가제로 구성됨을 특징으로 하는 지질대사 개선 및 항비만용 커피 조성물(한국특허등록번호 제10-0488409호, 2005.04.29)”이 있는 것으로 보고되고 있다.

그러나, 커피와 균주를 활용하여 발효시킨 커피 발효물이 항비만 효과가 있다는 보고는 아직까지 보고된바 없다.

1. 미국등록특허 제9,155,773호 2. 미국공개특허 제2015-0164969호 3. 일본공개특허 제2002-173435호 4. 한국등록특허 제10-0595057호 5. 한국등록특허 제10-0488409호

본 발명자들은 커피콩을 활용하여 생체에 안전한 항비만 효과를 가지는 천연물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 커피콩 품종 중 하나인 커피 로부스타(Coffee Robusta)에 홍국균인 모나스쿠스 속(Monascus sp.)균과 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타 발효 추출물이 생체 내에서 지방세포 수 및 크기를 감소시키고, 혈액 속에서의 당을 감소시킬 뿐만 아니라 간에서의 지질 및 지방산 합성 관련 유전자 발현을 현저하게 낮게 발현시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 모나스쿠스 속(Monascus sp.) 균 및 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 모나스쿠스 속(Monascus sp.) 균 및 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

여기서는, 본 발명의 전체적인 요약(Summary)이 제공되며, 이것이 본 발명의 외연을 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다(This section provides a general summary of the disclosure and is not a comprehensive disclosure of its full scope or all of its features).

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 모나스쿠스 속(Monascus sp.) 균 및 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 커피콩을 활용하여 생체에 안전한 항비만 효과를 가지는 천연물을 개발하고자 노력하였으며, 커피콩 품종 중 하나인 커피 로부스타(Coffee Robusta)에 홍국균인 모나스쿠스 속(Monascus sp.)균과 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타 발효 추출물이 생체 내에서 지방세포의 수 및 혈액 속에서의 당을 감소시키고 간에서 지질 및 지방산 합성 관련 유전자의 발현을 현저하게 낮게 발현시키는 것을 확인하였다.

본 발명에서 이용하는 모나스쿠스 속 균은‘홍국균’이라고도 하며, 반자낭균과(Hemiascomycetaceae)종의 모나스카세에 속(Monascaceae)에 속한 균이다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 모나스쿠스 속 균은 모나스쿠스 로버(Monascus ruber), 모나스쿠스 퍼퓨레우스(Monascus purpureus), 모나스쿠스 필로수스(Monascus pilosus), 모나스쿠스 안카(Monascus anka)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 모나스쿠스 속 균이며, 보다 바람직하게는 모나스쿠스 로버 또는 모나스쿠스 퍼퓨레우스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 모나스쿠스 속 균이고, 가장 바람직하게는 본 발명에서 이용하는 모나스쿠스 속 균은 모나스쿠스 로버 균이다.

본 발명은 모나스쿠스 속 균외에 유산균을 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 이용하는 유산균은 유산 또는 젖산을 생산할 수 있는 균이라면 제한없이 이용이 가능하다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 및 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유산균이며, 보다 바람직하게는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균이며, 가장 바람직하게는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)이다.

류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)는4.8 이하에서는 생장이 잘안 되는 균이다. 세포의 크기는 0.9~1.2 ㎛로서 생육 적정 온도는~25℃이다.특히 설탕 용액에서는 덱스트란으로 된 점층으로 싸여 있는 것이 특징이다.류코노스톡 메센테로이데스는 글루코스,과당, 갈락토스, 마노스, 자일로스, 아라비노스 및 수크로스 등을발효하여 젖산을 생성한다.

본 발명에서의 로부스타는 학명으로‘커피 로부스타(Coffee robusta) 또는 커피 카네포라(Coffee canephora)’라 불리며‘카네포라’보다‘로부스타’란 이름으로 통용된다. 19세기 초 아프리카 콩고(Congo)의 남동지역에서 처음 발견되었으며, 다른 커피 종과 비교해 볼 때 낮은 고도(해발 800 m 이하)에서 생산이 가능하다. 고온(25~30℃)과 많은 강수량(년 1,500~2,000 ㎜)에서도 잘 견딘다. 나무는 다 자랄 경우 10 m를 훌쩍 넘고 잎의 크기도 크지만, 생산의 원활함을 위해 3~4 m 정도로만 유지시킨다. 다른 아프리카 커피 열매에 비해 훨씬 더 단단하며 기후 변화나 다른 토양에서도 잘 견디는 것이 특징이다.

본 발명에서의 표현‘커피 로부스타 발효 추출물’은 커피 로부스타에 모나스쿠스 속 균과 유산균으로 발효시킨 발효 추출물을 의미한다. 즉, 본 발명에서의 커피 로부스타 발효 추출물은 커피 로부스타에 모나스쿠스 속 균과 유산균을 함께 넣고 발효시킨 발효 추출물, 커피 로부스타에 모나스쿠스 속 균을 넣고 1차 발효시킨 후 발효된 중간생성물에 유산균을 넣고 2차로 발효시킨 발효 추출물 및 커피 로부스타에 유산균을 넣고 1차 발효시킨 후 발효된 중간생성물에 모나스쿠스 속 균을 넣고 2차로 발효시킨 발효 추출물을 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 커피 로부스타 발효 추출물은 모나스쿠스 속 균으로 발효시킨 후 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타 발효 추출물이다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 커피로부스타 발효 추출물을 발효된 커피 로부스타에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는 물, 친수성 유기용매 또는 이들의 혼합용매가 있다. 예컨대, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜) 등을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 물, 에탄올 또는 메탄올이며, 가장 바람직하게는 물이다.

본 명세서에서 사용되는 용어‘발효 추출물’은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 발효 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 커피 로부스타 발효 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다.

본 발명은 천연물로서 체내(in vivo)에서 항비만에 우수한 효능을 가지는 조성물이며, 본 발명에 포함된 발효 추출물은 전체 조성물에 대해서 100%(중량%, 부피%, %(중량/중량) 또는 %(중량/부피))로 구성된다. 바람직하게는, 본 발명에서의 커피 로부스타 발효 추출물은 전체 조성물의 부피(V)를 기준으로 특정 중량(W) 백분율(%)로 함유하는 것이 높은 항비만 효과를 효과적으로 발휘할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에서 커피 로부스타 발효 추출물 함량 비율은 전체 조성물 대비 1~40%(w/v)이며, 보다 바람직하게는 15~25%(w/v)이고, 보다 더 바람직하게는 18~22%(w/v)이며, 가장 바람직하게는 20%(w/v)이다.

본 발명은 비만을 억제시키는데 우수한 효과를 발휘한다. 바람직하게는 본 발명은 체내 내장 지방을 매우 효과적으로 감소시킬 수 있다.

본 발명에 일 실시 예에 따르면, 본 발명의 조성물을 섭취한 마우스의 총 내장지방이 고지방식과 물만으로 섭취시킨 마우스(대조군) 것과 비교하여 최대 40%까지 유의하게 감소 되는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명에서 용어‘내장’은 각각 세포 또는 조직을 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서의 내장지방은 부고환지방, 신장주변지방, 장간막지방 및 후복강지방으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지방을 포함하며, 보다 더 바람직하게는 부고환지방 및 후복강지방으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지방을 포함한다.

본 발명은 체내 혈액에 포함된 당 또는 포도당을 현저하게 낮추는 효과를 발휘하며, 이를 통하여 항비만 효과를 나타낸다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명은 혈당(blood glucose)을 낮추게 하는 특징을 가진다.

본 발명은 지질 및 지방대사와 관련된 유전자의 발현을 감소시킴으로써 지질 및 지방 합성을 억제시켜 지질 및 지방의 합성을 억제시킬 수 있다.

바람직하게는, 본 발명은 SREBP(sterol Regulatory element-binding protein)-1, ACC(acetylcoenzyme A carboxylase), FAS(fatty acid synthetase) 및 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시킨다.

또한, 본 발명은 지질 및 지방대사와 관련된 유전자의 발현을 증가시킴으로써 지질 및 지방을 분해 시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명은 지질단백질분해효소의 유전자인 LPL(lipoprotein lipase)의 유전자의 발현을 증가시켜 지질 및 지방을 분해시켜 비만을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 커피 로부스타 발효 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 탄수화물은 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트 린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜)을 포함한다. 향미제는 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스 파르탐 등)을 포함한다.

본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 커피 로부스타 발효 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 모나스쿠스 속(Monascus sp.) 균 및 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서의 유효성분은 상기 식품 조성물과 동일한 성분을 포함함에 따라 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 이 둘 사이의 공통된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 본 발명은 모나스쿠스 속(Monascus sp.) 균 및 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 내장지방 감소, 지질 및 지방산 합성 억제 및 분해, 혈당 감소 효과 등을 통하여 비만을 매우 효과적으로 예방 및 개선시킬 수 있다.

(c) 또한, 본 발명은 비만 예방 및 치료 효능을 가지는 커피 로부스타 발효 추출물의 식품 및 의약으로서의 기초적인 자료를 제공한다.

도 1은 대조군과 10% RMR-LM(10%(w/v) 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물)과 20% RMR-LM(20%(w/v) 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물)를 각각 마우스에 투여하였을 때 체중변화와 평균 음식물 섭취량의 중량을 나타낸 결과이다. (A)는 체중변화의 결과이며, (B)는 평균 음식 섭취량의 결과이다. 평균 음식물 섭취량은 하루 동안 마우스가 음식물을 섭취한 양을 g으로 계산한 것이다. 데이터는 평균±10 per group)으로 표현하였으며, *는 대조군 대비 p<0.05이다.
도 2는 대조군과 10% RMR-LM(10%(w/v) 커피 로부스타 발효 추출물)과 20% RMR-LM(20% RMR-LM(20%(w/v) 커피 로부스타 발효 추출물)를 각각 마우스에 투여하였을 때 내장지방 중량의 감소 효과를 나타낸 결과이다. (A)는 체중대비 지방의 중량비율이며, (B)는 체중대비 총 내장지방의 중량비율이다. 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 투여한 마우스에서의 감소된 내장지방 조직에서 지방세포의 크기가 유의하게 감소되었음을 확인할 수 있었다. 데이터는 평균±10 per group)으로 표현하였으며, *는 대조군 대비 p<0.05이다.
도 3은 복강내 당저항성 테스트로 저혈당증 효과를 시험한 결과이다. (A)에서는 복강내 당저항성 테스트에 대한 결과이고, (B)에서는 그래프 면적으로 표현한 결과이다(Area under the curve : AUC). 10% RMR-LM(10%(w/v) 코페아 로부스타 발효 추출물) 및 20% RMR-LM(20% RMR-LM(20%(w/v) 커피 로부스타 발효 추출물)를 투여한 그룹에서 저혈당 저항성이 유의적으로 개선되었으며, GTT 동안 AUC이 대조 그룹과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 데이터는 평균±10 per group)으로 표현하였으며, *는 대조군 대비 p<0.05이다.
도 4는 지방조직의 세포학적 분석 및 지방세포 크기를 분석한 결과이다. (A)지방세포 수의 결과이며, (B)는 지방세포 크기에 대한 결과이다. (C)는 대조군 마우스의 지방조직에서 지방세포 이미지이고, (D)는 10% RMR-LM(10%(w/v) 코페아 로부스타 발효 추출물)를 투여한 마우스 지방조직에서의 지방세포 이미지이며, (E)는 20% RMR-LM(20%(w/v) 커피 로부스타 발효 추출물)를 투여한 마우스 지방조직에서의 지방세포 이미지이다. 데이터는 평균±10 per group)으로 표현하였으며, *는 대조군 대비 p<0.05이다.
도 5는 생화학적 분석을 이용하여 혈청 지질과 간수치를 나타낸 결과이다. (A)는 Triglyceride(TG) 수준을 나타낸 결과로 대조 그룹, 10% RMR-LM(10%(w/v) 커피 로부스타 발효 추출물) 및 20% RMR-LM(20%(w/v) 커피 로부스타 발효 추출물)를 투여한 그룹에서는 TG 수준은 변화가 없었다. (B)는 GLU 수준을 나타낸 결과로 20% RMR-LM를 투여한 그룹에서 대조군과 비교하여 혈당이 유의하게 낮아지는 결과를 나타내었다.
도 6은 대조군(β-actin), 10% RMR-LM(10%(w/v) 커피 로부스타 발효 추출물) 및 20% RMR-LM(20%(w/v) 커피 로부스타 발효 추출물)를 투여한 그룹의 마우스 간에서의 mRNA 발현에 있어서 RMR-LM 투여 효과를 나타낸 결과이다. 대조군과 비교하여 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 투여한 그룹에서 SREBP-1(sterol regulation element-binding protein-1) mRNA 발현량이 낮았으며(A), 대조군과 비교하여 10% RMR-LM를 투여한 그룹에서 ACC(acetyl-CoA carboxylase) mRNA 발현량이 증가하였으나 20% RMR-LM를 투여한 그룹에서는 감소하였다(B). 대조군과 비교하여 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 투여한 그룹에서 FAS(fatty acid synthase) mRNA 발현량이 낮았으며(C), 대조군과 비교하여 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 투여한 그룹에서 LPL(lipoprotein lipase) mRNA 발현량은 증가하였다(D). 또한, 대조군과 비교하여 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 투여한 그룹에서 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ) mRNA 발현량은 감소하였으며, 이 중 10% RMR-LM를 투여한 그룹이 가장 낮게 발현되었다. 데이터는 평균±10 per group)으로 표현하였으며, *는 대조군 대비 p<0.05이다.

이하, 본 발명에 따른 커피 로부스타 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 개선용 식품 조성물를 구현한 실시형태를 도면을 참조하여 자세히 설명한다.

다만, 본 발명의 사상은 이하에서 설명되는 실시형태에 의해 그 실시 가능 형태가 제한된다고 할 수는 없고, 본 발명의 사상을 이해하는 통상의 기술자는 본 개시와 동일한 기술적 사상의 범위 내에 포함되는 다양한 실시 형태를 치환 또는 변경의 방법으로 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 기술적 사상에 포함됨을 밝힌다.

또한, 이하에서 사용되는 용어는 설명의 편의를 위하여 선택한 것이므로, 본 발명의 기술적 내용을 파악하는 데 있어서, 사전적 의미에 제한되지 않고 본 발명의 기술적 사상에 부합되는 의미로 적절히 해석되어야 할 것이다.

실시예

실험방법

종균 제조

농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터(경기도-Korea) 모나스쿠스 루버(Monascus ruber)를 입수하였다. 모나스쿠스 루버를 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar : PDA)에서 10~15일간 25~30℃ 조건으로 배양시킨 후, 4~7일간 쉐이킹 인큐베이터(Jeio Tech Co., 대한민국)상에서 포테이토 덱스트로스 브로스(potato dextrose broth : PDB)에서 배양시켜 모나스쿠스 루버를 1차 종균 배양하였다.

1차 발효물 제조

로부스타를 모나스쿠스 루버와 발효시키기 위해서 베트남산 로부스타(에이엠씨: 경기도 일산 구입) 100 g을 2시간 동안 200 ㎖ 물에 담근 후 121℃에서 120분간 살균하고 실온에서 온도를 식혔다. 로부스타와 모나스쿠스 루버를 10:1로 혼합하고 25℃에서 7일간 배양하였다. 그 다음 1차 고상 발효물을 제조하기 위하여 열풍 건조시킨 후 볶았다.

2차 발효물 제조

2차 종균 생산을 위해 젖산균인 류코노스로톡 메센테로이데스를 김치로부터 분리하였다. 분리된 류코노스로톡 메센테로이데스(김치에서 순수분리 후 Macrogen 의뢰하여 확인,2014,8월,아래 )를 락도바실리 MRS Broth(MB cell, Korea) 로 옮긴 후 CO₂ 인큐베이터(Sanyo Electric Co., 일본)에서 30℃에서 24시간동안 배양시켰다.

1차 배양물, 글루코오스(cornstarch dextrose 100%), 류코노스로톡 메센테로이데스 및 물을 1:1:1:10의 비율로 혼합한 후 30℃에서 5~7일 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 2차 발효물(RMR-LM)을 열수 추출 방법으로 추출하였다(Korean. J. Food Nutr. Vol.29. No.1, 1~11, 2016 ).

추출된 추출물을 8 ㎕ 필터 종이로 거른 후 100℃에서 10분 동안 살균하였다. 추출물을 살균물로 희석하여 20(w/v)% 최종 2차 발효물(RMR-LM)을 제조하였다.

동물 및 실험 디자인

5주령된 수컷 ICR 마우스(Hsd:ICR) 30마리를 Koateck사(한국)로부터 구입하였다. 1주동안 적응기간을 두고 그 기간 동안 고지방식(60% kcal as fat; D12492, Research Diet, Inc., NJ, USA)으로 비만을 유도하였다. 마우스들을 6주 동안 액상 추출물에 접근을 자유롭게 하고 비만을 유지시키기 위해 고지방식으로 섭취하게 하였다.

10마리는 대조군으로 고지방식과 증류수를 섭취하게 하였고, 10마리는 고지방식과 10% 2차 발효물(10% RMR-LM)을 섭취하게 하였으며, 나머지 10마리는 고지방식과 20% 2차 발효물(20% RMR-LM)을 섭취하게 하였다. 12시간 동안 밤과 낮 사이클을 유지하면서 22℃ 온도와 50%를 유지시키면서 병원성과 격리하여 6주간 사육하였다. 몸무게와 음식 섭취량은 6주 동안 일주일에 한번 일주일 마다 측정하였다. 모든 동물실험 프로토컬은 건국대학교 실험동물운영위원회의로부터 승인을 받았다.

복강내 혈당 저항성 테스트

당 저항성 테스트를 위해, 투여전까지 6시간 동안 금식시켰으며 꼬리 정맥으로부터 수득한 샘플로부터 기초 혈당 수준을 측정하였다. 그 다음 복강내로 포도당을 주입(1 g/kg body weight)하고, 15분, 30분, 60분 및 120마다 혈당 측정기(Accu-Chek Active, Roche, Mannheim,Germany)로 혈당을 측정하였다. 당 저항성 테스트에 대한 곡선하면적(area under the curve : AUC)을 측정하였다.

혈청 생화학적 분석

마우스를 14시간 공복하게 한 후 40 mg/kg Zoletil^TM (Virbac Laboratories, Carros, France) 및 5 mg/kg Rompun^TM (Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea)을 복강내로 투여하여 마취시킨 후 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액은 액와 정맥(axillary vein)에서 채취한 후 10분간 12,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 포도당(Serum glucose :GLU), 트리글리세라이드(triglyceride : TG), 총 콜레스테롤(total cholesterol : TC), 고밀도 리포프로틴 콜레스테롤(high-density lipoprotein cholesterol : HDLc), 저밀도 리포프로틴 콜레스테롤(low-density lipoprotein cholesterol : LDLc)를 Hitachi 7020 Automatic Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan)기로 측정하였다.

조직학적 분석

마우스를 마취시킨 후 간, 췌장, 비장, 복강내 지방조직(부고환 및 복막후 패드, epididymal and retroperitoneal pad)의 중간에서 조직을 절제하여 측량하고 10% 중성 버퍼 포르말린 용액에 고정시켜 담가놓았다. 조직을 4 ㎛ 두께로 절단하였다. 절단된 부분을 탈파라핀화, 재수화 과정을 통하여 H&E(hematoxylin and eosin)으로 염색하였다. BX51 현미경(Olympus Co., Tokyo, Japan)으로 슬라이드를 확대하여 관찰하고 DP71 digital camera and software (Olympus, Tokyo, Japan).로 이미지를 촬영하였다. 지방조직의 지방세포 크기는 측정된 지방세포의 수를 나누어 측정하였다.

정량적 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 분석

분리된 간과 지방조직을 즉시 액화질소에 얼려 70℃로 냉동시켰다. TRIzol (Ambion Inc., Austin,TX, USA)로 동결된 간과 지방조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 1 ㎖ TRIzol에서 간과 지방조직을 각각 넣어 호모게나이즈한 후 클로로포름 추출 및 에탄올 침전 과정을 실시하였다. 디에틸피로카르보네이트(diethylpyrocarbonate)로 처리된 물에 건조된 RNA 펠릿을 용해시켜 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플당 4 ㎍의 총 RNA를 M-MLV 역전사효소(Invitrogen Life Technologies, Merelbeke, Belgium)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 PCR(중합효소연쇄반응)을 하였다. Bio-Rad CFX96 리얼타임 PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada)과 iQ SYBR 그린 PCR 믹스(Bio-Rad)로 유전자 발현을 정량화시켰다. The cDNA was denatured at 3분간 95℃에서 cDNA를 변성시킨 후 PCR(95℃, 10초, 55℃, 30초)을 40 사이클로 실시하였다. 타겟 유전자의 DNA 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다. 표준 대조군으로 β-actin을 이용하였다.

Gene	Forward Primer	Reverse Primer
β-actin	5′-AGCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3′	5′- CACTTGCGGTGCACGATGGAG-3′
FAS	5′-AGGGGTCGACCTGGTCCTCA-3′	5′-GCCATGCCCAGAGGGTGGTT-3′
PPARγ	5′-CAAGAATACCAAAGTGCGATCAA-3′	5′-GAGCTGGGTCTTTTCAGAATAATAAG-3′
LPL	5′-CGCTCCATTCATCTCTTCA-3′	5′-CTTGTTGATCTCATAGCCCA-3′
SREBP-1	5′-GGAGCCATGGATTGCACATT-3′	5′-GGCCCGGGAAGTCACTGT-3′
ACC	5′-GGAGATGTACGCTGACCGAGAA-3′	5′-ACCCGACGCATGGTTTTCA-3′

통계학적 분석

GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)를 이용하여 통계학적 분석을 하였다. Dunnett's 다중비교테스트를 이용하여 one-way ANOVA로 통계학적 유의성을 평가하였다. p가 0.05이하인 경우(p<0.05)를 통계학적 유의성을 가진 결과로 하였다. 데이터는 평균±SD(*p<0.05)로 표현하였다.

실험결과

체중, 음식섭취량

항비만에 대한 RMR-LM 농도의 효과를 측정하기 위하여, 증류수(대조군), 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 마우스 각 그룹에 섭취하게 하였다. 6주 후, 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹이 대조군보다 낮은 체중 값(*p<0.05)을 나타내었다. 대조군이 RMR-LM를 섭취하게 한 군보다 체중이 높아도 고지방식 먹이를 더 많이 섭취한 것은 아니다.

복강내 총지방중량

RMR-LM 추출물을 섭취함으로써 복강내 지방중량을 감소시키고, 이를 통하여 체중의 변화가 나타난 것이라고 예측되었다. 복강내 총지방중량은 부고환지방 중량 및 복막후 지방 중량의 합으로 표현하였다. 복강내 총지방중량은 RMR-LM 추출물 투여량에 비례하여 감소하였다. 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹 모두에서 복강내 총지방중량이 감소하였지만, 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹 가장 효과적으로 복강내 총지방중량이 감소되었음을 확인하였다.

조직학적 분석에 의한 복강내 지방조직내 지방세포 크기

부고환내 지방 및 복막후 지방에서의 지방세포 크기를 각각 측정하였다. 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹에서의 지방세포 수가 대조군과 비교하여 현저하게 높았으며 이와 같은 결과는 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹에서의 지방세포 크기가 대조군과 비교하여 작다는 것을 의미한다.

복강내 당 저항성에 의한 저혈당 효과

저혈당증에 대한 RMR-LM 효과를 검증하기 위해서 당 저항성 테스트를 고지방식이군으로 섭취하게 한 후 6주째에 실시하였다. 대조군에서 당 투입 후 공복 혈당이 증가하였다. 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹에서는 대조군 그룹과 비교하여 15분, 30분, 60분 및 120분째에 당 저항성이 개선되었으며, 이와 같은 결과는 비만 마우스에서 당저항성을 개선시킬 수 있을 것으로 예측할 수 있었다.

10% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹에서도 대조군과 비교하여 혈당 농도가 60분 및 120분에서 각각 낮게 나타내었다. 0에서 120분사이의 혈당의 총 AUC을 결정하였다. 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹의 혈당 저항성 테스트에 대한 AUC 값이 대조군과 비교하여 유의적으로 낮게 나타났다.

혈청 지질 영향

공복 혈청 TG와 혈당을 분석하였다. 총 혈청 TG 값은 차이가 없었지만, 20% RMR-LM를 섭취한 마우스 그룹에서의 혈청 당 수치가 대조군과 비교하여 유의적으로 낮게 나타났으며, 10% RMR-LM를 섭취한 마우스 그룹에서도 대조군과 비교하여 낮게 측정되었다.

실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용한 간에서의 유전자 발현 분석

지질과 지방산 대사와 관련된 SREBP(sterol Regulatory element-binding protein)-1, ACC(acetylcoenzyme A carboxylase), FAS(fatty acid synthetase), LPL(lipoprotein lipase) 및 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 유전자의 간 mRNA 발현 수준을 실시간 PCR을 이용하여 평가하였다. 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹 간조직에서 SREBP-1 유전자 mRNA 발현 수준이 대조군과 비교하여 유의적으로 낮게 나타났으며, 특히 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹에서 낮게 발현이 되었다. 또한 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹에서는 ACC 및 FAS 유전자 mRNA 발현 수준이 대조군과 비교하여 유의적으로 감소되었다. PPARγ는 지방세포 분화 및 간 지질 저장을 조절하는 핵 리셉터이다. 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM를 섭취하게 한 마우스 그룹 모두의 간조직에서 PPARγ의 mRNA 발현 수준이 대조군과 비교하여 유의적으로 하향 조절(down-regulated)되었다.

결과적으로, 10% RMR-LM 및 20% RMR-LM가 항비만 효과를 유의적으로 현저하게 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.

참고 문헌

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Claims

모나스쿠스 속(Monascus sp.) 균 및 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타(Coffee Robusta) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 모나스쿠스 속 균은 모나스쿠스 로버(Monascus ruber), 모나스쿠스 퍼퓨레우스(Monascus purpureus), 모나스쿠스 필로수스(Monascus pilosus), 모나스쿠스 안카(Monascus anka)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 모나스쿠스 속 균인 것을 특징으로 하고,
상기 유산균은 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균인 것을 특징으로 하고,
상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)인 것을 특징으로 하고,
상기 발효 추출물은 모나스쿠스 속 균으로 발효시킨 후 유산균으로 발효시킨 커피 로부스타 발효 추출물인 것을 특징으로 하고,
상기 발효 추출물은 물, 친수성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출된 발효 추출물인 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 15~25%(w/v) 발효 추출물이 포함된 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 내장 지방을 감소시키는 것을 특징으로 하고,
상기 내장 지방은 부고환지방, 신장주변지방, 장간막지방 및 후복강지방으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지방을 포함하는 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 혈당(blood glucose)을 낮추게 하는 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 SREBP(sterol Regulatory element-binding protein)-1, ACC(acetylcoenzyme A carboxylase), FAS(fatty acid synthetase) 및 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 LPL(lipoprotein lipase)의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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