KR101394322B1 - 신규한 바실러스 서브틸리스 ｂｃｎｕ 9169 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물 - Google Patents

신규한 바실러스 서브틸리스 ｂｃｎｕ 9169 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(Bacillus subtilis BCNU 9169) 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액은 생체 내 안정성이 우수하고, 식중독을 일으키는 병원균에 항균 효과를 가지며, 콜레스테롤 저하, 항암 및 항염증의 효과가 우수하고, 소화기관 내 저해 환경에서 생존률이 우수함으로, 생균제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 바실러스 서브틸리스 ＢＣＮＵ 9169 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물{New Bacillus subtilis BCNU 9169 and probiotics composition comprising the same}
본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(Bacillus subtilis BCNU 9169) 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물에 관한 것이다.
생균제(Probiotics)는 숙주의 장내 미생물 균형을 유지시킴으로써 유익한 작용을 하는 미생물을 총괄하며, 인체 의약품인 정장제나 유산균 제제, 사료첨가제 및 건강식품 등으로 사용되고 있다. 일반적으로 생균제로 사용되는 미생물들은 안전하며, 섭취시 생체 내 저해환경 즉 위장의 위산, 담낭의 담즙 및 소장에서 분비되는 각종 소화효소에 저항력을 갖고, 대장과 직장에 도달해 증식하고 정착하는 능력을 갖는다.[FAO/WHO, 2002; Homma 1998]. 또한, 생균제는 장내 균총의 정상화, 유해 세균의 정착을 억제함에 따른 부패 산물의 생성 감소, 질병예방, 항암작용, 면역의 활성화, 혈중 콜레스테롤 저하 및 항산화 효과 등 균체 성분 자체로 체내에서 유용한 기능을 전제로 한다.
한국 전통 대두 발효식품(청국장, 메주)은 단백질 식품으로 기능성이 연구된 식품이다. 메주에 존재하는 미생물에 대해서는 오래전부터 연구되어 왔으며, 바실러스(Bacillus ) 속은 산업적으로 중요한 종으로 오랜 세월 동안 식품, 의약품 및 각종 발효 산업에서 사용되어, 안전성이 있다[Casula et al., 2002; El-Naggar et al., 2004; Green et al., 1999]. 또한 중요한 효소인 프로테아제, 아밀라제, 글루칸아제 및 셀룰라아제를 생성하며, 폴리펩타이드형의 바시트라신과 같은 항균 활성물질을 생성하며, 식중독균 외에도 위암의 원인인 헬리코박터 파이롤리(Helicobacter pylori)균에 대한 항균력을 가짐으로써, 생균제로 적합한 특성을 갖는다[Pinchuk et al., 2001; Tagg et al., 1995.]. 이미 1958년 이탈리아에서 일반 의약품으로서 B. clausii를 성분으로 한 Enterogermina의 상품화를 시작으로 바실러스 속을 이용한 생균제는 최소 50년 동안 사용되어 왔다. 또한, 미국의 nature's first Food, 일본의 bispan 및 중국의 medilac-vita 등 여러 나라에서 프로바이오틱 상품이 시판되고 있다. 생균제 정장제 중 바실러스 서브틸리스 2335 및 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis )2336의 혼합 제제인 바이오스포린(Biosporin)의 바실러스 서브틸리스 2335가 위암의 원인인 헬리코박터 파이롤리균을 저해하는 항균물질인 Amicoumacin A를 분비한다는 연구결과가 있으며, 일본에서 분리된 Bispan 제품의 Bacillus poyfermenticus SCD는 polyfermenticin SCD라고 명명된 박테리오신을 생성한다고 보고 되었다[Cutting, 2010; Jun et al., 2007;]. 바실러스 속의 균주들이 좋은 생균제로 사용할 수 있다는 점에 착안하여, 본 연구자들은 바실러스 속의 균주를 연구한 결과, 신규한 바실러스 서브틸리스 속 균주를 동정하였고, 상기 균주 및 이의 배양액이 콜레스테롤 저하능, 항암, 항염증 및 유해 병원균에 대해 항균능이 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 식중독을 일으키는 병원균에 대한 항균능이 있는 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공함에있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유산균 제제를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발효유를 제공함에 있다.
상기와 같은 문제 해결을 위하여, 본 발명은 식중독을 일으키는 병원균에 대한 항균능이 있는 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주를 제공한다.
또한 본 발명은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유산균 제제를 제공한다.
또한 본 발명은, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발효유룰 제공한다.
본 발명에 따른 균주 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 또는 이의 배양액은 생체 내 안정성이 우수하고, 식중독을 일으키는 병원균에 대한 항균 효과를 가지며, 콜레스테롤 저하, 항암 및 항염증의 효과가 우수하고, 소하기관 내 저해 환경에서 생존률이 우수함으로, 생균제에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 (Bacillus subtilis BCNU 9169)의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통수를 나타낸 도이다.
도 2는 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 (Bacillus subtilis BCNU 9169)의 pH별 시간에 따른 log CFU/ml를 그래프로 나타낸 도이다.
도 3는 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 (Bacillus subtilis BCNU 9169)의 담즙산 첨가시 시간에 따른 log CFU/ml를 나타낸 도이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 (Bacillus subtilis BCNU 9169)의 Caco-2세포에 대한 부착능을 나타낸 도이다.
도 5는 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 (Bacillus subtilis BCNU 9169)의 바실러스 세레우스에 대한 항균스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6은 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 (Bacillus subtilis BCNU 9169)의 시간별 생육곡선과 콜레스테롤 저하능(%)을 나타낸 도이다.
도 7은 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 (Bacillus subtilis BCNU 9169)의 Ikb-α 분해 저해능을 나타낸 도이다.
본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주를 제공한다.
상기 균주는 재래식 메주를 배양한 후, 배양액으로부터 프로테아제 활성이 우수한 균주를 분리하여 얻었다. 분리된 균주의 생리 화학적 특성을 Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology에 기술된 방법으로 분석하였고, 분자생물학적 특성을 16S rDNA 유전자 염기서열로 분석하여 상기 분리된 균주가 바실러스 서브틸리스와 99% 상동성을 보이는 신규한 균주로 동정하였다. 상기 균주를 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주라고 명명하였으며, 농업유전자원정보센터에 2012년 3월 8일자로 기탁하여 기탁번호 KACC 91717P를 부여받았다.
본 발명의 균주는 유해 미생물에 대하여 항균능이 있다. 특히, 식중독을 일으키는 유해 미생물에 항균능이 있으며, 구체적으로는 바실러스 세레우스에 대하여 항균능이 있다. 또한, 본 발명의 균주는 콜레스테롤 저하능, 항암 또는 항염증 효과가 우수하며 산성 및 인공 담즙에 대한 내성을 갖고 장내 부착능이 있어 소화기관 내 생존률이 우수하다.
또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.
상기 배양액에은 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주를 제거할 수 있고, 바람직한 배양액은 원심 분리 후 상층액이다. 배양액은 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액은 유해 미생물에 대한 항균능, 콜레스테롤 저하능, 항암 또는 항염증 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액은 생균제, 특히 인체 의약품인 정장제나 유산균 제제, 사료첨가제 및 건강식품에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 의해 발생 되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다. 상기 병원성 미생물은 식중독을 일으키는 병원성 미생물인 것이 바람직하며, 상기 식중독을 일으키는 병원성 미생물은 바실러스 세레우스 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질환으로는 급성 설사, 장염, 위장관염, 변비, 복통, 복부팽만, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 임상 투여시 경구 도는 비경구로 투여가 가능하며, 주성분인 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 약학적 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약학적으로 허용가능한 것은 모두 사용 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 콩기름, 미세결정 셀룰로오스 또는 만니톨이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC) 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스칼슘(Ca-CMC), 전분글리콜산나트륨(sodium starch glycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone) 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시 메틸셀룰로오스나트륨(Ma-CMC), 베타-시클로덱스트린, 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum)중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 소르빈산칼륨 중에서 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 병원성 미생물로 인해 발생하는 질환을 효율적으로 예방 또는 치료하는 목적으로 사용되는 것으로 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바 없으며, 음료, 분말, 캅셀, 연질캅셀, 정제, 껌, 점착 타입 액제 조성물로 사용될 수 있으며, 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형으로 사용할 수 있고, 탕제, 환제, 정제, 산제, 과립제 등의 제제로 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 상기 주요성분 이외에도 보조성분으로 비타민 B, C, E나 베타카로틴, Ca, Mg, Zn 등의 미네랄 함유 화합물이나 레시틴 등의 인지질 또는 말톨, 올리고당, 아미노산 등의 화합물을 사용할 수 있으며, 이 중에서도 비타민 C, E나 베타카로틴, 말톨 등 중에서 2 내지 3 성분을 혼합하여 사용하면 생체 활성 효과를 보강할 수 있기 때문에 더욱 바람직하다.
또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과 같은 천연향료나 천연과즙, 클로르필린, 플라보노이드 등의 천연색소 및 감미 성분인 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕 등과 구연산, 구연산나트륨 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 건강식품으로는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 다양한 형태로 가공될 수 있으며, 본 발명의 건강식품은 인체에 부작용이 없으면서 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 각각의 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액은 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 무제가 없으므로 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 또는 이의 배양액 100 ㎖당 일반적으로 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g 이다.
상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 또는 이의 배양액은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 프로바이오틱스는 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 생균제는 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한 , 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유산균 제제를 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액은 유산균 제제 100 중량부 당 0.01 내지 50 중량부인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며 당해업계의 당업자가 제조시 중량부를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액은 발효유 100 중량부 당 0,01 내지 50 중량부인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며 당해업계의 당업자가 제조시 중량부를 조절할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 또는 제제예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예 또는 제제예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예 또는 제제예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 분리 및 동정
1.1 메주로부터 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 분리
일반 가정의 재래식 메주 1g을 NB(nutrient broth)에 가하여, 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양액을 80℃ 항온기에서 중탕하였다. 이 후, 프로테아제 활성이 있는 균주를 분리하기 위하여, (W/V) 탈지 우유(skim milk)가 함유된 NA(nutrient agar)에 배양하여, 탈지 우유 분해능이 우수한 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(Bacillus subtilis BCNU 9169)균주로 명명하였다.
1.2 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 동정
Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology에 기술된 방법으로, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 생리 화학적 특성을 조사하였다. 이를 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에 기재된 +는 양성 반응을 의미하고, -는 음성반응을 의미한다.
내용 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169
무산소 조건에서 성장 -
그람 염색 +
운동성 -
포자형성 +
Voges-Proskauer test -
성장 온도 범위 15-50℃
성장 pH 범위 2.5-9
NaCl 존재시 성장(%) 3-10
동화작용
아라비노스 +
프록토즈(fructose) +
글리신 -
글루코스 +
락토스 -
만니톨 +
만노즈 +
라피노스 +
수크루스 +
자이로스 +
생산
프로테아제 +
겔라틴아제 _
카타라아제 +
옥시다아제 _
16S rDNA 유전자의 염기서열을 분석하여, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주를 분자생물학적으로 동정을 하였다. 표 2의 프라이머를 이용하여, 16S rDNA 유전자의 염기서열을 분석한 후, 상기의 결과를 BLAST 프로그램을 이용하여 GeneBank의 데이타베이스에 등록된 다른 표준균주(type strain)의 16s rDNA 유전자들과 blastsearch한 결과, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주는 바실러스 서브틸리스와 99% 상동성을 보였다. 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 16S rDNA의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었다.
또한 Clustal X 2.0(CLC bio, Denmark), Mega 4 program을 사용하여 상동성을 분석하고, neighbor joining method를 기반으로 계통수를 구축하였다. 상기의 결과를 도 1에 나타내었다.
프라이머 염기서열
27F 5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R 5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 분리한 균주는 계통적으로 B.subtillis 에 속해 있는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 균주를 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주라고 명명하였고, 이를 농업유전자원정보센터에 2012년 3월 8일 자로 기탁하여, 기탁번호 KACC 91717P를 부여받았다.
< 실시예 2> 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 생균제로서의 이용 가능성
2.1 안전성 검사
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 인체에 대한 안전성을 확인하기 위하여, 혈액 한천 배지(Sheep blood agar)에 분리 균주를 스트릭킹(streaking)한 후, 37℃에서 48시간 배양한 다음 균체 주위에 적혈구의 분해 현상인 β-용혈성 여부를 확인하였다. 또한, 인체 내 유해효소 생성확인 배지를 이용하여 인체 내 유해효소 생성을 확인하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
생물체 용혈소(Haemolysin) 페닐알라닌디아민아제 트립토판아제 유레아제 C
S. aureus ATCC 6538 β-용혈성 -
E. coli ATCC 10798 + -
P. mirabillis ATCC 49565 + - +
L. acidophilus ATCC 4356 ν-용혈성
B. subtilis BCNU 9169 ν-용혈성 - - -
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 적혈구 분해현상을 검사한 결과 ν-용혈성을 나타내었고, 다른 인체 내 유해효소인 페닐알리닌 디아민아제(phenylalanine deaminase), 트립토판아제 B(tryptophanase B) 및 우레아제 C(urease C)를 생성하지 않는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주는 인체에 안정한 것으로 판단하였다.
2.2 산 및 인공 담즙에 대한 내성 확인
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 생균제로서의 가능성을 확인하기 위하여, 산성 pH에 대한 분리 균주의 내성을 확인하였다.
1M의 염산을 이용하여 pH를 2.5, pH 3 또는 pH 4로 조정한 PBS(phosphate buffered saline; 0.8% 의 Nacl, 0.02%의 KH2PO4, 0.015%의 Na2HPO4 )에 배양액을 접종하였다. 이 후, 3시간 동안 배양하였고, 시간별로 시료를 채취하여 총균수(CFU/ml)을 측정하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.
또한, 0.3% Oxgall(Sigma Co., U.S.A)가 첨가된 NB에 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 배양액을 접종하였다. 4시간 배양 후의 총균수를 측정하였고, 저항성을 확인하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주는 pH 3.0 또는 pH 4.0에서는 총균수에서 약간의 감소가 있음을 확인하였고, pH 2.5에서 0시간에서 총균수 7.73 log CFU/ml이었고, 3시간 배양 후 총균수는 5.454 log CFU/ml로 나타남 확인하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 초기 총균수는 7.51 log CFU/ml, 4시간 배양 후 총균수는 6.92 log CFU/ml임을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주는 담즙에 대한 내성을 갖는 것으로 판단하였다.
2.3 세포표면 소수성 및 자가 결합 정도
생균제 선발기준 중에서 안정성과 더불어 장관세포에 대한 부착성은 매우 중요하다. 미생물세포의 장내 부착성은 세포 표면의 구조와 조성에 많은 영향을 받는데, 특히 세포표면의 소수성이 주요한 요인으로 알려져 있으며 자가 결합 정도가 높을시 부착능이 높다고 보고된바 있다. Doyle과 Rosenberg의 방법을 응용하여 생물의 탄화수소에의 부착능(microbial adhesion to solvents, MATS)을 이용해 소수성 및 응집도를 측정하였다. 구체적으로는, 자일렌(Xylene)을 사용하여 소수성과 응집도를 측정하였고, 결과를 표 4에 나타내었다.
종
 소수성(%)
(자일렌 이용)		 응집도(%)
1시간 2시간 3시간 4시간
바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 64.12 11.0 26.28 32.7 35.7
표 4에서 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 세포 표면의 소수성 정도는 64.12%로 나타남을 확인하였고, 응집 정도는 4시간 후에 35.7%로 나타남을 확인하였다.
2.3 장내 부착능
바실러스 서브틸리스 BCNU 9169의 장내 부착능을 췌장세포인 Caco-2 세포를 이용하여 측정하였다.
구체적으로는, Caco-2 세포를 1ml 배양액과 24-웰에 106 cells/well이 되도록 접종하였다. 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주를 배양한 후, 인산완충용액과 0.1% Triton X 100을 사용하여 상기 균주 및 Caco-2 세포를 웰 플레이트 바닥에서 떼어내고, 총균수를 측정하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 초기 총균수는 5.71 log CFU/ml임을 확인하였고, 배양 후 총균수는 4.78 log CFU/ml 임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주는 장내 부착능이 우수함을 알 수 있다.
< 실시예 3> 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 유해 미생물 억제 활성
바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 배양액의 상층액을 이용하여 식중독을 유발하고, 그람 양성균인 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대하여 well diffusion assay를 수행하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 바실러스 세레우스에 대한 항균 스펙트럼에서 억제존이 19mm임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주는 유해 미생물을 억제함을 알 수 있다.
< 실시예 4> 바실러스 서브틸리스 BCNU 9619 균주의 콜레스테롤 저하능 확인
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 콜레스테롤 저하능을 측정하기 위하여, 0.1% 의 콜레스테롤을 포함한 TSB 배지에 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주가 108 CFU/ml이 되도록 접종하였다. 이 후 24 시간 동안 배양하였고, 잔존 콜레스테롤 양을 콜레스테롤 키트를 통하여 시간별로 측정하였다. 또한, 균의 증식정도를 흡광도 측정기를 이용하여 측정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 잔존 콜레스테롤 양은 초기 콜레스테롤 양의 42.48%로서, 57.52%의 분해율을 보임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주는 콜레스테롤 저하 효과가 있음을 알 수 있다.
< 실시예 5> 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 항염증 및 항암 효과 확인
NF-κB의 과다 활성은 대장암, 위암, 간암 및 발생 염증을 유발한다. 또한 IkBα는 NF-κB에 결합하여, NF-κB의 핵 내 이동을 억제하여 표적 유전자의 발현을 억제한다. 따라서 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 항염증 및 항암 효과를 확인하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 IkBα 분해 저해 활성을 확인하였다. NIK는 IkBα의 분해 활성을 갖는다.
구체적으로는, 상기 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 세포를 PBS로 두 번 세척한 후 수확하였고, 1.100rpm 및 4℃에서 8분 동안 원심분리 하여 상등액을 제거하였다. 세포에 완충액 A로 현탁한 후 얼음에서 15분 동안 반응시켰다. 이 후, 1mL 주사기에 25G 바늘을 이용해 주사하여 세포막을 파괴시켰다. 이 후 14000rpm 및 4℃에서 15분 동안 원심 분리하여 상등액을 수거하였다. 분리한 상등액을 단백질 정량과 웨스턴 블러팅(western blotting)에 사용하였다.
시료 단백질을 10% SDS 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하였고, 젤 상의 단백질을 실온에서 90V로 2시간 Hybond ECL membrane(Amersham)에 전기적 이동(electrotransfer)시켰다. 상기 막(membrane)을 5% 탈지 분유를 포함한 TBS-T(tris-buffered saline-tween; pH 7.6 Tris-HCl, 137mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액으로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. 상기 막을 실험 목적에 따른 1차 항체와 실온에서 반응시키고, TBS-T용액으로 세척한 후, 퍼옥시다아제와 결합된 2차 항체로 다시 실온에서 반응시켰다. 반응시킨 막을 세척한 후 화학 형광 반응(ECL, Enhanced chemiluminescence)에 의해 발광시킨 후 암실에서 방사선 감지 필름으로 감광시킨 후 현상하였다. 막의 스트립(strip)은 스트립 완충액(6.25mM TrisCl(pH6.7), 2% SDS, 100mM 2-mercaptoethanol)에 넣고, 50℃ 수욕조에서 30분간 반응시킨 후, TBS-T 용액으로 10분 간격으로 2번 세척하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 나타난 바와 같이, NIK만 처리하였을 때 IkBα의 분해를 유도한 것에 비하여, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 배양액은 IkBα의 분해를 저해하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 및 이의 배양액은 항암 및 항염증효과가 있다고 판단하였다.
< 제제예 1> 식품의 제조
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 조리용 양념의 제조
조리용 양념 100 중량부에 본 발명 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 8 ~ 12 중량부로 혼합하여 장 기능 개선용 조리용 양념을 제조하였다.
2. 스프 및 육즙의 제조
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 8 ~ 12 중량부, 인진호 추출물 0.1 ~ 4 중량부, 갈근 추출물 0.1 ~ 3 중량부, 진피 추출물 0.1 ~ 3 중량부, 창출 추출물 0.1 ~ 3 중량부, 감초 추출물 0.1 ~ 3 중량부, 홍삼 추출물 0.01 ~ 3.24 중량부를 스프 및 육즙 100 중량부에 첨가하여 장 기능 개선용 육가공 제품, 면류의 스프 및 육즙을 제조하였다.
3. 유제품( dairy products )의 제조
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 8 ~ 12 중량부, 인진호 추출물 0.1 ~ 4 중량부, 갈근 추출물 0.1 ~ 3 중량부, 진피 추출물 0.1 ~ 3 중량부, 창출 추출물 0.1 ~ 3 중량부, 감초 추출물 0.1 ~ 3 중량부, 홍삼 추출물 0.1 ~ 3.24 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
4. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검은콩, 검은깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액을 진공 농축기에 감압, 농축하고 분무, 열풍 건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류, 및 본 발명의 추출물을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검은콩 8 중량부, 검은깨 7 중량부),
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액 건조분말(10 중량부),
영지(0.5 중량부), 및
지황(0.5 중량부).
< 제제예 2> 음료의 제조
1. 탄산음료의 제조
설탕 5 ~ 10 중량부, 구연산 0.05 ~ 0.3 중량부, 카라멜 0.005 ~ 0.02 중량부, 비타민 C 0.1 ~ 1 중량부, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액 10 중량부의 첨가물을 혼합하고 여기에 79 ~ 94 중량부의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 95 ~ 98℃에서 20 ~ 180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 ~ 0.82 중량부를 주입하여 탄산음료를 제조하였다.
2. 기능성 음료의 제조
비타민 C 0.1 중량부, 과당 5.8 중량부, 백설탕 3.8 중량부, 구연산 0.12 중량부, 사과산 0.03 중량부, 구연산 타륨 0.04 중량부 및 치자청색소 0.02 중량부에 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액 10 중량부를 배합하여 계량된 물에 완전히 용해시켰다. 상기 용해된 음료를 총량이 1 중량부가 되도록 계량된 정제수로 조정하였다.
3. 건강 음료의 제조
액상과당 0.5 중량부, 올리고당 2 중량부, 설탕 2 중량부, 식염 0.5 중량부, 물 75 중량부과 같은 부재료와 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액 10 중량부를 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강 음료를 제조하였다.
4. 야채 주스의 제조
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액의 진공건조물 10 g을 토마토 또는 당근 주스 1 ℓ에 가하여 건강 증진용 야채 주스를 제조하였다.
5. 과일 주스의 제조
본 발명의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주 또는 이의 배양액의 진공건조물 10 g, 을 사과 또는 포도 주스 1 ℓ에 가하여 건강 증진용 과일 주스를 제조하였다.
< 제제예 3> 발효유의 제조
탈지분유를 이용하여 무지유 고형분 함량을 8 ~ 20 중량부로 조정한 원료유룰 72 ~ 75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 일정온도까지 냉각시킨 후 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주를 106 cfu/㎖의 농도로 접종하여 pH 4~5가 될 때까지 배양하였다. 배양원료 후 배양액을 냉각시켰다. 과즙농축액 0.1 ~ 50 중량부, 식이섬유 0.1 ~ 20 중량부, 포도당 0.5 ~ 30 중량부, 올리고당 0.1 ~ 15 중량부, 칼슘 0.001 ~ 10 중량부, 비타민 0.0001 ~ 5 중량부 등을 녹여 시럽을 제조하였다. 이렇게 제조된 시럽을 살균한 후 냉각하여 사기 배양액과 일정비율로 혼합, 교반하여 균질화시킨 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다.
< 제제예 4> 유산균 균말의 제조
바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주를 MRS 브로스에 106 cfu/㎖의 농도로 접종하여 37℃에서 18 ~ 24 시간 동안 pH-조절발효(pH-control fermentation)를 실시하였다. 배양완료 후 4℃에서 10,000 ×g로 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 5% 탈지 우유(skim milk)에 2.5% 유장(whey), 5% 수크로오스(sucrose)가 함유된 보호제와 동량으로 혼합된 후 동결건조기를 통해 분말화 하였다. 이렇게 제조한 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 건조분말은 모두 1 ×1011 cfu/g 이상의 생균수를 나타내었다.
< 제제예 5> 유산균 제제의 제조
제제예 4에서 제조한 유산균 균말을 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 유산균 제제를 제조하였다. 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169 균주의 건조 분말 20 중량부에 올리고당 10 중량부, 무수포도당 20 중량부, 결정과당 5 중량부, 비타민 C 2 중량부, 과일분말향 5 중량부, 알로에 5 중량부, 식이섬유 15 중량부, 차전자피 18 중량부를 혼합하여 스틱 또는 병에 일정량 분주하여 포자하였다. 이렇게 제조된 유산균 제제는 5 ×108 cfu/g 이상의 생균수를 유지하였다.
농업생명공학연구원 KACC91717P 20120308
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 바실러스 세레우스에 대한 항균능, 콜레스테롤 저하능, IKB-α 분해 저해 활성, 산성 및 인공 담즙에 대한 내성을 갖는 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 메주로부터 분리된 것임을 특징으로 하는, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주는 장내 부착능이 있는 것을 특징으로 하는, 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주.
  6. 제1항의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물.
  7. 제1항의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식중독 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  12. 제1항의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유산균 제제.
  13. 제1항의 바실러스 서브틸리스 BCNU 9169(수탁번호: KACC 91717P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발효유.






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