CN110283761A - 一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌ccpm7647及其应用 - Google Patents

一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌ccpm7647及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647及其应用，属于生物制药技术领域。为解决现有抗癌药物副作用大的问题，本发明提供了一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，代表一个新的细菌物种，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17888，该菌来源于人体肠道，是一种新发现的芽孢杆菌，能产生抗癌活性代谢产物，可利用其代谢产物治疗癌症。由于其是在人体肠道内发现，因此对于人体的副作用很低或无，解决了目前抗癌药物副作用大，病人顺应性差等问题，并且有望可以通过调节肠道菌群的平衡达到预防癌症的目的。

Description

一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647及其应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647及其应用。
背景技术
癌症，作为危害人体健康的第一因素，一直以来都是世界医学界难以攻克的难关。现代人生活方式的不良改变，新增危险因素的层出不穷都促进着癌症的发生与发展。传统对癌治疗手段主要包括放疗化疗，癌细胞的耐药性以及对身体和精神上的摧残都是这类手段显著的缺点。即使近年来免疫疗法兴起，但仍不成熟，存在诸多未解决问题，实行起来多力不从心。寻找新的抗癌方法迫在眉睫。
发明内容
为解决现有抗癌药物副作用大的问题，本发明提供了一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647及其应用。
本发明的技术方案：
一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647，它属于芽孢杆菌属(Bacillus)，代表一个此前未知的细菌物种(species)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17888，保藏日期为2019年06月03日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
芽孢杆菌CCPM7647菌株形态特征：图1为芽孢杆菌CCPM7647三区划线培养所得菌落形态图。
芽孢杆菌CCPM7647的分子生物学特征：芽孢杆菌CCPM7647的特征序列如SEQ IDNo：1所示，通过BLAST与GenBank中已发表细菌序列进行比较，与芽孢杆菌属的细菌一致性最高，如图2进化树所示。链霉菌CCPM7647的全基因组序列已经测毕，特征序列是从链霉菌CCPM7647全基因组序列中拔萃出的具有清晰鉴别意义的序列片段。而且芽孢杆菌CCPM7647具有鲜明的生物学特征，在细菌物种判定上具有重要意义，因此将其归为芽孢杆菌属(Bacillus)，芽孢杆菌CCPM7647代表此前未经报道的芽孢杆菌属新物种。
本发明提供的一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用。
进一步的，所述抗癌药物包括用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和/或白血病的药物。
进一步的，所述应用为芽孢杆菌CCPM7647的发酵液在制备抗癌药物方面的应用。
进一步的，所述应用为芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物在制备抗癌药物方面的应用。
进一步的，所述芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物的制备方法为：
从平板上取芽孢杆菌CCPM7647单菌落到5mL GRC001液体培养基中，在一定培养温度和转速下扩增培养一定时间，再将5mL菌液转移至100mL GRC001液体培养基中，在一定温度和转速下大量扩增培养一定时间，最后将菌液离心，取上清液即可。
进一步的，所述GRC001液体培养基的配方为：
淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌。
进一步的，所述芽孢杆菌CCPM7647的液体扩增培养的温度为14-39℃，转速为120转/分钟，培养时间为2-10天。
进一步的，所述芽孢杆菌CCPM7647的大量扩增培养的温度为14-39℃，转速为120转/分钟，培养时间为2-10天。
进一步的，所述离心条件为8000rpm/min离心10min。
本发明的有益效果：
本发明通过肠道微生物群的宏基因组高通量筛查结合传统细菌学以及分子微生物学和遗传学方法，分离和鉴定具有强力抗癌活性的细菌。本发明提供的具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647来源于人类肠道，是一种新来源的芽孢杆菌，具备海洋、土壤等其他来源的芽孢杆菌不同的性质，能产生具有很强抗癌活性的代谢产物。该代谢产物具有广谱抗癌活性，可用于癌症的治疗，包括用于制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和/或白血病的药物。
由于芽孢杆菌CCPM7647是在人体肠道内发现，因此将其代谢产物制成抗癌药物后对于人体的副作用会很低或无，已通过动物实验证实对实验动物无毒副作用。
肠道菌群对健康的影响逐渐被发现并重视，其与各种疾病都有着十分密切的关系，因此进行肠道菌群领域的研究，在探索天然高效抗癌新方法上有着深远的意义。通过调节人体肠道微生物的状态或数量的比例的不同，从而达到预防癌症的目的。
附图说明
图1为芽孢杆菌CCPM7647三区划线培养所得菌落形态图；
图2为芽孢杆菌属(Bacillus)CCPM7647与与近缘细菌基于全基因组序列的进化树；
图3为人卵巢癌ES2细胞经过芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物作用后的形态对比图，A图为CCPM7647作用后的人卵巢癌ES2细胞、B图为对照；
图4为人卵巢癌ES2细胞经过芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物作用6h的CCK8实验结果图；
图5为芽孢杆菌CCPM7647抗癌效果动物实验-小鼠接种人卵巢癌ES2细胞系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647，它属于芽孢杆菌属(Bacillus)，代表一个此前未知的细菌物种(species)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17888，保藏日期为2019年06月03日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本实施例提供了一种芽孢杆菌CCPM7647的筛选方法。
一、筛选培养基及有关溶液的配制方法：
(1)GRC001固体培养基配方(1L)：
淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂20g；先溶解或混悬淀粉，然后加入其他成分，高压后摇匀。本实施例中的淀粉来自马铃薯或玉蜀黍或大豆或小米或其他谷物或其他植物。
(2)重铬酸钾：溶液终浓度为50mg/L。贮存液浓度为5g/L，溶剂为水，现用现配，避光，过滤除菌。有毒，切勿接触皮肤或吸入；配制100mL GRC001固体培养基时，加入1mL重铬酸钾贮存液，待培养基不太热时加入，混匀。
(3)FeSO4·7H2O母液：0.01g/mL。1g FeSO4·7H2O溶于100mLH2O中，每1000mLGRC001固体培养基加入1mL硫酸亚铁母液。
(4)PBS缓冲液配方(1L)：KH2PO4 0.27g，Na2HPO4 1.42g，NaCl 8g，KCl 0.2g。
二、芽孢杆菌CCPM7647的筛选方法：
是取自人粪便样本的细菌，具体方法如下：
(1)取样说明：交给粪便提供者一个取样包，包括以下物品：50mL离心管x 1；餐用汤匙x 1；PE手套x 2；餐用纸盘x 1；知情同意书x 1；取样说明书x 1。
(2)操作说明：详细阅读知情同意书，详细填写粪便提供者基本信息并签字；将粪便排到一次性餐用纸盘中；带上PE手套，用餐用汤匙挖取粪便中心部分约10g，放入到50mL离心管内，拧紧离心管盖子后，放回自封袋中；个操作过程避免碰触其他不相关物品；将装有粪便的离心管和知情同意书装入自封袋，由实验室人员集中收集回来。
(3)样品处理和细菌分离培养：取样，编号，混悬于10倍体积的PBS缓冲液中，取100μl涂直径90毫米平板，平板内含有含重铬酸钾+的GRC001固体培养基，14-39℃进行培养；单菌落三区划线14-39℃培养，见图1。
(4)存菌：500μl 50％甘油+500μl GRC001液体培养基，混匀后存菌。
实施例3
本实施例提供了一种芽孢杆菌CCPM7647的扩增方法：
从平板上取单菌落到5mL GRC001液体培养基中，120转/分钟，14-39℃，扩增2-10天后，再将5mL菌液转移至100mL GRC001液体培养基中，120转/分钟，14-39℃，大量扩增2-10天，最后将菌液离心，8000rpm/min离心10min，取上清液做后续抗癌实验。
实施例4
本实施例提供了一种芽孢杆菌CCPM7647抗癌活性验证实验：
(1)人卵巢癌ES2细胞培养：铺板，每孔100μl，细胞密度为1x105/mL，待人卵巢癌ES2细胞贴壁后向其中加入芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物5μl，对照组为等体积的GRC001液体培养基，再培养6-24小时后观察。镜下观察人卵巢癌ES2细胞形态。人卵巢癌ES2细胞变圆、脱落、死亡，见图3。
(2)芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物制备：从平板上取单菌落到5mL GRC001液体培养基中，120转/分钟，14-39℃，扩增后将菌液8000rpm/min离心10min，取上清液做后续抗癌细胞实验。
(3)CCK8试验：人卵巢癌ES2细胞铺板，每孔100μl，细胞密度为1x105/mL，待人卵巢癌ES2细胞贴壁后向其中分别加入芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物5μl、2.5μl、1.25μl、0.625μl、0.313μl、0.156μl，对照组不加菌株的代谢产物，各设4个重复孔，再培养6-24小时后观察。每孔加入10μl CCK8溶液，继续培养0.5-1h后在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值。结果如图4所示，芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物对于人卵巢癌ES2细胞的抑制作用与浓度呈现梯度。
最终证实从人肠道中筛选出来的芽孢杆菌CCPM7647对人卵巢癌ES2细胞具有显著的抑制活性。
(4)肿瘤动物模型试验：裸鼠(SPF级)购买后，适应性饲养一周，温度(25±2)℃，湿度保持在45％至50％。取生长状态良好且处于对数生长期ES-2-卵巢癌细胞，在生物安全柜内用0.25％的胰酶消化，收集细胞，5000r/min离心5分钟，用冷的PBS制成细胞悬液，细胞计数仪计数活细胞数，并将细胞浓度调整为1×106个/mL，将细胞悬液置于冰上待用。消毒裸鼠注射部位皮肤，用注射器吸取细胞悬液50μL，接种于裸鼠皮下，形成小皮丘。注射结束的裸鼠应用耳部打孔器，记号笔等对动物进行标记，对动物体重和成瘤体积进行测量。种瘤后，隔日记录下述指标：动物体重、瘤体积、动物状态等。约10日可见瘤体突出于皮下，开始记录瘤体积，并按照实验设计给药，具体为CCPM7647给药组和PBS对照组动物右后肢肿瘤内分别注射CCPM7647代谢产物(实验组)和PBS缓冲液(对照组)，实验结果如图4所示。22日后处死动物，详细记录体重(g)、瘤重量(g)、瘤体积(V＝0.5ab2，a长径，b短径)、脾重量(g)。ES-2卵巢癌细胞动物肿瘤形成的成功率为100％。随着实验的进程可观察到，与PBS组相比，CCPM7647给药组的肿瘤体积显著小于对照组动物。由动物实验结果可以证明芽孢杆菌CCPM7647对肿瘤细胞具有显著的抑制活性，抗癌效果显著。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨天齐人类第二基因组技术开发应用科技有限责任公司
<120> 一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1686
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌（Bacillus sp.）
<400> 1
gttggtgtat acgatcttgc caaggatacc ggtgaaggag cacttcaact cggacggaat 60
atcggttgga caattgacaa cttaaacaaa gatcctcaaa aagttctgga tactgttctg 120
gaatatgact atctaggtgt ctttcaaagt atggttgaca cattgaagga tgattgggat 180
aaaaagatga ttcacggcga tgcatataca cggatgcact atgttactta cctgggcgga 240
agtcttctgt tattgaaagg cggaaagtcc tctgtctcaa caggctcaaa agatcttgct 300
aaagttggcg gcacaattaa gaaaggcgga aagtctgtaa aacagtttta caaatctcct 360
gtcaatcggt atactcctgc attagaagga atccttcaag atgctgagca tactattaac 420
gtaaaaaata caccactcct aaaaggaata gccgattcca ctaaagatag ggtactcttt 480
aaatcaatca atggtaagtc atcaaaaaac aaggcagtta aaaaaggcct ttccaaaaaa 540
tcaagagaag ttgcgcttcc aaaggtagac acatatgaac aagctagaaa tgaggcgcta 600
aatctaattg gtgatttagg aatagattca aagcctttta taggtacttt atctaaaagc 660
gcaggctttg gtaaagttac tggccgaatg tctgaagata ataaagtcct ttggagatta 720
gattatgatc ccgaaaaggg acctcatata aatgttgagg attatagaaa tggaaaagga 780
gataaggcaa agaaatatta tatacctttt aacggaaacg aagatactta taaatccctt 840
ttaaaacatt taaataaata gatgggattt ccgcggattt tacactatcc gggcagtaaa 900
tggtctatga cagactggat catcagccat atgcccgagc ataaaacata cgttgaacct 960
ttctttggat ccggagcatt gttttttaat aaacagccct cgaccatcga aacaatcaat 1020
gatctggata gcagcgtggt caatcttttc aaagtcattc gggatcatcc ggaagagctt 1080
gcgagattaa ttgaatggac gccgttatcc agagaggaat attacgcctc ctatgattct 1140
gaatcaggcg atgaaataga ggacgcccga cgttttctca ttcgttgctg gcaggccata 1200
ggagcgaaaa caagtgaccg gacaggctgg cggagcttga tcagtagtaa cgggcctgac 1260
acagcaaaag agtggggtaa actgcctgca aaggtattgt tagtagccaa gcgactgaaa 1320
gaggctcaga ttgaacatca gcccgcagtc cagctgcttg aaaggtataa gcgaaaagag 1380
gttcttgttt acgcggaccc gccttacatc atcgaaacgc ggacaaagcg gcattacaaa 1440
cacgaaatga caatagaaga tcatgttgaa ctgcttgaga cgctggatga acaccctggt 1500
cctgttcttc tctcagggta tgcacatcca atatacgatg aacgactcag gcattggaaa 1560
agagaaatac gagaagtatc agcggaagcc ggagccaaac gccaagaagt gttatggatc 1620
aacccggttg ctgctgaaca aagttacttt cagcaatcat tgttcagttt ggaggcccgg 1680
tcatga 1686

Claims (10)

1.一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647，其特征在于，它属于芽孢杆菌属(Bacillus)，代表一个新的细菌物种，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.17888，保藏日期为2019年06月03日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一株如权利要求1所述的具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用。
3.根据权利要求2所述一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述抗癌药物包括用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌和/或白血病的药物。
4.根据权利要求2或3所述一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述应用为芽孢杆菌CCPM7647的发酵液在制备抗癌药物方面的应用。
5.根据权利要求2或3所述一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述应用为芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物在制备抗癌药物方面的应用。
6.根据权利要求5所述一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌CCPM7647的代谢产物的制备方法为：
从平板上取芽孢杆菌CCPM7647单菌落到5mL GRC001液体培养基中，在一定培养温度和转速下扩增培养一定时间，再将5mL菌液转移至100mL GRC001液体培养基中，在一定温度和转速下大量扩增培养一定时间，最后将菌液离心，取上清液即可。
7.根据权利要求6所述一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述GRC001液体培养基的配方为：
淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌。
8.根据权利要求6所述一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌CCPM7647的液体扩增培养的温度为14-39℃，转速为120转/分钟，培养时间为2-10天。
9.根据权利要求6所述一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌CCPM7647的大量扩增培养的温度为14-39℃，转速为120转/分钟，培养时间为2-10天。
10.根据权利要求6所述一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌CCPM7647在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述离心条件为8000rpm/min离心10min。
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