TWI410494B - Ｉｌ－８抑制劑與其製造方法 - Google Patents

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Description

IL-8抑制劑與其製造方法
本發明係有關抑制IL-8產生之抑制劑以及其製造方法，更詳細來說，係有關特定植物乳酸菌的培養上層清澈液以及含有其萃取物中抑制IL-8產生的抑制劑及其製造方法。
Helicobacter pylori(幽門螺旋桿菌)是1983年由Marshall博士發現。本菌為格蘭氏陰性，呈螺旋狀，在WHO被列為是等級1的致癌物質。幽門螺旋桿菌通常會在胃本身與幽門的黏膜層形成菌的細胞群聚，會導致胃的上皮細胞凋亡(Apoptosis)或傷害黏膜引發慢性發炎。幽門螺旋桿菌為了在胃中嚴苛的環境生存，會在形成細胞群聚時產生大量的尿素酶(urease)以中和胃酸。大部分的幽門螺旋桿菌毒性具有宿主單一性，但來自幽門螺旋桿菌的液泡毒素(vacA)、蛋白基因(cagA)、血型抗原結合黏附(BabA)的毒性與細菌感染有很大的關係。
近年來醫學界廣泛以單劑或併用的方式使用安默西林(Amoxicillin)、克拉黴素(Clarithromycin)、奧美拉唑(Omeprazole)之類的質子幫浦抑製劑(Proton pump inhibitor)等的抗生素來治療幽門螺旋桿菌的感染(尤其是去除幽門螺旋桿菌)。遺憾的是，這種治療方法不只會出現大腸炎、腎臟衰竭的再度發作、因攝取酒精而產生類戒酒硫的副作 用，還經常會出現細菌抗藥性。因此，各方皆努力尋找對本菌更具效用且侵襲性低的治療藥物。
近年來有報告提出研究成果支持益生菌(Probiotics)能有效去除幽門螺旋桿菌。益生菌是一種有助於宿主(人類等)健康，非病原性安全性很高的微生物。攝取這類微生物能夠阻礙有害人體消化系統壞菌的繁殖，促進身體適切地消化/吸收營養源，因此益生菌可能有助於腸道健康的維持。
乳酸菌自古以來就存在於起司、優格、發酵奶油等乳製品中，還有味噌、醃漬物等日本傳統的發酵食品裡，此外也添加在果汁、蔬菜之等各種食品當中，以增加食品的風味，改善組織、營養價或是提高保存效果等，具有重要的功能。近年來人類已經掌握了乳酸菌的生理效果，例如食用活的乳酸菌能改善腸內菌叢，或具有整腸的作用，也開發出醫藥品等級的乳酸菌製劑。日本公開專利公報「特開2001-143號公報(公開日：2001年1月19日)」就是有關含有加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、具有去除/預防感染幽門桿菌的飲食品。在「生物工學會誌82：430-431(2004)」中就公開了以甘藍菜作為發酵原料的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ATCC8014的發酵生成物，該生成物具有NK活性以及抑制癌細胞增殖的作用。此外，在「化學療法的領域21：1585-1590(2005)」中也記載了乳酸菌對牙周病的效果。
日本公開專利公報「特開2001-143號公報」所記載、運用乳酸菌的機能性食品(尤其是發酵食品)非常受到矚目。但是要讓日本公開專利公報「特開2001-143號公報」所記載之含乳酸菌食品發揮所須的功能，必須不斷供給該乳酸菌的生菌到胃內並且使之繼續生長。因為該乳酸菌抑制幽門螺旋桿菌生長的機制乃是基於乳酸菌所產生的乳酸。儘管在日本公開專利公報「特開2001-143號公報」所記載之乳酸菌能在低pH的環境下生長良好，但要以生菌狀態供給胃內所需的量並非易事。同樣地，「生物工學會誌82：430-431(2004)」與「化學療法的領域21：1585-1590(2005)」所記載的技術也不過是確認了乳酸菌所產生的有機酸直接具有抗菌/殺菌效果而已。
幽門螺旋桿菌在感染人體之前，會先由cag毒性部位的分泌系統將效應分子CagA注入宿主的黏膜細胞內。如此一來宿主的胃黏膜細胞就會誘發產生IL-8，然後在產生活性氧後多核白血球就能入侵胃黏膜。因此產生IL-8可說是感染幽門螺旋桿菌不可或缺的條件。
介白質8(interleukin，IL-8)屬細胞素(cytokine)的一種，與嗜中性球遊走到發炎部位有關，是強力的嗜中性趨化因子(chemokines)。不僅單核細胞、巨嗜細胞、嗜中性球以及淋巴球會分泌IL-8，皮膚纖維母細胞、角質細胞、血管內皮細胞、黑色素細胞、肝細胞以及各種腫瘍的細胞株都會產生IL-8。嗜中性球在遇到細菌入侵身體時，必須產 生發炎作用防禦細菌，但是異常產生IL-8與對IL-8的過度反應則可能是造成發炎性疾病發生的原因。IL-8還被指出具有促進血管新生與刺激腫瘍成長的作用。
有鑑於上述之問題點，本發明之目的乃是要提供一種能抑制IL-8產生的新技術。
本發明之發明者取得新的植物乳酸菌，使用這些乳酸菌製造具有新風味與新機能的發酵飲料(參照日本公開專利公報「特開2006-42796號公報『公開日：2006年2月16日』」)。本發明之發明者在研究植物乳酸菌的過程中找到了能發生抑制IL-8產生效果物質的植物乳酸菌，完成了本發明。
也就是說，本發明相關之IL-8抑制劑含有植物乳酸菌的培養上層清澈液以及該上層清澈液的萃取物，該植物乳酸菌之16S rRNA基因的特徵為：(a)多核苷酸，含有序列編號1~4其中一種所示之鹼基序列；(b)多核苷酸，含有如序列編號1~4所示之鹼基序列，該鹼基序列發生一種或多種鹼基缺失、置換或附加的情形；以及(c)由序列編號1~4其中一種所示之鹼基序列互補構成之多核苷酸，在嚴苛條件下產生雜交(hybridize)之多核苷酸。
在本發明之IL-抑制劑中，上述的植物乳酸菌最好從Lactobacillus plantarum SN35M株(寄存編號：NITE BP-5(BCRC 910429))、Lactobacillus plantarum SN35N株(寄存編號：NITE BP-6(BCRC 910430))、Lactobacillus plantarum SN13T株(寄存編號：NITE BP-7(BCRC 9104427))以及Lactobacillus plantarum SN26T株(寄存編號：NITE BP-8(BCRC 910428))所構成的群中選擇。
在本發明之IL-抑制劑中的上述培養上層清澈液，最好採用果汁或果菜之作為培基培養。
本發明之IL-抑制劑最好使用再抗腫瘍劑、抗發炎劑以及牙周病的預防藥劑上。
本發明之機能性食品的特色，乃是含有上述的IL-8抑制劑。
製造本發明之IL-8抑制劑的方法包含取得植物乳酸菌的培養上層清澈液的工程，該植物乳酸菌的16S rRNA基因的特徵為(a)多核苷酸，含有序列編號1~4其中一種所示之鹼基序列；(b)多核苷酸，含有如序列編號1~4所示之鹼基序列，該鹼基序列發生一種或多種鹼基缺失、置換或附加的情形；或者是(c)由序列編號1~4其中一種所示之鹼基序列互補構成之多核苷酸，在嚴苛條件下產生雜交(hybridize)之多核苷酸。
本發明之製造方法最好使用果汁或蔬菜汁作為培基。
本發明之製造方法中，亦可在上述培基中添加酒粕或燒酒蒸餾殘渣，或是酒粕、燒酒蒸餾殘渣之萃取物。
製造本發明之IL-8抑制劑的成份，其特徵為含有從Lactobacillus plantarum SN35M株(寄存編號：NITE BP-5(BCRC 910429))、Lactobacillus plantarum SN35N株(寄存編號：NITE BP-6(BCRC 910430))、Lactobacillus plantarum SN13T株(寄存編號：NITE BP-7(BCRC 910427)) 以及Lactobacillus plantarum SN26T株(寄存編號：NITE BP-8(BCRC 910428))所構成的群中選擇出之乳酸菌的生菌。
本發明之成份可另外含有由上述生菌發酵而成的發酵原料，上述發酵原料最好是乳汁、果汁或蔬菜汁。
下列記載應已將本發明之其他目的、特徵以及優點清楚說明，此外有關本發明之優點，透過下列參照附圖可清楚說明。
〔1〕植物乳酸菌
本發明係基於在特定之植物乳酸菌培養上層清澈液中發現抗IL-8活性而完成。「抗IL-8活性」乃是為了抑制IL-8的產生，最好是能阻礙IL-8產生的活性。
植物乳酸菌是指取自植物的乳酸菌，例如穀物、蔬菜、水果或含這些原料之發酵食品，或者是與發酵豬肉香腸等發酵食品製造有關、從香蕉等熱帶植物葉片中分離出來之物質。本發明之發明者過去已經分離出Lactobacillus plantarum SN13T株、Lactobacillus plantarum SN26T株、Lactobacillus plantarum SN35N株、Lactobacillus plantarum SN35M株、Lactococcus Lactis Subspecies Lactis SN26N株、Enterococcus Species SN21I株以及Enterococcus Munduti SN29N株的植物乳酸菌。此外，也得知許多其他的植物乳酸菌。過去我們不知道在這麼多樣的植物乳酸菌 中，以梨子以及桃子果汁作為培基的培養液上層清澈液中的乳酸菌特別具有良好的抗IL-8活性。
Lactobacillus plantarum SN35M株為本發明之發明者所分離出的菌株，已經寄託在獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託中心(292-0818千葉縣木更津市kZAUSA鎌足2-5-8)，寄存編號NITE BP-5(BCRC 910429)(寄存日：2004年7月6日，移管日：2009年2月16日)，該菌株在菌學上具有以下性質：來自哈蜜瓜的分離株，格蘭氏陽性菌，純合子(homozygous)型發酵，過氧化氫酶(catalase)陰性，無芽胞形成能力，亦可在好氧環境下培養，在分類學上的位置為Lactobacillus plantarum。
Lactobacillus plantarum SN35N株為本發明之發明者們所分離出的菌株，已經寄託在獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託中心(292-0818千葉縣木更津市kZAUSA鎌足2-5-8)，寄存編號NITE BP-6(BCRC 910430)(寄存日：2004年7月6日，移管日：2009年2月16日)，該菌株在菌學上具有以下性質：來自梨子的分離株，格蘭氏陽性菌，純合子(homozygous)型發酵，過氧化氫酶(catalase)陰性，無芽胞形成能力，亦可在好氧環境下培養，在分類學上的位置為Lactobacillus plantarum。
Lactobacillus plantarum SN13T株為本發明之發明者所分離出的菌株，已經寄託在獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託中心(292-0818千葉縣木 更津市kZAUSA鎌足2-5-8)，寄存編號NITE BP-7(BCRC 910427)(寄存日：2004年7月6日，移管日：2009年1月28日)，該菌株在菌學上具有以下性質：來自泰國產的發酵豬肉香腸的分離株，格蘭氏陽性菌，純合子(homozygous)型發酵，過氧化氫酶(catalase)陰性，無芽胞形成能力，亦可在好氧環境下培養，在分類學上的位置為Lactobacillus plantarum。
Lactobacillus plantarum SN26T株為本發明之發明者們所分離出的菌株，已經寄託在獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託中心(292-0818千葉縣木更津市kZAUSA鎌足2-5-8)，寄存編號NITE BP-8(BCRC 910428)(寄存日：2004年7月6日，移管日：2009年2月16日)，該菌株在菌學上具有以下性質：來自泰國產的發酵豬肉香腸的分離株，格蘭氏陽性菌，純合子(homozygous)型發酵，過氧化氫酶(catalase)陰性，無芽胞形成能力，亦可在好氧環境下培養，在分類學上的位置為Lactobacillus plantarum。
近年來以16S核糖體(ribosome)RNA(16S rRNA)基因鹼基序列的系統分類群體(群聚)為指標進行細菌分類與是別的方法逐漸普及。在一實施形態中，本發明所使用之植物乳酸菌16S rRNA基因為含有如序列編號1~4其中1種所示之鹼基序列的多核苷酸。此外，序列編號1~4所示之鹼基序列分別是Lactobacillus plantarum SN35M株、Lactobacillus plantarum SN35N株、Lactobacillus plantarum SN13T株以及Lactobacillus plantarum SN26T株的16S Rrna基因的鹼基序列。在本發明中可單獨使用前述的植物乳酸菌，亦可以2種以上組合使用。
在本說明書所使用之用語「多核苷酸」，可置換成「基因」、「核酸」或「核酸分子」交換使用，所需要的是核苷酸聚合體。在本明細中所使用的用語「鹼基序列」可置換成「核酸序列」或「核苷酸序列」，是指DNA(deoxyribonucleotides)(省略A,G,C與T(或U)的序列。
此外，在16S rRNA基因含有序列編號1~4的其中一種的多核苷酸變異體植物乳酸菌中，其培養液上層清澈液中具有抗IL-8活性，也是本發明應使用之植物乳酸菌。本說明書中在使用多核苷酸這個字時，「變異體」不是指任意的變異體，而是指雖然與序列編號1~4的其中一種的鹼基序列有若干不同，但卻與序列編號1~4的其中一種的鹼基序列幾乎相同或近似，在本業者可輕易認定的範圍內的多核苷酸，該多核苷酸可以是天然多核苷酸，亦可經人為改變過的多核苷酸。此外，本業者依照本說明書的內容，可以輕易確認該類在16S rRNA基因含有序列編號1~4的其中一種的多核苷酸變異體植物乳酸菌中，其培養液上層清澈液中是否具有抗IL-8活性。這類多核苷酸變異體有包括：(1)多核苷酸，含有如序列編號1~4所示之鹼基序列，該鹼基序列發生一種或多種鹼基缺失、置換或附加的情形，(2)由序列編號1~4其中一種所示之鹼基序列互補構成之多核苷 酸，在嚴苛條件下產生雜交(hybridize)之多核苷酸等等。
雜交(hybridization)可依照「Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版，J.Sambrook以及D.W.Russll編著，Cold Spring Harbor Laboratory,NY(2001)(本說明書中亦沿用參考)所記載的眾所周知的方法進行。在本說明書中，用語「在嚴苛條件下」是指在雜交溶液(含50%甲醯胺(Formamide)，5 x SSC(150mM的NaCl，15mM的三檸檬酸鈉)，50mM的磷酸鈉(pH7.6)，5x丹哈德溶液(Denhardt's solution)，10%硫酸葡萄聚糖以及20μg/mL的變性鮭魚精子DNA片段)中以42℃培育一晚以後，以約65℃在0.1xSSC中過濾洗淨。
因此，本發明所使用之植物乳酸菌，其16S rRNA基因可說為(a)多核苷酸，含有序列編號1~4其中一種所示之鹼基序列；(b)多核苷酸，含有如序列編號1~4所示之鹼基序列，該鹼基序列發生一種或多種鹼基缺失、置換或附加的情形；或者是(c)由序列編號1~4其中一種所示之鹼基序列互補構成之多核苷酸，在嚴苛條件下產生雜交(hybridize)之多核苷酸的乳酸菌。使用如此之植物乳酸菌，就能很輕易取得顯示抗IL-8活性的部分。
〔2〕製造IL-8抑制劑的所需成份
本發明提供了能讓從Lactobacillus plantarum SN35M株、SN35N株、SN13T株以及SN26T株所構成群中選擇出之植物乳酸菌生菌生存的成份。使用本發明的成份，即可製造IL-8抑制劑。
本發明之成份也可再含有由上述植物乳酸菌所發酵的發酵原料。此外，本發明之成份也可再含有酒粕或燒酒正流殘渣或者是其萃取物。
本說明書中所使用的用語「成份」，可以是單一成份狀態，也可以是另外的單一套組(kit)狀態。換句話說，本發明之成份可以另外含有培基，或採用將含有可讓上述植物乳酸菌之生菌生存的成份以及發酵原料分別準備之套組形態。此外，本發明之成份可以另外含有麴菌發酵的米發酵物或酒粕或燒酒蒸餾殘渣，或其萃取物，但是本發明亦可採用本發明之成份與酒粕或燒酒蒸餾殘渣或其萃取物分開準備之套組形態。
本發明所使用之發酵原料最好從乳汁、果汁以及蔬菜汁所構成汁群組中選擇。乳汁可以是動物乳汁(例如牛乳、山羊乳、綿羊乳等)，尤其以牛乳為佳。乳汁可採用未殺菌乳與殺菌乳任何一種，或是以其乳汁所調製成的濃縮乳或煉乳、脫脂乳、部份脫脂乳以及乾燥成粉末狀的奶粉等。果汁可使用如桃子、梨子、蘋果、草莓、石榴、葡萄、芒果、橘子、柳丁等的汁液，但不限定在此範圍。此外，蔬菜汁可使用例如紅蘿蔔、番茄、甘藍菜等的汁液，但不限定在此範圍。果汁與蔬菜汁乃是將水果或蔬菜以果汁機等絞碎，如有必要則榨汁取得。這類果汁與蔬菜汁可適當濃縮使用，濃縮液可直接以濃縮狀態使用，亦可加入蒸餾水等稀釋成適當濃度使用。此外，上述的乳汁、果汁以及果菜汁可單獨使用，亦可配合使用目的搭配使用。
在本說明書中，用語「含有生菌可生存」是指讓所需菌株在非死去狀態下保持在成份物中的態樣，只要是在此態樣並無特別限制。也就是說，讓所需菌株在上述成份物中增殖或休眠都無妨。在一實施形態中，本發明之成份物最好另外含有以Lactobacillus plantarum SN13T株發酵之發酵原料，最好含有酒粕或燒酒蒸餾殘渣或是其萃取物。只要是在此形態下，就能讓Lactobacillus plantarum SN13T株的生菌保持良好的酵素活性，就能讓該生菌生存在成份物中。在其他的實施形態中，本發明之成份物含有適當之賦形劑以及Lactobacillus plantarum SN13T株的生菌。在該領域一般所知不會對乳酸菌的生存產生影響的賦形劑有例如澱粉、乾燥酵母、乳糖、白糖等等，此外，也可以採用將成份物加工成錠劑的材料(例如玉米肽、麥芽糖等)。如此一來，製造本發明之IL-8抑制劑所需的成份物就成了所謂的「發酵種子(starter)」。
〔3〕IL-8抑制劑與其製造方法
本發明能提供IL-8抑制劑。在本發明之IL-8抑制劑中，其特徵為含有前述的植物乳酸菌的培養液上層清澈液或是從該上層清澈液萃取的萃取物。
本發明之IL-8抑制劑乃是採用包含取得上述植物乳酸菌的培養液上層清澈液的工程在內的製造方法所製造。所取得之培養液上層清澈液可直接使用，亦可使用其萃取物。此外，本發明之IL-8抑制劑的製造方法可以在培養培基外另外再添加酒粕或燒酒蒸餾殘渣或其萃取物。此外， 關於酒粕或燒酒蒸餾殘渣或其萃取物的部份，在本說明書沿用參考的日本公開專利公報「特開2006-42796號公報」中有詳細記載，業者可輕易了解。
本發明中所使用的培養培基可使用例如果汁或蔬菜汁。果汁可使用例如桃子、梨子、蘋果、草莓等的汁液，但並不在此限。另外，蔬菜之可使用例如紅蘿蔔、番茄、甘藍菜等的汁液，但並不在此限。果汁與蔬菜汁是將水果或蔬菜以果汁機絞碎，如有必要則榨汁取得。該類果汁與蔬菜汁可適當濃縮使用，濃縮液可直接以濃縮狀態使用，亦可加入蒸餾水等稀釋成適當濃度使用。使用這樣的培基，即可獲得含有抗IL-8活性的培養液上層清澈液。此外，可去除抗IL-8活性以外的雜質，如有必要，可以一般所知的方法實施脫臭、脫色處理，這樣都在上述萃取物的涵蓋範圍內。
本發明汁IL-8抑制劑製造方法中的培養工程可以是將發酵原料以植物乳酸菌生菌發酵的發酵工程。發酵工程最好是在酸度0.6~1.5%範圍內讓發酵原料發酵為佳。發酵只要採用該領域一般所知的方法進行即可。使用果汁或蔬菜汁作為發酵原料時，須將果汁或蔬菜汁或者是在前述汁液中添加其他原料的溶液以65~130℃做1秒~30分鐘的加熱殺菌，然後再冷卻到30~45℃，之後在該溶液中接種植物乳酸菌0.1~6重量%，之後以30~45℃的溫度使其發酵12~72小時，發酵完畢後取冷卻的發酵物(發酵果汁或發酵蔬菜汁)使用。這些發酵果汁或發酵蔬菜汁可直接當作飲料使 用，亦可將之稀釋或殺菌之後作為發酵果汁飲料或發酵蔬菜汁飲料。
另外，在取得發酵物時，除了發酵原料外，亦可添加果膠、寒天、糖類、香料、果肉等一般製造發酵飲料時常用的原料。例如蔗糖、葡萄糖、果糖、巴拉金糖(Palatinose)、漏蘆糖(Trehalose)等的糖類、山梨醇、木糖醇、丁四醇、還原水飴等的糖醇類、阿斯巴甜、安賽蜜(Acesulfame K)等高甜度甘味料，蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、卵磷脂等的乳化劑，鹿角菜膠、三仙膠、關華豆膠(Guar Gum)等增稠劑，檸檬酸、乳酸、蘋果酸等的酸味料，檸檬汁、柳橙汁等的果之類，此外亦可添加維他命類或鈣、鐵、錳、鋅等的礦物質類，甚至還可添加甘草、桂枝、生薑之類的生藥，或是香草、谷氨酸單鈉鹽、梔子色素、矽、磷酸言等的食品添加物。
本發明之IL-8抑制劑可作為抑制IL-8產生的試藥，可作為製造醫藥成份或食用成份的添加劑，亦可作為醫藥或食用成份。本發明之IL-8抑制劑特別可用來製造能抑制IL-8產生的機能性食品。
當幽門螺旋桿菌附著在胃黏膜上生長石，胃細胞會因為幽門螺旋桿菌所產生的毒素引起反應而產生IL-8。如此一來聚集而來的嗜中性白血球就會釋放出活性氧，攻擊幽門螺旋桿菌。但是胃細胞本身也會受到活性氧的攻擊，於是就會引發胃潰瘍，終至發展成胃癌。利用本發明之IL-8抑制劑可以獲得抑制胃癌惡化的效果。當然IL-8抑制劑不 僅能治療幽門螺旋桿菌的感染，也能對治療各種與IL-8有關的疾病做出很大貢獻。也就是說，本發明之IL-8抑制劑最好用來作為抗腫瘤劑或抗發炎劑。
在預防蛀牙上，使用氟是強化牙齒的唯一方法。在牙周病方面人們也期待能夠開發出控制牙肉上皮細胞-這個最早防禦牙周發炎的防禦層的機能。在使用防禦類胃潰瘍治療藥馬來酸伊索拉定(Irsogladine Maleate,IM)以取自牙肉上皮細胞的間隙連接細胞間溝通能力時，結果顯示IM能抑制受牙周病原菌刺激過的培養牙肉上皮細胞產生IL-8，能避免牙周病原性細菌的刺激，恢復原本已經降低的細胞間溝通能力，以及透過間隙接合細胞間進行溝通能力的降低與IL-8有關。此外，從投與IM的牙周病實驗鼠身上，可看到能幾乎完全抑制牙周病源細菌刺激所產生的牙周組織發炎情形。因此，使用本發明之IL-8抑制劑控制牙周上皮細胞的機能，可獲得預防牙周病發生的技術。也就是說本發明之IL-8抑制劑適合用在預防牙周病上。
使用本發明所製造的醫藥成份物可以製藥領域一般所知的方法製造。在本發明之醫藥成份物中，抗IL-8活性的含量需考慮到投與形態、投與方法，只要能夠適量地投與，含量多少無特別限制。本發明之醫藥成份物最好採用口服，可調製成適合口服的定劑、膠囊形態。在口服的狀態(也就是口服劑)下，可使用例如澱粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧酸甲基纖維、玉米粉、無機鹽等作為醫藥用載體。此外，在調製口服劑時還可以添加結合劑、崩散劑、 界面活性劑、潤滑劑、流動促進劑、矯味劑、著色劑、香料等。另外本發明之醫藥成份物中亦可存在安定劑、抗氧化劑等等的補助物質。本發明之醫藥成份物除了可以直接口服之外，也可添加在任何飲、食品中在日常生活中攝取。投與和攝取最好在所需之投與量範圍內，可1日單次，或者分成數次投與或攝取。
因此，可從本發明之IL-8抑制劑得治療或預防與IL-8有關之疾病或症狀的醫藥成份物。與IL-8有關之疾病或症狀有：過敏性疾病、寄生蟲感染症、全身性紅斑性狼瘡等等的自我免疫疾病、病毒感染症、細菌感染症、惡性腫瘤(漿細胞瘤、多發性骨髓瘤、癌惡病質、心房黏液瘤、骨髓瘤、淋巴上皮樣淋巴瘤等)、移植物抗宿主(Host-versus-Graft,HVG)病或後天性免疫不全症候群(AIDS)、自我免疫性疾病(類風溼性關節炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、貝西氏病等)、巨大淋巴結增生(Castleman)、愛滋病伴隨發生的卡波西氏肉瘤、停經後骨質疏鬆症、發炎性皮膚疾病(發炎性角化症(乾癬等)、過敏性皮膚炎、接觸性皮膚炎等)、發炎性腸病(克隆氏症、潰瘍性大腸炎等)、發炎性肝病(B型肝炎、C型肝炎、酒精性肝炎、藥物過敏性肝炎等)、發炎性腎臟病(腎絲球腎炎等)、發炎性呼吸道疾病(氣喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎等)等，但不在此限。
使用本發明所製造之食用成份物乃是為了抑制IL-8產生之食用成份物(也就是食品、飲料等)，在健康食品(機 能性食品)極為有用。本發明之食用成份物的製造方法並無特別限定，可使用例如用來調理、加工以及一般用的食品或飲料的製造方法製造，只要能讓本發明所得之抗IL-8活性含在該食品或飲料中即可。本發明之食用成份物有例如乳製品(例如優格)、健康食品(例如膠囊、錠劑、粉末)、飲料(例如乳類飲品、蔬菜飲品等)、口服液等等種類不在此限。
近年來由於飲食不均衡造成的肝臟或腎臟功能退化的人、對花粉或因植物而出現過敏症狀的人越來越多。採用本發明可以開發出能預防或改善生活習慣病與過敏症狀、利用乳酸菌與釀造微生物等機能的「機能性食品」與「醫藥品素材」。
本發明的實施形態不限定於上述幾種，在申請項目的範圍內可做各種變更，將不同的實施形態與各種公開的技術方法適當組合的實施形態也屬於本發明之技術範圍內。
〔實施例〕 〔調製樣品〕
使用在桃子或梨子果汁中添加1%酒粕的培基(pH6.5)培養取自植物乳桿菌Lactobacillus platarum(SN13T株以及SN35N株)。又，SN35N會生成多糖類，但是SN13T不會生成多糖類。以30℃培養20小時後，將培養液以4℃離心分離15分鐘回收細胞。將所得之上層清澈液以0.22mm過濾器殺菌，調整成pH7。上層清澈液冷凍乾燥，調製成只有離心分離前溶液3分之1、加了殺菌水的樣品(培養幽門 螺旋桿菌之上層清澈液樣品)。為了進行酵素聯合免疫試驗(ELISA)，因此將該樣品再度溶解於無血清培基(RPMI1640)中。
〔細胞〕
胃癌細胞株使用來自人胃的腺病毒腫瘤細胞株MKN45細胞，以及加藤III細胞(購自理化學研究所的細胞庫)。
〔酵素聯合免疫試驗(ELISA)〕
將存在於添加10%FBS、100mg/mL盤尼西林、100mg/mL鏈黴素之RPMI1640培基中的MKN45細胞播種到48個反應盤中以使之成為2.0x105細胞/盤，放入CO2孵育器內以37℃培育。然後將細胞單層洗淨，以無血清的RPMI1640培基培養16小時。將此細胞與上述樣本一起培育30分鐘，然後添加預先調製好的幽門螺旋桿菌懸浮液(6.0x109細胞/mL)進行刺激。在添加該懸浮液3小時後、6小時後、9小時後回收上層清澈液，使用ELISA(穿刺)依照附屬的指示書測量IL-8的程度。此實驗各做了3次。
〔進行RT-PCR分析以MKN45細胞確認發現IL-8〕
在添加上述樣本3小時與6小時後，取出RNA。使用PrimeScript Rtase(Takara Bio公司)依照所附的指示書，從2μg的RNA轉錄cDNA。在PCR中添加2mg的cDNA、0.5unit的ExTaq聚合酶、兩側的Primer以及dNTP，讓最終體積達50mL。以甘油三磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH)做 內部控制同時使之放大。對IL-8或GAPDH使用有特異性同義引子(Sense primer)與反義引子(Antisense primer)的PCR放大反應混合物。PCR條件為，以95℃做變性反應4分鐘後以94℃做變性30秒鐘，然後以55℃做降溫30秒鐘後以72℃伸長1分鐘為一週期重複26次。因此分別獲得了IL-8與GAPDH的放大產物299bp與1090bp的片段。
IL-8(同義引子：5'-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGC-3'(序列編號5)、反義引子：5'-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3'(序列編號6))、GAPDH(同義引子；5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'(序列編號7)、反義引子；5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3'(序列編號8))
〔IL-8的抑制效果〕
正如許多研究的報告所反應，Type IV分泌系統(T4SS)會使CagA從幽門螺旋桿菌移動到上皮細胞，同時促進酪胺酸磷酸化(tyrosine phosphorylation)讓宿主的訊號傳遞活絡，誘導合成IL-8。因此為了確認乳酸菌的各菌株培養液上層清澈液對胃上皮細胞MNK-45的IL-8誘導是否會造成影響，茲進行試管內調查(第1圖)。第1圖為乳酸菌培養上層清澈液驗本對受到幽門螺旋桿菌刺激的MKN-45細胞株之IL-8產生的效果。所有分析都做了3次。如第1圖所示，以幽門螺旋桿菌刺激細胞3小時時，IL-8的產生量較未接受刺激的細胞高約8倍。
對於受幽門螺旋桿菌刺激3小時的細胞，茲測量添加了幽門螺旋桿菌培養上層清澈液樣本後IL-8的產生量。添加SN13T株的果汁培養時，IL-8的產生量減少到約7分之1。以幽門螺旋桿菌刺激9小時，IL-8的產生量減少到約12分之1。添加SN35N株之桃子果汁培養液時，雖然IL-8的產生量同樣減少，但是SN35N株的培養上層清澈液對IL-8的抑制效果，可能也受到菌體外分泌的多糖類妨礙幽門螺旋桿菌附著到上皮細胞上的影響。另外，IL-8的產生量在添加SN35N的桃子果汁培養上層清澈液時為551.2pg/mL，添加梨子果汁培養上層清澈液時為584.5pg/mL。另外在添加SN13T的梨子果汁培養上層清澈液時為555.4pg/mL，但是只有對幽門螺旋桿菌刺激時的4分之1而已。
以上結果中顯示了一個重點，就是所產生的IL-8抑制作用非因乳酸菌產生乳酸所致。這一點在添加0.4M的乳酸溶液，培養9小時更長的時間後，IL-8的發現量增加，其程度與只受幽門螺旋桿菌刺激時幾乎相同時清楚呈現。
有報告顯示，酚類以及其誘導體，尤其是兒茶酚類對HL-60細胞具有促進IL-8產生，導致細胞凋亡。本發明之發明者發現到，在SN13T以桃子果汁培養的過程中，產生了大量的兒茶酚(約200mg/L)(未公開)。因此又使用MKN-45細胞進一步研究IL-8是否會仰賴兒茶酚誘導。有趣的是，單純以兒茶酚刺激細胞時，其濃度越高時也越促進IL-8產生，但在SN13T株的桃子果汁培養上層清澈液(含 有大量的兒茶酚)中卻幾乎未產生IL-8。同時在細胞的增殖上進行了MTT試驗，確認SN13T株的桃子果汁培養上層清澈液並不會影響到細胞的生死。由此顯示，SN13T株是因為菌體外所分泌的代謝物抑制了幽門螺旋桿菌刺激胃上皮細胞產生IL-8的狀況。
亦做了從MKN-45細胞中抽出之全RNA的RT-PCR分析。PCR反轉錄結果顯示了應該是IL-8的299bp的頻譜(第2圖)。第2圖為在血清飢餓之MKN-45細胞株的IL-8檢查中，定量RT-PCR分析的結果。在第1排未受刺激，第2排為只受到幽門螺旋桿菌刺激。第3排為受到幽門螺旋桿菌與桃子果汁控制之刺激，第4排為受到幽門螺旋桿菌以及桃子果汁培養的SN13T培養上層清澈液刺激者，第5排為受到幽門螺旋桿菌以及桃子果汁培養的SN35N培養上層清澈液刺激者。第6排為受到幽門螺旋桿菌與梨子果汁控制之刺激者，第7排為受到幽門螺旋桿菌與梨子果汁培養的SN13T培養上層清澈液刺激者，第8排為受到幽門螺旋桿菌以及梨子果汁培養的SN35N培養上層清澈液刺激者。第9排為受到幽門螺旋桿菌與乳酸(0.4M)刺激者，第10排為受到幽門螺旋桿菌以及兒茶酚(0.5mg/mL)刺激者。
如第2圖所示，未受刺激的MKN-45細胞就未發現有IL-8。但是只經幽門螺旋桿菌刺激者除了添加了0.5M乳酸溶液者外，在刺激後6小時就發現不同程度的IL-8，尤其是添加了SN35N的梨子果汁培養上層清澈液，以及添加了SN13T的桃子果汁培養上層清澈液時，RT-PCR產物都減少 了。此外，所有樣本中，有內部控制的GAPDH的頻譜(1090bp)一直都擴大，在各萃取樣品中，顯示GAPDH的mRNA含有程度相同。若考慮到ELISA試驗的結果，就可確認SN35N的梨子果汁培養上層清澈液以及SN13T的桃子果汁培養上層清澈液幾乎都抑制了IL-8的產生，而該抑制效果並非來自乳酸以及兒茶酚類。
使用本發明可以提供新的介白質抑制劑。本發明之IL-8抑制劑可用來作為與IL-8有關之各種疾病的治療劑。本發明之IL-8抑制劑由於是在果汁或蔬菜汁中培養液中分泌上述之乳酸菌，因此安全性極高，不僅可作為醫藥品使用，還可作為健康食品、機能性食品等在日常發揮預防效果。
本發明提供了一種可以抑制介白質產生的新技術。本發明對醫藥與食品等相關領域的產業能夠大力貢獻，促進發展。
本說明書中所記載之學術文件與專利文獻，全部沿用作為本說明書的參考。
有關發明之詳細說明項目內容中所舉出之實施形態或實施例，係為說明本發明之技術內容，不應狹義解釋本發明之應用僅限於該具體例之範圍，本發明之精神以及下列的申請範圍，可做各種變化施行。
第1圖為相對於受幽門螺旋桿菌刺激時MKN-45細胞 株的IL-8的水準，乳酸菌培養上層清澈液所產生的效果。
第2圖為在血清飢餓下檢測MKN-45細胞株中的IL-8時，定量RT-PCR檢定的結果。
<110> 廣島大學
<120> IL-8抑制劑與其製造方法
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<170> PatentIn Ver.2.1
<210> 1
<211> 1560
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized DNA Sequence
<400> 5
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized DNA Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence：Artificially Synthesized DNA Sequence
<400> 8

Claims (10)

  1. 一種IL-8抑制劑，其係為：包含植物乳酸菌，由Lactobacillus plantarum SN35N株(寄存編號：NITE BP-6(BCRC 910430))及Lactobacillus plantarum SN13T株(寄存編號：NITE BP-7(BCRC 910427))所構成之群中所選擇；其有效成分係由果汁或蔬菜汁作為培養基培養並去除菌體所得或由該培養上層清澈液之萃取物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抑制劑，其中該培養基為梨子果汁或桃子果汁。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之抑制劑，其特徵為被用來作為抗腫瘤劑。
  4. 一種機能性食品，其係含有如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抑制劑。
  5. 一種IL-8抑制劑的製造方法，包括取得植物乳酸菌培養上層清澈液；且該培養上層清澈液乃是使用果汁或蔬菜汁作為培養基培養並去除菌體所得的工程，其特徵為該植物乳酸菌為：由Lactobacillus plantarum SN35N株(寄存編號：NITE BP-6(BCRC 910430))及Lactobacillus plantarum SN13T株(寄存編號：NITE BP-7(BCRC 910427))所構成之群中所選擇。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之製造方法，其中該培養基為梨子果汁或桃子果汁。
  7. 如申請專利範圍第5或6項所述之製造方法，其特徵為：上述培基中可以再添加酒粕或燒酒蒸餾殘渣以及其萃取物。
  8. 一種製造IL-8抑制劑所需之成份物，其特徵為：含有從Lactobacillus plantarum SN35N株(寄存編號：NITE BP-6(BCRC 910430))及Lactobacillus plantarum SN13T株(寄存編號：NITE BP-7(BCRC 910427))所構成之群中選擇出之可生存的乳酸菌生菌，進一步含有果汁或蔬菜汁做為發酵原料。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之成份物，其中該發酵原料為梨子果汁或桃子果汁。
  10. 如申請專利範圍第8或9項所述之成份物，其特徵為：另外含有酒粕或燒酒蒸餾殘渣以及其萃取物。
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