CN1483825A

CN1483825A - 酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法

Info

Publication number: CN1483825A
Application number: CNA031336361A
Authority: CN
Inventors: 鱼红闪; 金凤燮
Original assignee: Individual
Current assignee: Sunflower Pharmaceutical Group Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co ltd
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2004-03-24
Anticipated expiration: 2023-08-01
Also published as: CN1261585C

Abstract

本发明公开一种酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，是用能水解芦丁的鼠李糖或葡萄糖基的酶，水解芦丁糖基，制备异槲皮素和槲皮素。包括如下步骤：取能水解芦丁糖基的酶；将酶、芦丁、缓冲液及乙醇混合反应2－24小时，反应条件为温度15－70℃、pH值4－8，芦丁浓度为0.1－10％，乙醇浓度为0－35％；提取异槲皮素和槲皮素。利用自然界植物中广泛且大量存在的芦丁，采用酶法水解其上的部分或全部糖基，进而大量制备植物中含量较少的异槲皮素和槲皮素单体，操作简单安全，整个过程经济实用，产出量大，适合工业化生产，并且产物纯度大于90％，可以满足食品和临床应用。

Description

酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法

技术领域：

本发明涉及一种制备异槲皮素和槲皮素的方法，尤其是一种用酶水解芦丁上的糖基制备异槲皮素和槲皮素的方法。

背景技术：

芦丁是一种黄酮类化合物，其在自然界植物中的分布非常广泛，在很多植物的根、茎、叶、花、果实、种子中都有存在。一些常用中药，如槐米、芸香、荞麦、沙棘、银杏、枸杞、益母草、柴胡、夏枯草、芦荟、桉树叶和烟叶等多种植物中都含有芦丁，其中以槐米、荞麦、桉树叶含量最高，较高的象槐米(系豆科植物槐Sophora japonica L.的花苞)，含量可达20％以上，是我国医药工业提取芦丁的主要原料。

从化学结构上看，芦丁(Rutin)和异槲皮素(Isoquercitrin)的甙元是槲皮素(Quercetin)，槲皮素第3碳上连接一个β-葡萄糖基就是异槲皮素，槲皮素第3碳上连接一个芸香糖，即α-L-鼠李糖基(1→6)β-D-葡萄糖基就是芦丁。

异槲皮素和槲皮素的生理活性远高于芦丁，具有抗氧化、抗病毒，以及增强雌性激素的分泌等性质，因此它们在药物制剂中，常被用作食品添加剂或辅助药物给药。在自然界植物中的分布也很广泛，但是含量却很低。异槲皮素在植物中的含量仅十万分之几到万分之几，槲皮素在植物中的含量也只有千分之几到万分之几，很难提取。

以往异槲皮素和槲皮素都是从天然植物中分离提取，如“从生物类黄酮中回收异槲皮素”(CN1355797A)等方法，这些方法大多采用大量的有机溶剂，并且产率低，成本高，很难实现产业化生产，因此限制了异槲皮素和槲皮素的生产和应用。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术中所存在的技术问题，提供一种酶法水解芦丁上的鼠李糖和葡萄糖基，制备大量异槲皮素和槲皮素的方法。

本发明的技术解决方案是：一种酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，是用能水解芦丁的鼠李糖或葡萄糖基的酶，水解芦丁糖基，制备异槲皮素和槲皮素。

包括如下步骤：

a.取能水解芦丁糖基的酶；

b.将酶、芦丁、缓冲液及乙醇混合反应2-24小时，反应条件为温度15-70℃、PH值4-8，芦丁浓度为0.1-10％，乙醇浓度为0-35％；

c.提取异槲皮素和槲皮素。

所述的a步骤可由微生物发酵制备。

所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。

所述的微生物为细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌。

所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。

所述的缓冲液为磷酸盐或醋酸盐。

所述的c步骤为首先加碱沉淀酶蛋白并过滤除去酶蛋白，在滤液中加入酸沉淀析出沉淀物，并用蒸馏水将沉淀物充分洗至中性，减压干燥，得异槲皮素单体、槲皮素单体或它们的混合物。。

所述的碱为浓度为0.01-10N的NaOH或KOH。

所述的酸为浓度为0.5-4N的HCl或H₂SO₄。

本发明的优点在于：利用自然界植物中广泛且大量存在的芦丁，采用酶法水解其上的部分或全部糖基，进而大量制备植物中含量较少的异槲皮素和槲皮素单体，操作简单安全，整个过程经济实用，产出量大，适合工业化生产，并且产物纯度大于90％，可以满足食品和临床应用。

具体实施方式：

本发明的实施例的反应式如下：

芦丁异槲皮素槲皮素(甙元)

实施例1：

a.以高温好氧菌Bacillus sp.JF(文献1)，在含3％玉米粉、1％产酶诱导物——槐米浸出物(干物)的0.01mol MgSO₄培养基中，在温度为60℃条件下通风培养30-40小时，离心除菌得含酶混合液，加入70％乙醇沉淀酶蛋白，收集蛋白，冻干，得到能水解芦丁α-鼠李糖基的酶。

b.取4克上述酶溶于150毫升pH6的0.02M磷酸盐缓冲液中；取9克芦丁单体与103毫升pH7的0.02M磷酸盐缓冲液和47毫升95％的乙醇混合均匀。上述两种溶液混合，使反应物芦丁的浓度为0.01-10％，乙醇浓度为0-35％，在温度60℃条件下搅拌反应10小时。

c.反应结束后，溶液中加入24克NaOH，过滤除去蛋白沉淀，滤液中加入300ml2N HCl，室温静置1小时，过滤收集沉淀，沉淀物用蒸馏水充分洗至中性，减压干燥沉淀，得到6克产物(经高效液相色谱法(文献2)测定异槲皮素含量在90％以上)。

上述酶经DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献3)分离提纯甙酶蛋白，用SDS电泳方法测定分子量(文献4)，酶蛋白分子量为54000。

实施例2：

a.以曲霉菌(Aspergillus oryzae)在含4％玉米粉、1％产酶诱导物-槐米浸出物(干物)的培养基中，在30℃温度下通风培养30-40小时，除菌，培养液用75％饱和硫酸铵沉淀酶蛋白，收集沉淀，用pH5.8的0.02M醋酸钠缓冲液稀释至培养液的1/5体积，透析，离心除渣，即为酶液。

b.取上述酶液50毫升、10克芦丁单体、5升pH6的0.02M磷酸盐缓冲液和50毫升95％乙醇混合均匀，使反应物芦丁的浓度为0.01-10％，乙醇浓度为0-35％，在温度70℃温度下搅拌反应2小时。

c.反应结束后，溶液中加入24克NaOH，过滤除去蛋白沉淀，滤液中加入300ml 2N HCl，室温静置1小时，过滤收集沉淀，沉淀物用蒸馏水充分洗至中性，减压干燥沉淀，得到7克产物(经高效液相色谱法(文献2)测定异槲皮素含量在90％以上)。

上述酶经DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献3)分离提纯甙酶蛋白，用SDS电泳方法测定分子量(文献4)，酶蛋白

分子量为62000。

实施例3：

a.以黑曲霉菌(Aspergillus niger)在含4％麦芽浸出物和0.5％人参浸出物的培养基中，30℃温度下通风培养30-40小时，培养后除菌，培养液用80％饱和硫酸铵沉淀酶蛋白，收集沉淀，用pH5.8的0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析除去硫酸铵，离心除渣，冻干，即得酶。

b.取7克上述酶溶于200毫升pH5.8的0.02M醋酸钠缓冲液中；取12克市售的商品芦丁单体与115毫升pH5.8的0.02M醋酸钠缓冲液缓冲液和85毫升95％乙醇混合均匀，使反应物芦丁的浓度为0.01-10％，乙醇浓度为0-35％，在温度15℃温度下搅拌反应24小时。

c.溶液中加入36克NaOH，过滤除去蛋白沉淀，滤液中加入400ml 2.5N HCl，室温静置30分钟，过滤收集沉淀，沉淀物用蒸馏水充分洗至中性，减压干燥沉淀，得到6克产物(经高效液相色谱法(文献2)测定槲皮素含量在90％以上)。

上述酶经DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献3)分离提纯得到两种甙酶蛋白，用SDS电泳方法测定分子量(文献4)，其酶蛋白分子量分别为58000和68000。分子量为58000的酶蛋白，水解芦丁的鼠李糖基，变成异槲皮素；分子量为68000的酶蛋白，水解异槲皮素的葡萄糖基，变成槲皮素。

实施例4：

a.罗伦隐球酵母菌(Cryptococcus laurentii)在含10％槐花的麦麸培养基中(培养基干物1000克)，27℃温度下固体培养40-50小时，培养后培养基干物中加入5000毫升生理盐水，浸泡一小时，离心取上清(含酶混合液)，加入85％饱和硫酸铵沉淀酶蛋白，收集沉淀，用1000毫升的pH6.5的0.02M磷酸盐缓冲液溶解，透析除去硫酸铵，离心除渣，即得1000毫升左右的酶液。

b.取上述酶液150毫升；取10克市售的商品芦丁单体与100毫升pH6.5的0.02M磷酸盐缓冲液和50毫升95％乙醇混合均匀。上述两种溶液混合，使反应物芦丁的浓度为0.01-10％，乙醇浓度为0-35％，在温度30℃温度下搅拌反应16小时。

c.溶液中加入26克NaOH，过滤除去蛋白沉淀，滤液中加入300ml 2N HCl，室温静置1小时，过滤收集沉淀，沉淀物用蒸馏水充分洗至中性，减压干燥沉淀，得到6克产物(经高效液相色谱法(文献2)测定含有约55％的异槲皮素和45％的槲皮素)。

实施例5：

a.用草地蘑菇菌(Agaricus pratensis)在含5％人参的麦麸培养基中(培养基干物1000克)，32℃温度下固体培养3-4天，培养后培养基干物中加入6000毫升生理盐水，浸泡一小时，离心取上清(含酶混合液)，加入75％饱和硫酸铵沉淀酶蛋白，收集沉淀，用1000毫升的pH5的0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析除去硫酸铵，离心除渣，即得1000毫升左右的酶液。

b.取上述酶液200毫升；取10克市售的商品芦丁单体与120毫升pH5的0.02M醋酸钠缓冲液和80毫升95％乙醇混合均匀。上述两种溶液混合，使反应物芦丁的浓度为0.01-10％，乙醇浓度为0-35％，在温度40℃温度下搅拌反应8小时。

d.反应结束后，溶液中加入32克NaOH，过滤除去蛋白沉淀，滤液中加入400ml 2N HCl，室温静置30分钟，过滤收集沉淀，沉淀物用蒸馏水充分洗至中性，减压干燥沉淀，得到6克产物(经高效液相色谱法(文献2)测定含有约40％的异槲皮素和60％的槲皮素)。

按实施例5获得的酶反应产物4克，硅胶柱层析(洗脱液CHCl₃∶CH₃OH∶AcoEt∶H₂O＝6∶2∶2∶0.5)得1.2克异槲皮素和2.2克槲皮素。

实施例所述文献为：

1.Fengxie Jin，et al(金凤燮等)：J.Gen Appl.Bact.，1990，36，415-424.

2.岳建民等：云南植物研究，1994，16(1)，81-84。

3.Hongshan Yu，et al(鱼红山等)：Chem.Pharm.Bull.，50(2)，175-178.

4.张龙翔等：升华实验方法和技术，高等教育出版社，1997，p100-111。

Claims

1.一种酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：用能水解芦丁的鼠李糖或葡萄糖基的酶，水解芦丁糖基，制备异槲皮素和槲皮素。

2.根据要求1所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于包括如下步骤：

a.取能水解芦丁糖基的酶；

c.提取异槲皮素和槲皮素。

3.根据权利要求2所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：所述的a步骤可由微生物发酵制备。

4.根据权利要求3所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。

5.根据权利要求3或4所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：所述的微生物为细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌。

6.根据权利要求3所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。

7.根据权利要求2所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐或醋酸盐。

8.根据权利要求2所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：所述的c步骤为首先加碱沉淀酶蛋白并过滤除去酶蛋白，在滤液中加入酸沉淀析出沉淀物，并用蒸馏水将沉淀物充分洗至中性，减压干燥，得异槲皮素单体、槲皮素单体或它们的混合物。。

9.根据权利要求8所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：所述的碱为浓度为0.01-10N的NaOH或KOH。

10.根据权利要求8或9所述的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，其特征在于：所述的酸为浓度为0.5-4N的HCl或H₂SO₄。