KR102438276B1

KR102438276B1 - 괭생이모자반 추출물을 포함하는 항염증 및 항비만 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102438276B1
Application number: KR1020220074581A
Authority: KR
Inventors: 김형진
Original assignee: 주식회사 제주바이오테크
Priority date: 2022-06-20
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2022-08-30

Abstract

본 발명은 괭생이모자반 추출물을 포함하는 항염증 및 항비만 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 우수한 항염증 및 비만 치료 효과를 이끌어낼 수 있는 괭생이모자반 추출물의 제조방법을 제공하며, 이를 통해 괭생이모자반 추출물이 항염증, 항비만 효과를 갖는 약학적 조성물, 식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

괭생이모자반 추출물을 포함하는 항염증 및 항비만 조성물 및 이의 제조방법 {Anti-inflammatory and anti-obesity composition comprising Sargassum horneri extract and method for preparing the same}

아래 실시예들은 괭생이모자반 추출물을 포함하는 항염증 및 항비만 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

염증은 혈관이 분포하는 생체조직에서, 병원체나 손상된 자가 항원, 바이러스 감염 세포 등의 해로운 물질들에 의해 발생하는 복합적인 면역반응이다. 본래 염증 반응은 몸이 감염에 빠르게 대처하려는 기재로서 손상된 조직의 재건 과정과 관련이 있는 중요한 반응이나, 염증 반응이 심하게 발생할 경우 질병으로 이어질 수 있으며, 많은 질병들이 염증 반응과 연관성이 높다.

이러한 염증 반응과 관련성이 높은 질환 중 하나로서, 비만은 체내에 지방이 비정상적으로 많이 축적되는 질병이다. 체내 지방 조직은 에너지 저장고로서 중요한 기능을 하고 있으나, 지방 조직이 다양한 종류의 염증 관련 물질을 생산하고 분비하는 것으로 점차 규명되고 있어, 비만과 염증의 관련성이 더욱 주목받고 있다. 구체적으로, 지방조직은 염증성 사이토카인을 분비하며, 비만에서 특히 복부비만도가 증가할수록 염증성 단백질의 혈중 수준이 증가하는 것으로 연구된 바 있다. 또한 비만 상태에서 증가되는 염증 인자는 인슐린 저항성, 심혈관계 질환, 제2형 당뇨병 발생과 깊게 관련되어 있음이 밝혀진 점에서, 비만은 만성적으로 발생하는 염증성 질환이라고 볼 수 있다.

이러한 염증 질환 및 비만을 치료하고자 하는 시도로서, 종래 기술 중에는 한국공개특허공보 제10-2014-0086186호(S-아릴 시스테인을 유효성분으로 함유하는 비만으로 유도된 염증 치료용 조성물), 한국공개특허공보 제10-2004-0019750호 (죽염을 유효성분으로 함유하는 비만 세포를 매개로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물) 등이 있으나, 직접적인 치료 효과가 크지 않다는 문제가 지적되고 있어 새로운 항염증 및 비만 치료용 물질에 대한 수요가 높은 실정이다.

한편, 괭생이모자반은 모자반과에 속하는 해초로, 북태평양 서안에 널리 분포하고 있으며 국내의 경우 한려해상, 다도해해상과 같은 남해 연한에 분포한다. 이러한 괭생이모자반의 성분을 활용한 종래 기술로는, 한국공개특허공보 제10-2009-0027387호 (괭생이모자반 추출물을 포함하는 피부외용제 조성물), 한국공개특허공보 제10-2022-0018309호(괭생이모자반 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물) 등이 있으나, 괭생이모자반을 가공, 활용한 항염증 조성물이나 비만 치료용 조성물에 대해서는 많은 연구가 이루어지지 않은 상황이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자는 괭생이모자반 추출물이 항염증 조성물 및 비만의 예방, 치료용 조성물로 활용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

실시예들은 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 실시예들은 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 실시예들은 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

일실시예에 따른 약학 조성물은, 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함한다.

다른 일 일실시예에 따른 약학 조성물은, 괭생이모자반 발효물을 유효성분으로 포함한다.

다른 일 일실시예에 따른 괭생이모자반 추출물 또는 발효물의 제조방법은, 괭생이모자반을 세척, 건조, 분쇄한 후 열수 추출하는 단계를 포함한다.

본 발명은 우수한 항염증 및 비만 치료 효과를 이끌어낼 수 있는 괭생이모자반 추출물의 제조방법을 제공하며, 이를 통해 괭생이모자반 추출물이 항염증, 항비만 효과를 갖는 약학적 조성물, 식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 일실시예에 따른 괭생이모자반 열수추출 배지를 제조하는 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 2 및 3은 일실시예에 따른 괭생이모자반 열수추출 배지의 균주 생장성 및 발효 효율을 비교한 도면이다.
도 4 및 5는 일실시예에 따른 세포 생존 및 항염증능 평가 실험에 관한 도면이다.
도 6 및 7은 일실시예에 따른 괭생이모자반 추출물의 염증 효과 비교 실험에 관한 도면이다.
도 8 내지 10은 일실시예에 따른 괭생이모자반 추출물의 항산화 효과 비교 실험에 관한 도면이다.
도 11 내지 17은 일실시예에 따른 괭생이모자반 추출물의 항비만 효과 비교 실험에 관한 도면이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예들에 대한 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 예시를 위한 목적으로 개시된 것으로서, 다양한 형태로 변경되어 실시될 수 있다. 따라서, 실시예들은 특정한 개시형태로 한정되는 것이 아니며, 본 명세서의 범위는 기술적 사상에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.

제1 또는 제2 등의 용어를 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 이런 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 해석되어야 한다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소는 제1 구성요소로도 명명될 수 있다.

어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 실시예들에서, 별도로 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명의 실시예에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.

구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.

도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 도시된 것이며, 본 발명이 도시된 구성의 크기 및 두께에 반드시 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.

본 발명은 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 약학 조성물을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 괭생이모자반 추출물은 열수 추출물일 수 있다.

또한 본 발명은 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 일 실시예에 있어서, 상기 비만은 염증성 비만일 수 있다.

또한, 본 발명은 괭생이모자반 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 발효물은 미생물 발효물일 수 있으며 보다 구체적으로 유산균 발효물일 수 있다. 상기 유산균은 구체적으로 Lactobacillus pentosus S16일 수 있다. 본 발명에서는 괭생이모자반의 열수추출 배지에서 성장률 및 발효 효율이 우수한 균주를 선정하기 위해 10종의 미생물 이 포함된 후보군을 준비하여 비교한 결과, 그 중 Lactobacillus pentosus S16 (S16) 균주가 발효시 높은 생장성, 발효 효율을 나타냄을 확인하였다. 이는 괭생이모자반의 열수 추출 배지에 포함된 특정 영양 물질 및 유효성분에 대한 반응성과 활용성이 상기 균주에서 가장 우수함을 의미한다.

본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 대상 질환 예방 또는 치료용 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용되는 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1 일 1 회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수 회 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 통상적인 1 일 투여량은 10 내지 1,000 mg/kg, 구체적으로는 10 내지 600 mg/kg으로 투여되도록 투여될 수 있고, 1 회 또는 수 회로 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 괭생이모자반 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 질환이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 식품 조성물, 또는 괭생이모자반 발효물을 유효성분으로 포함하는 항염증 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 또는 괭생이모자반 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 대상 질환의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.

본 발명의 용어, “개선”이란, 본 발명의 조성물의 투여로 질환이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로 상기 유효물질을 포함하는 대상 질환 예방 및 치료 활성을 갖는 조성물 또는 그의 유효 성분, 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 괭생이모자반 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항염증 약학 조성물, 또는 괭생이모자반 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 제조방법은 괭생이모자반을 세척, 건조 및 분말화하는 단계; 상기 괭생이모자반 분말을 증류수 또는 정제수에 10 : 500의 중량비로 혼합한 후 고압 멸균기에서 121℃, 15분 동안 열처리하여 괭생이모자반 용액을 제조하는 단계; 상기 용액을 상온에서 식힌 후 셀룰레이즈를 추가한 후 50℃, pH4.5에서 48시간 동안 반응시켜 고형성분을 포함하는 괭생이모자반 효소반응물을 제조하는 단계; 및/또는 상기 효소 반응물을 최소배지에 적용한 후 고압멸균기에서 121℃, 15분 동안 열처리하여 괭생이 모자반 열수추출 배지를 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.

또한, 상기 제조방법은 발효 단계로서, MRS 액체배지에서 발효 균주를 성장시키는 단계; 성장한 균주를 원심분리하여 균주 세포 펠럿을 형성하는 단계; MRS 상층액을 제거한 뒤 PBS를 첨가하고 원심분리한 후 PBS 워싱을 진행하는 단계; 및/또는 균 펠럿을 상기 열수추출 배지에 접종하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에서는 상기 제조방법을 통해 괭생이 모자반의 열수추출물 및 이의 발효물을 제조하였으며, 이러한 추출물 및 발효물이 항염증, 항산화 및 항비만 효과가 원활하게 나타남을 확인한 점에서 상기 제조방법은 괭생이모자반의 추출물 및 발효물의 제조방법으로서 중요한 가치를 갖는다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 괭생이모자반 추출물 또는 이의 발효물을 장 상피세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 외 조건에서 세포의 염증성 사이토카인 (COX 2, IL-1b)의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 괭생이모자반 추출물 또는 이의 발효물을 장 상피세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 외 조건에서 세포의 세포자멸사 인자(NF-kappaB, Bax, Cas3)의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 괭생이모자반 추출물 또는 이의 발효물을 3T3-L1 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 외 조건에서 세포에서 지방세포로의 분화를 촉진하는 전사인자인 PPARγ, C/EBPβ와, 지단백 분해효소인 LPL의 발현량을 감소하는 방법, 또는 염증인자인 INF-r, NF-kB의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 괭생이 모자반 열수 추출 배지의 제조

괭생이 모자반을 세 번 수세하여 염분, 모래, 착생식물(epiphytes) 등을 제거하고 50℃에서 24시간 동안 건조시켜 grinder로 분말화하였다. 10g의 괭생이 모자반 분말을 500ml의 DW에 넣은 뒤 고압멸균기에서 121℃, 15분 동안 열처리하여 괭생이모자반 용액을 제조하였다. 상온에서 충분히 식힌 괭생이 모자반 용액을 효소 분해하기 위해 셀룰레이스(Cellulase) 100μl(0.02%,v/v)를 추가한 뒤, 반응 최적 조건인 50℃, pH4.5에서 48시간 동안 반응시켜 고형성분을 포함하는 괭생이모자반 효소반응물을 제조하였다. 효소 반응이 완료된 이후 균 발효를 위해 하기 조건의 최소배지(*Minimal broth) 조성을 추가한 뒤, 고압멸균기에서 121℃, 15분 동안 열처리하여 괭생이 모자반 열수추출 배지를 제조하였다 (도 1).

*Minimal broth 조성 : (Peptone 5g, Sodium acetate 3H₂O 2.5g, Magnesium sulfate 7H₂O 0.5ml, Manganese sulfate 4H₂O 0.5ml, Tween 80 5ml, Diammonium citrate 1g, Dipotassium phosphate 1g)/500ml

실시예 2: 괭생이 모자반 열수추출물에서의 균 생장성 비교

괭생이모자반의 열수추출 배지에서 성장률 및 발효 효율이 우수한 균주를 선정하기 위해 하기의 10종의 미생물이 포함된 후보군을 준비하였다. MRS 액체배지 10ml에서 성장한 각 균주를 Centrifuge로 (11,000rpm, 3분) 원심분리하여 세포 펠럿을 생성하였다. MRS 상층액을 제거한 뒤, 잔여 MRS를 제거하기 위해 PBS 1ml를 주입하고 pipetting 후 Centrifuge(11,000rpm, 3분)로 원심 분리하였고, PBS washing 과정을 한 번 더 반복하였다. Microplate reader(Molecular Device, USA)를 이용하여 600nm에서 균 펠럿을 흡광도 0.3으로 희석시킨 뒤, 1% (w/w)으로 각각의 괭생이 모자반 열수추출 배지에 접종하였다. 초기 접종 균(0hr) 및 괭생이 모자반에서 배양된 균(48hr)을 각각 MRS agar plate에 도말하여 37 ℃, 48시간 배양한 후 균 수를 측정하여 유산균의 생장성을 확인하였다(도 2).

괭생이모자반 열수추출물의 발효 균주 후보군: Lactobacillus fermentum(S25), Lactobacillus brevis (D70), Lactobacillus fermentum (MA2), Lactobacillus pentosus (S16), Lactobacillus pentosus (MF10), Lactobacillus plantarum (MF17), Lactobacillus plantarum (D74), Lactobacillus plantarum (SJ11), Lactobacillus plantarum (SJ08), Pediococcus acidilactici (SJ15)

그 결과, 일부 종류의 미생물은 괭생이모자반 열수추출 배지에서 적절한 성장률 및 발효 효율을 보이지 못하였으나, 그 중 SJ11 및 Lactobacillus pentosus S16 (S16) 균주가 발효시 높은 생장성을 보이며, 특히 S16의 경우 반복 실험에서도 재현성이 있음을 확인하였다(도 3). 따라서, 최소배지 성장률과 발효효율 및 재현성을 기준으로, DPPH 항산화능 평가 및 항염, 항산화 세포 실험에 적용할 균주로서 S16을 선정하였다.

실시예 3: 괭생이 모자반에서의 유산균 생장성 확인(열수추출 발효물 제조)

괭생이 모자반을 발효시키기 위해, MRS 액체배지(Difco, USA)에서 3차 계대 배양시킨 유산균을 이용하였다. MRS 액체배지 10ml에서 성장한 Lactobacillus pentosus S16 (S16)을 Centrifuge로 (11,000rpm, 3분) 원심분리하여 유산균 세포 펠럿을 생성하였다. MRS 상층액을 제거한 뒤, 잔여 MRS를 제거하기 위해 PBS 1ml를 주입하고 pipetting 후 Centrifuge(11,000rpm, 3분)로 원심 분리하였고, PBS washing 과정을 한 번 더 반복하였다. Microplate reader(Molecular Device, USA)를 이용하여 600nm에서 유산균 펠럿을 흡광도 0.3으로 희석시킨 뒤, 1% (w/w)으로 괭생이 모자반 열수추출 배지에 접종하였다. 초기 접종 균(0hr) 및 괭생이 모자반에서 배양된 균(48hr)을 각각 MRS agar plate에 도말하여 37 ℃, 48시간 배양한 후 균 수를 측정하여 유산균의 생장성을 확인하였으며 이를 괭생이 모자반 열수 추출물 발효물로 사용하였다. 이후, 세포실험에서 사용하기 위해 Stericup(0.45μm필터)을 이용하여 필터링하였다.

실시예 4: 항염증능 평가(HT-29)

HT-29에서 염증인자의 발현량을 비교하기 위하여 장 상피세포 RNA 추출 및 qRT-PCR assay를 다음과 같은 순서로 진행하였다 (도 4 및 5).

- Seeding : HT-29 장 상피세포를 12-well cell culture plate(SPL Lifesciences)에 5.0×10⁵cells/well의 농도로 1mL의 RPMI 1640 medium(10%FBS, 1% penicillin/streptomycin, GE Healthcare)을 분주한 뒤, cell incubator(37℃, 5% CO₂ condition)에서 세포를 24시간 동안 배양하였다.

- Pretreatment : Plate에 괭생이 모자반 추출물 및 발효물을 RPMI pure배지를 이용하여 세포 독성이 없는 1/50희석농도(50배 희석)로 희석하여 사용하였다. 처리물질은 모두 0.45μm로 여과된 후 처리되었으며, cell incubator(37℃, 5% CO₂ condition)에서 세포를 24시간 동안 배양하였다.

- Stimulation : 염증 유도 물질로서 LPS를 1μg/mL(in RPMI 1640 pure media) 농도로 처리하고 cell incubator(37℃, 5% CO₂ condition)에서 세포를 24시간 동안 배양하였다.

이후 배양된 세포의 RNA 추출을 위해 TRIzol reagent(Thermo Fisher Scientific, USA)을 제조사 프로토콜을 따라 사용하였다. NanoDrop spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific)로 추출된 RNA의 농도를 측정하고 10 ng/μL의 농도 희석하여 cDNA 합성에 이용하였다. The High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 PCR로 cDNA를 합성하였다. 유전자의 상대적인 발현량은 SYBR®St. Louis, MO, USA) 및 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)에 의해 정량화되었다. GAPDH 유전자는 housekeeping gene으로 분석되었고, 각각의 qPCR 반응은 단일 96-웰 반응 플레이트에서 실행하였다.

Gene	Sequence	출처
GAPDH	F: 5' CCTGCTTCACCACCTTCTTG 3’R: 5' ATGACCACAGTCCATGCCATC 3'	NCBI genbank
COX-2	F: 5' GAATCATTCACCAGGCAAATTG 3'R: 5' TCTGTACTGCGGGTGGAACA 3'	NCBI genbank
IL-1β	F: 5' ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC 3'R: 5' AACCCTCTGCACCCAGTTTTC 3'	NCBI genbank
ZO-1	F: 5'GAGGCCAAGCCCTGGTATG 3'R: 5' CGGGCCGATTGATCTCAGC 3'	NCBI genbank

실험 결과, 추출물 또는 발효물을 처리한 경우, 50배 희석 비율에서 세포 생존에는 유의미한 차이가 나타나지 않았다 (도 6). 또한 항염 효과 실험에서는 COX-2, IL-1b 억제 효과에 있어서 추출물보다 발효물의 염증 억제 효과가 더 현저하게 나타나며, LPS에 의해 감소된 ZO-1 발현량 또한 추출물보다 발효물 처리에 의해 증가하였음을 확인하였다 (도 7).

따라서, 괭생이 모자반 열수추출 발효물은 LPS 처리로 증가된 염증성 사이토카인 (COX 2, IL-1b)의 발현을 억제하고, 억제된 장벽인자 (ZO-1)의 발현을 회복시킴을 확인하였다.

실시예 5: 항산화능 평가(DPPH assay)

괭생이모자반 추출물 및 발효물의 항산화능 평가를 위해, 상기 항염증 실험에서와 동일하게 MTT assay를 진행하였다. 추출물 및 발효물을 1/50 로 희석하여 처리하였으며 H₂O₂로 산화 스트레스를 유도한 후, 관련 인자의 mRNA 발현량을 비교하였다 (도 8 및 9).

그 결과, 세포자멸사 인자인 NF-kappaB, Bax, Cas3의 발현량이 추출물 및 발효물 그룹에서 감소하였으며, 특히 추출물 대비 발효물의 억제 효과가 더 크게 나타남을 확인하였다 (도 10).

따라서, 괭생이 모자반 열수추출 발효물은 열수 추출물 대비, H₂O₂처리로 증가된 세포자멸사 인자 (NF kappaB, Bax, Cas3)의 발현을 억제하여 현저히 우수한 항산화 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 6: 항비만능 평가(3T3-L1 preadipocytes)

3T3-L1에서 지방분화 관련 인자 및 염증인자의 발현량을 비교하기 위하여 RNA 추출 및 qRT-PCR assay를 하기 순서로 진행하였다.

- Seeding : 3T3-L1 지방 전구세포를 6-well cell culture plates (SPL Lifesciences)에 0.8×10⁵ cells/well의 농도로 4mL의 DMEM with low glucose medium(10% BCS, 1% penicillin/streptomycin, hyclone)을 분주한 뒤, cell incubator(37℃, 5% CO₂ condition)에서 세포를 48시간 동안 배양하였다.

- 분화유도 : Growth media (89% DMEM with low glucose medium, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, hyclone)로 배지 교체 후 48 시간 배양하여 well 상태를 confluent하게 만든 후 다시 한번 Growth media를 교체 하여 72 시간 동안 배양하였다. 이후 분화 유도를 위해 Differentiation media (Growth media, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 μM dexamethasone, and 20 μg/ml insulin)와 세포 독성이 없는 1/50희석농도(50배 희석)로 희석한 모자반 추출물 또는 발효물을 함께 처리하여 48 시간동안 배양하였다. Differentiation media 처리 후 Post-differentiation media를 48 시간 주기로 세 번 처리 및 배양하였으며, 세 번째 처리 후 48 시간 배양하여 세포를 항비만능 평가에 사용하였다.

- Oil Red O staining: 분화 과정을 거친 세포의 배지를 제거하고 10%의 Formaldehye 1ml를 분주하여 10분간 고정해 주었다. 이후 60% isopropyl alchol 용액을 넣고 세척한 다음 20분간 Oil Red O solution (0.5% Oil Red O in isopropanol, Sighma-aldrich, USA)을 1ml 분주하여 염색해주었다. 염색이 완료되면 Oil Red O 시약을 모두 제거하고 PBS로 세척한 다음 현미경으로 관찰하였다 (도 11 및 12).

Gene	Sequence	출처
GAPDH	F: 5' CCTGCTTCACCACCTTCTTG 3’R: 5' ATGACCACAGTCCATGCCATC 3'	NCBI genbank
PPAR-γ	F: 5' GGAAGACCACTCGCATTCCTT 3'R: 5' GTAATCAGCAACCATTGGGTCA 3'	NCBI genbank
C/EBPβ	F: 5' GCAAGAGCCGCGACAAG 3'R: 5' GGCTCGGGCAGCTGCTT 3'	NCBI genbank
LPL	F: 5 GGGAGTTTGGCTCCAGAGTTT 3'R: 5' TGTGTCTTCAGGGGTCCTTAG 3'	NCBI genbank
INF- γ	F: 5' ACAGCAAGGCGAAAAAGGATG 3'R: 5' TGGTGGACCACTCGGATGA 3'	NCBI genbank
NF-kβ	F: 5' GGAGGCATGTTCGGTAGTGG 3'R: 5' CCCTGCGTTGGATTTCGTG 3'	NCBI genbank

세포 생존 평가 결과, 추출물, 발효물 모두 50배 희석 비율에서 세포생존에 유의미한 차이를 보이지 않았으며 배지에 50배 희석하여 항비만 실험을 진행하였다 (도 13).

Oil Red O staining 염색 결과, 모자반 추출물과 발효물 처리에 의해 lipid droplet의 양이 부분적으로 감소한 것으로 확인되었다(도 14). 다만 흡광도 측정 결과값의 차이는 나타나지 않은 점에서 (도 15), 세포 수의 차이에 의한 것으로 확인되었다.

다음으로 qRT-PCR 실험 결과, 지방세포로의 분화를 촉진하는 전사인자인 PPARγ, C/EBPβ와, 지단백 분해효소인 LPL의 발현량이 추출물 및 발효물의 처리로 감소되었으며, 특히 추출물 대비 S16 발효물이 상기 인자들의 발현량을 더욱 현저하게 감소시킴을 확인하였다 (도 16). 또한, INF-r, NF-kB 억제와 관련하여 추출물 대비 S16 발효물의 염증 인자 억제 효과가 더 크게 나타남을 확인하였다 (도 17).

따라서, 괭생이모자반 추출물 및 발효물이 모두 지방세포 분화 인자발현 억제 및 염증 인자의 발현 억제 효과를 이끌어 내며, 특히 발효물이 추출물보다 높은 항비만 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

Claims

괭생이모자반 열수 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 항염증, 및 염증성 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법으로서,
상기 제조방법은 괭생이모자반을 세척, 건조 및 분말화하는 단계; 상기 괭생이모자반 분말을 증류수 또는 정제수에 10 : 500의 중량비로 혼합한 후 고압 멸균기에서 121℃, 15분 동안 열처리하여 괭생이모자반 용액을 제조하는 단계; 상기 용액을 상온에서 식힌 후 셀룰레이즈를 추가한 후 50℃, pH4.5에서 48시간 동안 반응시켜 고형성분을 포함하는 괭생이모자반 효소반응물을 제조하는 단계; 상기 효소 반응물을 최소배지에 적용한 후 고압멸균기에서 121℃, 15분 동안 열처리하여 괭생이 모자반 열수추출 배지를 제조하는 단계; 및
발효 단계로서, MRS 액체배지에서 발효 균주를 성장시키는 단계; 성장한 균주를 원심분리하여 균주 세포 펠럿을 형성하는 단계; MRS 상층액을 제거한 뒤 PBS를 첨가하고 원심분리한 후 PBS 워싱을 진행하는 단계; 및 균 펠럿을 상기 열수추출 배지에 접종하는 단계;를 포함하며,
상기 발효 균주는 Lactobacillus pentosus S16인 것인, 제조방법.
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