CN105695544A - 一种从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法 - Google Patents

一种从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法方法。制备环(脯-甘)二肽方法主要包括菌种活化及培养，粗提物的获得，将粗提物经硅胶柱层析粗分，利用重结晶法纯化，TLC跟踪检测，得到化合物经核磁检测并与文献对比鉴定为环(脯-甘)二肽。本发明所用原料凝结芽孢杆菌是一种益生菌，安全无害，提取工艺简单，成本低；制得的化合物纯度高。

Description

一种从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法
技术领域
本发明属于环(脯-甘)二肽的制备技术领域，具体涉及一种从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法。
背景技术
凝结芽孢杆菌（bacilluscoagulansLL1103），又称芽孢乳酸菌，既拥有乳酸菌产乳酸的特性，又具有芽孢杆菌的丰富的酶系统及抗逆性强、耐高温、耐胆盐、易储存的特性。作为益生菌家族的后起之秀，将其制成微生态制剂己被广泛地应用于水产养殖、畜牧伺料、食品和医药等行业。凝结芽孢杆菌除了在维持肠道微生态平衡中的保健作用外，其对常见肠道疾病如慢性结肠炎、腹泻和便秘等有明显疗效，还具有调节血糖血脂和提高免疫力的功效。
研究表明凝结芽孢杆菌代谢产物中具有抑制腐败菌和致病菌的多肽类物质细菌素，近年来还有关于凝结芽孢杆菌产生抗植物病原真菌的报道。但是凝结芽孢杆菌代谢产物中却未见小分子物质环二肽类化合物的报道，环二肽是一种具有稳定六元环结构的二酮哌嗪类物质，表现出抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、神经保护、抗高血糖、抗疟疾等多种生物活性和药理活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备工艺简单、制得的环(脯-甘)二肽纯度高的从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，环(脯-甘)二肽的结构式如下：
；
所述方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将凝结芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；
（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到MRS液体培养基中，在150r/min，37℃条件下，摇床培养12～16小时，得种子液；
（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到MRS液体培养基中，种子液的体积为MRS液体培养基体积的4～6%，在150r/min，37℃条件下，摇床培养48～72小时得发酵液；
（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液旋蒸浓缩至原发酵液体积的1/4后离心，取上清液用乙醇沉淀，过滤并继续将滤液浓缩至原滤液体积的1/4，然后用乙酸乙酯萃取，将水相用正丁醇进行再次萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩获得粗提物；
（5）硅胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物用甲醇溶解，然后硅胶拌样后装柱，固定相为80-100目的硅胶，以二氯甲烷：甲醇体积比=50:1～1:1梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为20:1的流份；
（6）将步骤（5）得到的流份采用重结晶法纯化，重结晶法纯化的具体操作为：将步骤（5）得到的流份旋蒸浓缩除去二氯甲烷和甲醇，干燥，在50℃下加入二氯甲烷:甲醇（体积比）=1:1的二氯甲烷-甲醇溶剂溶解完全，然后4℃下冷凝12~24h，过滤，干燥，用甲醇洗涤，将甲醇洗涤后的固体加入二氯甲烷:甲醇（体积比）=1:1的二氯甲烷-甲醇溶剂溶解完全，然后4℃下冷凝12~24h，过滤，干燥，得环(脯-甘)二肽。
所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、琼脂15.0g/L，吐温-801.0mL/L，pH6.0。
所述MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温-801.0mL/L，pH6.0。
所述步骤（4）中发酵液旋蒸浓缩后离心分离的工艺条件为：离心条件为温度4℃，转速为5000rpm，离心时间20min。
所述步骤（4）中上清液用乙醇沉淀的具体操作为：向上清液中加入等体积的95%的乙醇。
所述步骤（4）中浓缩后滤液用乙酸乙酯萃取的具体操作是：将浓缩后滤液与乙酸乙酯按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2~3次，每次静置20～30min，得到水相；乙酸乙酯萃取得到的水相用正丁醇萃取的具体操作是：水相与正丁醇按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2~3次，每次静置20～30min，得到正丁醇萃取液。
本发明产生的有益效果是：本发明以凝结芽孢杆菌为原料进行环(脯-甘)二肽的提取，凝结芽孢杆菌是一种益生菌，其代谢产物具有天然性安全性，且提取方法简单，成本低，具有可持续性，制得的环(脯-甘)二肽纯度高（可达99%），对促进环(脯-甘)二肽药理学进一步研究和做为药物先导化合物开发和利用具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1制备的环(脯-甘)二肽的1HNMR图；
图2为实施例1制备的环(脯-甘)二肽的13CNMR图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。以下实施例中的所用的凝结芽孢杆菌来源于中国典型培养物保藏中心（保藏编号：CCTCCNO：M2013193）。
实施例1
一种从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将凝结芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；
（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到MRS液体培养基中，在150r/min，37℃条件下，摇床培养12小时，得种子液1L；
（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到MRS液体培养基中，种子液的体积为MRS液体培养基体积的4%，在150r/min，37℃条件下，摇床培养48小时得发酵液20L；
（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液旋蒸浓缩至原发酵液体积的1/4后离心，取上清液用乙醇沉淀，过滤并继续将滤液浓缩至原滤液体积的1/4，然后用乙酸乙酯萃取，将水相用正丁醇进行再次萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩获得粗提物20g；
（5）硅胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物用甲醇溶解然后硅胶拌样后装柱，固定相为80-100目的硅胶，以二氯甲烷:甲醇体积比=50:1～1:1梯度洗脱（二氯甲烷:甲醇体积比为50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，1:1），硅胶薄层层析检测，收集二氯甲烷-甲醇的体积比为20:1的流份；
（6）将步骤（5）得到的流份采用重结晶法纯化，重结晶法纯化的具体操作为：将步骤（5）得到的流份旋蒸浓缩除去二氯甲烷和甲醇，干燥，在50℃下加入二氯甲烷：甲醇=1:1的二氯甲烷-甲醇溶剂溶解完全，然后4℃下冷凝12h，过滤，干燥，用甲醇洗涤，将甲醇洗涤后的固体加入二氯甲烷：甲醇=1:1的二氯甲烷-甲醇溶解完全，然后4℃下冷凝12h，过滤，干燥，得环(脯-甘)二肽（980mg，纯度99.1%）。
所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、琼脂15.0g/L，吐温-801.0mL/L，pH6.0。
所述MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温-801.0mL/L，pH6.0。
所述步骤（4）中发酵液旋蒸浓缩后离心分离的工艺条件为：离心条件为温度4℃，转速为5000rpm，离心时间20min。
所述步骤（4）上清液用乙醇沉淀的具体操作为：向上清液中加入等体积的95vol%的乙醇。
所述步骤（4）中浓缩后滤液用乙酸乙酯萃取的具体操作是：将浓缩后滤液与乙酸乙酯按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2次，每次静置30min，得到水相；乙酸乙酯萃取得到水相用正丁醇萃取的具体操作是：水相与正丁醇按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2次，每次静置30min，得到正丁醇萃取液。
由图1－2可知，经1HNMR、13CNMR分析，比对文献（刘海滨,高昊,王乃利,等.红树林真菌草酸青霉(092007)的环二肽类成分[J].沈阳药科大学学报,2007,24(8):474-478.），确认提取到的化合物为环(脯-甘)二肽。
上述实施例为本发明优选的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明所作的改变均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，环(脯-甘)二肽的结构式如下：
；
其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将凝结芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；
（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到MRS液体培养基中，在150r/min，37℃条件下，摇床培养12～16小时，得种子液；
（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到MRS液体培养基中，种子液的体积为MRS液体培养基体积的4～6%，在150r/min，37℃条件下，摇床培养48～72小时得发酵液；
（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液旋蒸浓缩至原来体积的1/4后离心，取上清液用乙醇沉淀，过滤并继续将滤液浓缩至原来体积的1/4，然后用乙酸乙酯萃取，将水相用正丁醇进行再次萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩获得粗提物；
（5）硅胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物用甲醇溶解，然后硅胶拌样后装柱，固定相为80-100目的硅胶，以二氯甲烷：甲醇体积比=50:1～1:1梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，收集二氯甲烷-甲醇的体积比为20:1的流份；
（6）将步骤（5）得到的流份采用重结晶法纯化得环(脯-甘)二肽。
2.如权利要求1所述的从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，其特征在于，所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、琼脂15.0g/L，吐温-801.0mL/L，pH6.0。
3.如权利要求1所述的从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，其特征在于，所述MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二胺2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温-801.0mL/L，pH6.0。
4.如权利要求1所述的从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，其特征在于，所述步骤（4）中发酵液旋蒸浓缩后离心的工艺条件为：离心条件为温度4℃，转速为5000rpm，离心时间20min。
5.如权利要求1所述的从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，其特征在于，所述步骤（4）上清液用乙醇沉淀的具体操作为：向上清液中加入等体积的95%的乙醇。
6.如权利要求1所述的从凝结芽孢杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，其特征在于，所述步骤（4）中浓缩后滤液用乙酸乙酯萃取的具体操作是：将浓缩后滤液与乙酸乙酯按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2~3次，每次静置20～30min，得到水相；乙酸乙酯萃取得到水相用正丁醇萃取的具体操作是：水相与正丁醇按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2~3次，每次静置20～30min，得到正丁醇萃取液。
7.如权利要求1所述的从芽孢乳酸杆菌中提取环(脯-甘)二肽的方法，其特征在于，所述步骤（6）中将步骤（5）得到的流份采用重结晶法纯化的具体操作为：将步骤（5）得到的流份旋蒸浓缩除去二氯甲烷和甲醇，干燥，在50℃下加入二氯甲烷:甲醇=1:1的二氯甲烷-甲醇溶剂溶解，然后4℃下冷凝12~24h，过滤，干燥，用甲醇洗涤，将甲醇洗涤后的固体加入二氯甲烷:甲醇=1:1的二氯甲烷-甲醇溶解，然后4℃下冷凝12~24h，过滤，干燥，得环(脯-甘)二肽。
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