CN105586372A

CN105586372A - 一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法

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Publication number: CN105586372A
Application number: CN201510656513.2A
Authority: CN
Inventors: 邓振山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-10-13
Filing date: 2015-10-13
Publication date: 2016-05-18

Abstract

本发明公开了一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法，利用胞外多聚物鞘氨醇单胞菌（<i>Sphingomonas</i><i>？sanxanigenens</i>）菌株发酵制备，具体为：（1）菌种活化；（2）制备种子液；（3）发酵；（4）槲皮素的精制，将上述槲皮素组分经过离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥后得到高纯度的槲皮素。本发明开创了利用微生物发酵方法制备槲皮素的规模化生产新途径；本发明利用葡萄糖为原料，通过微生物发酵技术制备槲皮素，发酵液组分简单，产物存在于发酵液中，杂质少，易于纯化；此方法具有工艺简单，成本低，不发生结构异化，完整地保持了槲皮素有效成分的原有化学结构和优良药效易于操作等优点，适合于工业化生产。

Description

一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法

技术领域

本发明涉及一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法。

背景技术

槲皮素(Quercetin)，又名栎精，槲皮黄素，Meletin,Sophretin，槲皮素化学名为3,3′,4,5,7-五羟基黄酮，化学分子式为C15H10O7，相对分子质量为302.24。槲皮素及其衍生物广泛分布于多种植物的叶、花、果实中，多以苷的形式存在，是植物界分布最广的黄酮类化合物，具有多种生物活性和很高的药用价值，也是人类饮食中最主要的生物类黄酮之一。其二水合物为黄色针状结晶（稀乙醇），在95-97°C成为无水物，熔点314°C（分解）。能溶于冷乙醇（1:290），易溶于热乙醇（1:23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等，溶于冰醋酸及碱性水溶液显黄色等，几乎不溶于水，乙醇溶液味苦。其存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在，如芦丁（芸香甙），槲皮甙，金丝桃甙等植物中含量较高。其英文名“Quercetin”最早出现在1857年，其来源于“Quercetin”，意为栎树林，是一种天然的生长素极性运输抑制剂。

槲皮素不仅在自然界中广泛分布，其药理作用也很广泛，它具有抗氧化及清除自由基的作用，还具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降压、免疫调节及心血管保护作用等，且具有延缓白内障发生发展的作用。槲皮素可通过作用于蛋白激酶和脂质激酶信号通路等方式，发挥调节作用。槲皮素的抗氧化作用与分子结构中B环和位点3的酚羟基基团有关。

槲皮素具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用，用于治疗慢性支气管炎，对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。槲皮素能显著抑制促癌剂的作用、抑制离体恶性细胞的生长、抑制艾氏腹水癌细胞DNA、RNA和蛋白质合成。槲皮素有抑制血小板聚集和5-羟色胺（5-HT）的释放作用。槲皮素对ADP、凝血酶和血小板活化因子（PAF）诱导的血小板聚集均有明显抑制作用，其中对PAF的抑制作用最强，槲皮素也能明显抑制凝血酶诱导的兔血小板3H-5-HT释放。

槲皮素不溶于水，故导入亲水性基团增加溶解性，便于吸收，从而增强其药理作用。合成的槲皮素氧乙酸赖氨酸盐，水溶性增加。经临床试验证明，用于治疗出血性疾病、循环障碍、动脉粥样硬化等具有较高疗效。

槲皮素也可以用于其它行业，作为抗氧化剂，主要用于油脂、饮料、冷饮和肉类加工制剂等。

工业上目前传统的制备槲皮素的方法主要是先通过豆科植物槐(SophoraflavescensAit.)的干燥花蕾提取芦丁，再通过酶水解法、微波水解法、高压水解法和酸水解法以及报道有催化剂法等来水解芦丁得到槲皮素，而且酶水解法和催化剂法目前还无法工业化生产，仅限于理论。用现有技术制备获得槲皮素的工艺复杂，成本高，易生结构异化，如何才能有效地解决上述现有技术的缺陷，开发研究出一种具有产业化前景、生产工艺简单、经济效益良好、无二次污染等特点的绿色、环境友好型的全新槲皮素生产和制备技术是一个亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种全新的槲皮素制备方法，即利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法，该方法采用微生物发酵方法制备槲皮素，与传统的通过豆科植物槐(SophoraflavescensAit.)的干燥花蕾提取的方法相比，工艺简单，成本低，不发生结构异化，完整地保持了槲皮素有效成分的原有化学结构和优良药效；采用微生物发酵法制备槲皮素，微生物培养所用的营养基质是工业生产的副产物，既可以使废弃物得到有效利用，又能带来较大的经济效益；反应快捷、产物污染小、途径新，目前尚未有利用微生物发酵的方法来制备槲皮素的报道。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种利用微生物发酵的方法制备槲皮素的方法，包括如下步骤：

一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法，其特征在于：所述微生物为胞外多聚物鞘氨醇单胞菌，所述胞外多聚物鞘氨醇单胞菌（Sphingomonassanxanigenens）已于2010年4月22日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.1.6417，

生产槲皮素的步骤如下：

（1）菌株活化

将菌株由斜面转接到固体培养基中培养；

（2）制备种子液

取步骤（1）中经活化后的菌株接种到种子培养基中培养；

（3）发酵

将步骤（2）中种子液按体积分数2%~4%的接种量接入到装有培养基的发酵罐中发酵，装料系数0.75，温度28~31°C，pH7.0~7.2，保持溶氧饱和度12%以上，培养5d，收集发酵液；

（4）槲皮素的精制

将步骤（4）中的槲皮素发酵液组分经过离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥后得到精制的槲皮素。

上述步骤（1）中，固体培养基质量组成为：1%葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%NH₄NO₃，0.5%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄，1.5%琼脂，其余为水。

上述步骤（2）中，种子培养基质量组成为：1%葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%NH₄NO₃，0.5%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄，其余为水。

上述步骤（3）中，培养基质量组成为：6%葡萄糖，0.06%NH₄NO₃，0.5%KH₂PO4，0.01%MgSO4，其余为水。

上述步骤（3）中，通气量V:V比0.7-0.9:1，搅拌速度180-190r/min。

本发明中，离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥属于现有技术，本领域技术人员可以根据产物需要合理选择；本发明优选将发酵液收集后，将槲皮素发酵液组分经过离心分为菌体和发酵液两部分，过滤得到的菌体采用体积分数60%乙醇，210W超声浸提，过滤、收集浸提液，再经真空抽滤，合并过滤的发酵液和浸提液，减压浓缩去除乙醇；用乙酸乙酯萃取，浓缩后于4°C保存备用；取乙酸乙酯萃取物加甲醇使之溶解，上硅胶柱，用体积比为9.6:0.4比例的氯仿/甲醇洗脱，收集洗脱产物再用SephadexLH-20，以甲醇作为流动相洗脱，进行进一步纯化并结晶。

本发明槲皮素的测定方法：HPLC分析的检测条件为:ShimadzuODSC18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)，柱温28°C，流动相为甲醇:0.4%磷酸溶液(V:V)=50:50,进样量10μL，流速0.8mL/min，检测波长360nm。

本发明的优点与积极效果：开创了利用微生物发酵方法制备槲皮素的规模化生产新途径；本发明优化了槲皮素的分离纯化技术与工艺参数，建立了一套下游加工方法，此方法具有工艺简单，成本低，不发生结构异化，完整地保持了槲皮素有效成分的原有化学结构和优良药效易于操作等优点；同时具有生产周期短，不受气候和地理环境条件的限制，易于提取和应用面广等特性，适合于工业化生产。本发明利用葡萄糖为原料，通过微生物发酵技术制备槲皮素，发酵液组分简单，产物存在于发酵液中，杂质少，易于纯化，制备得到的槲皮素与槲皮素标准品一致。

附图说明

图1槲皮素对照品与微生物发酵液高效液相色谱比较图。图注：上图是槲皮素标准品，下图是微生物发酵液；

图2质谱和核磁对微生物发酵液精制样品所含组分分析的结构式。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

（1）菌种活化

将在4°C下保存菌株由斜面转接到固体培养基中，30°C下，在恒温培养箱培养12~20h。其中培养基的组成为：1%葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%NH₄NO₃，0.5%KH₂PO4，0.01%MgSO₄，1.5%琼脂，其余为水。pH7.0~7.2，115°C灭菌25min；

（2）制备种子液

取上述经活化后的菌种，接种到种子培养基中(装液量100mL/500mL三角瓶)，摇床转速180r/min，30°C震荡培养12~20h。其中种子培养基的组成为：1%葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%NH4NO3，0.5%KH2PO4，0.01%MgSO4，其余为水。pH7.0~7.2，115°C灭菌25min；

（3）发酵

将上述种子液按2%~4%（体积分数）的接种量接入到装有培养基的发酵罐中发酵，装料系数0.75，控制温度28~31°C，pH7.0~7.2，保持溶氧饱和度12%以上，培养5d，收集发酵液。其中培养基的组成为：4%~6%葡萄糖，0.06%NH4NO3，0.5%KH2PO4，0.01%MgSO4，其余为水。pH7.0~7.2，115°C灭菌25min。发酵温度28~31°C，通气量0.7-0.9:1(V:V)，搅拌速度180-190r/min，pH7.0~7.2；

（4）槲皮素的精制

将发酵液收集后，经4000r/min高速离心15min，分为菌体和发酵液两部分，过滤得到的菌体采用体积分数60%乙醇，210W超声浸提30min，过滤、收集浸提液，再经真空抽滤，

合并过滤的发酵液和浸提液，50°C减压浓缩，去除乙醇。用乙酸乙酯萃取，浓缩后于4°C冰箱保存备用。取上述乙酸乙酯萃取物，加少许甲醇使之溶解，上硅胶柱（5innerdiameter×130cm)，用体积比为9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脱，并收集洗脱产物再用SephadexLH-20，以甲醇作为流动相洗脱，进行进一步纯化并结晶。

附图1槲皮素对照品与微生物发酵液高效液相色谱比较图。由发酵产物的HPLC图谱显示，槲皮素对照品出峰顺序依次为：组分A在保留时间Rt=9.698min，组分B在保留时间Rt=17.348min各有一主要吸收峰，微生物菌株的发酵产物的出峰顺序依次为：组分a在保留时间Rt=1.494min，出现新的吸收峰，组分b在保留时间Rt=9.918min处有一主要吸收峰，可以看出，组分b与组分A的保留时间相近，由此可以确定微生物菌株发酵液制备得到的物质与槲皮素标准品结构一致。

附图2经质谱和核磁对微生物发酵液精制样品所含组分分析的结构式图。通过分析可以证明本发明制备的产品为高纯度槲皮素。

上面对本发明提供的利用微生物发酵方法制备槲皮素的方法进行了详细的叙述，应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法，其特征在于：所述微生物为胞外多聚物鞘氨醇单胞菌，所述胞外多聚物鞘氨醇单胞菌（Sphingomonassanxanigenens）已于2010年4月22日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.1.6417，

利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法步骤如下：

（1）菌株活化

将菌株由斜面转接到固体培养基中培养；

（2）制备种子液

取步骤（1）中经活化后的菌株接种到种子培养基中培养；

（3）发酵

（4）槲皮素的精制

将步骤（3）中的槲皮素发酵液组分经过离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥后得到精制的槲皮素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，固体培养基质量组成为：1%葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%NH₄NO₃，0.5%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄，1.5%琼脂，其余为水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，种子培养基质量组成为：1%葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06%NH₄NO₃，0.5%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄，其余为水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，培养基质量组成为：6%葡萄糖，0.06%NH₄NO₃，0.5%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄，其余为水。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，通气量体积比0.7-0.9:1，搅拌速度180-190r/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，将槲皮素发酵液组分经过离心分为菌体和发酵液两部分，过滤得到的菌体采用体积分数60%乙醇，210W超声浸提，过滤、收集浸提液，再经真空抽滤，合并过滤的发酵液和浸提液，减压浓缩去除乙醇；用乙酸乙酯萃取，浓缩后于4°C保存备用；取乙酸乙酯萃取物加甲醇使之溶解，上硅胶柱，用体积比为9.6:0.4比例的氯仿/甲醇洗脱，收集洗脱产物再用SephadexLH-20，以甲醇作为流动相洗脱，进行进一步纯化并结晶。