CN105671101A - 一种利用微生物制作槲皮素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明主要属于植物提取领域，具体涉及一种槲皮素的制备方法。所述方法以芦丁为原料，经过酶解以及除酶步骤，获得第一批次槲皮素粗提液，将所述第一批次槲皮素粗提液进行酸解，获得第二批次槲皮素粗提液并对其进行精制提纯，获得纯度高于95%的槲皮素。本发明的方法结合酶解以及酸解的方法岁芦丁进行水解，提高了槲皮素的得率，同时降低了生产成本，并且本发明提供精制提纯方法，能够保证获得的槲皮素纯度高于95%。

Description

一种利用微生物制作槲皮素的方法
技术领域
本发明主要属于植物提取领域，具体涉及一种槲皮素的制备方法。
背景技术
槲皮素。又名栎精，槲皮黄素，其二水合物为黄色针状结晶，在95～97℃成为无水物，熔点314℃。可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，几乎不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等。槲皮素为二水合物，结构式如下：
经研究表明：槲皮素的药用效果明显，如对缺血再灌性心律失常有保护作用；降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脂性、降血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等作用；槲皮素能络合或捕获自由基防止机体脂质过氧化反应；在抗菌抗病毒、抗炎、防治糖尿病并发症方面也有较强的药理作用；还具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。
槲皮素是一种天然的黄酮醇类化合物，存在于多种植物的花、叶和果实中。如存在于洋葱、辣椒、胡椒、花菜、小茴香、甘蓝、菠菜、可可豆、杏、苹果、葡萄、银杏、山楂等食用蔬菜和水果中；烟叶、茶叶、荞麦、红酒等中也含有槲皮素；许多中草药如槐米、金荞麦、紫花杜鹃、小叶枇杷、鱼腥草、照山白、银杏叶、红花、金银花、沙棘、菟丝子、高良姜、连翘、番石榴叶、地锦草、满山红、三七、柴胡、蒲公英等都含有槲皮素。
目前，通过水解法制备槲皮素的方法包括酶解法，酸水解法以及催化剂法，其中，酸解法生产成本低，工艺简单，容易操作；但是，生产时都需要使用大量的酸，产生的酸性废液，后处理成本高，处理较困难，对环境污染严重。酶解法和催化剂法不会产生环境污染问题，但是，目前还无法工业化生产。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种利用微生物制作槲皮素的方法，所述方法首先诱导微生物黑曲霉发酵产酶，并利用黑曲霉产生的酶进行酶解反应，以降解获得芦丁的一部分槲皮素；同时由于生产原料芦丁成本较高，为进一步提高得率，本发明对酶解后获得的第一批次槲皮素粗提液进行酸解，从而提高了得率；并本发明提供的方法包括了精制提纯步骤，以保证获得的槲皮素纯度高于95％。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用微生物制作槲皮素的方法，所述方法以芦丁为原料，经过酶解以及除酶步骤，获得第一批次槲皮素粗提液，将所述第一批次槲皮素粗提液进行酸解，获得第二批次槲皮素粗提液然后进行精制提纯，获得纯度高于95％的槲皮素。
进一步地，所述酶解步骤中所使用的酶的制备方法为：以连翘浸出物为产酶诱导物，以诱导黑曲霉菌发酵产酶，通过盐析法分离纯化以获得所述酶。
进一步地，所述酶解步骤具体为：将pH为5.5-6.0的醋酸缓冲溶液与体积分数为95％的乙醇溶液按照体积比2:3进行混合，获得混合溶液，往所述混合溶液中添加芦丁以及制备获得的所述酶，控制芦丁质量浓度为0.05-8％，酶的质量浓度为3-5％。
进一步地，所述酶解步骤的条件为：酶解温度15-20摄氏度；酶解时间12-24h。
进一步地，所述除酶步骤具体为：往酶解后的酶解液中按照添加氢氧化钠以使酶沉淀，控制氢氧化钠质量浓度为15-20％，过滤，收集滤液，即获得所述第一批次槲皮素粗提液。
进一步地，所述酸解步骤具体为：将所述第一批次槲皮素粗提液与pH为1-3的盐酸溶液按照体积比1:2-3进行混合，加热至沸腾，并保持沸腾状态3-4h，完成酸解，获得第二批次槲皮素粗提液。
进一步地，，所述精制提纯的步骤具体为：将所述第二批次槲皮素粗提液进行过滤，将过滤后的滤饼用水洗涤至少4次直至洗出液pH7-8，得到槲皮素粗制品，将所述槲皮素粗制品加入到甲醇溶液中，加热并搅拌直至完全溶解，加热温度为40-60℃，然后过滤，收集滤液；将滤液与水按照体积比1:10-30进行混合，对混合液进行加热回流，加热温度为40-60℃，获得结晶物，将结晶物进行真空干燥，获得纯度高于95％的槲皮素。
本发明的有益技术效果：
(1)本发明提供的制作槲皮素的方法主要结合了酶解以及酸解的方法，以保证原料芦丁被充分水解产生槲皮素，提高了槲皮素的得率；
(2)本发明对酸解条件进行严格控制，在保证芦丁充分水解的基础上，降低盐酸溶液的使用量，从而减少产生盐酸溶液，减轻环境污染。
(3)本发明提供的方法包括了精制提纯步骤，以保证获得的槲皮素纯度高于95％。
附图说明
图1为本发明一种利用微生物制作槲皮素的方法的步骤流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
实施例1
一种利用微生物制作槲皮素的方法，所述方法以芦丁为原料，经过酶解以及除酶步骤，获得第一批次槲皮素粗提液，将所述第一批次槲皮素粗提液进行酸解，获得第二批次槲皮素粗提液并对其进行精制提纯，获得纯度高于95％的槲皮素。
所述方法具体为：
(1)酶的制备：以连翘浸出物为产酶诱导物，以诱导黑曲霉菌发酵产酶，将获得的培养液通过盐析法分离纯化，获得所述酶解步骤中所使用的酶。其中，往黑曲霉培养基中添加的连翘浸出物的量为3％(体积分数)，所述黑曲霉培养基为PDA培养基，所述盐析法对酶进行分离纯化具体为：首先将培养基离心获取离心上清液，往所述离心上清液中添加饱和硫酸铵溶液沉淀酶蛋白，收集沉淀，经透析、离心，即获得酶液，冷冻干燥，获得固体酶；
(2)酶解：将pH为5.5-6.0的醋酸缓冲溶液与体积分数为95％的乙醇溶液按照体积比2:3进行混合，获得混合溶液，往所述混合溶液中添加芦丁以及制备获得的所述酶，控制芦丁质量浓度为0.05-8％，酶的质量浓度为3-5％；所述酶解步骤的条件为：酶解温度15-20摄氏度；酶解时间12-24h；
(3)除酶：往酶解后的酶解液中按照添加氢氧化钠以使酶沉淀，控制氢氧化钠质量浓度为15-20％，过滤，收集滤液，即获得所述第一批次槲皮素粗提液；
(4)酸解：将所述第一批次槲皮素粗提液与pH为1-3的盐酸溶液按照体积比1:2-3进行混合，加热至沸腾，并保持沸腾状态3-4h，完成酸解，获得第二批次槲皮素粗提液；本发明所提供酸解条件使经过多次实验验证获得的，上述酸解条件中盐酸溶液的添加量以及添加体积的确定依据为：在能够保证芦丁充分水解的基础上，降低盐酸溶液的使用量；上述酸解条件的控制可以减少盐酸溶液的使用，从而减轻环境污染。
(5)精制提纯：将所述第二批次槲皮素粗提液进行过滤，将过滤后的滤饼用水洗涤至少4次直至洗出液为中性，得到槲皮素粗制品，将所述槲皮素粗制品加入到甲醇溶液中，加热并搅拌直至完全溶解，加热温度为40-60℃，然后过滤，收集滤液；将滤液与水按照体积比1:10-30进行混合，对混合液进行加热回流，加热温度为40-60℃，获得结晶物，将结晶物进行真空干燥，获得纯度高于95％的槲皮素。
与常规制备槲皮素的方法不同，本发明制备槲皮素的过程中，结合酶解法以及酸水解法，两种方法的结合能够保证原料芦丁被充分水解产生槲皮素，提高了槲皮素的得率，同时极大节约了生产成本，适合工业化的应用。

Claims (7)

1.一种利用微生物制作槲皮素的方法，其特征在于，所述方法以芦丁为原料，经过酶解以及除酶步骤，获得第一批次槲皮素粗提液，将所述第一批次槲皮素粗提液进行酸解，获得第二批次槲皮素粗提液然后进行精制提纯，获得纯度高于95%的槲皮素。
2.根据权利要求1所述一种利用微生物制作槲皮素的方法，其特征在于，所述酶解步骤中所使用的酶的制备方法为：以连翘浸出物为产酶诱导物，以诱导黑曲霉菌发酵产酶，通过盐析法分离纯化以获得所述酶。
3.根据权利要求2所述一种利用微生物制作槲皮素的方法，其特征在于，所述酶解步骤具体为：将pH为5.5-6.0的醋酸缓冲溶液与体积分数为95%的乙醇溶液按照体积比2:3进行混合，获得混合溶液，往所述混合溶液中添加芦丁以及制备获得的所述酶，控制芦丁质量浓度为0.05-8%，酶的质量浓度为3-5%。
4.根据权利要求3所述一种利用微生物制作槲皮素的方法，其特征在于，所述酶解步骤的条件为：酶解温度15-20摄氏度；酶解时间12-24h。
5.根据权利要求1所述一种利用微生物制作槲皮素的方法，其特征在于，所述除酶步骤具体为：往酶解后的酶解液中按照添加氢氧化钠以使酶沉淀，控制氢氧化钠质量浓度为15-20%，过滤，收集滤液，即获得所述第一批次槲皮素粗提液。
6.根据权利要求1所述一种利用微生物制作槲皮素的方法，其特征在于，所述酸解步骤具体为：将所述第一批次槲皮素粗提液与pH为1-3的盐酸溶液按照体积比1:2-3进行混合，加热至沸腾，并保持沸腾状态3-4h，完成酸解，获得第二批次槲皮素粗提液。
7.根据权利要求1所述一种利用微生物制作槲皮素的方法，其特征在于，所述精制提纯的步骤具体为：将所述第二批次槲皮素粗提液进行过滤，将过滤后的滤饼用水洗涤至少4次直至洗出液pH7-8，得到槲皮素粗制品，将所述槲皮素粗制品加入到甲醇溶液中，加热并搅拌直至完全溶解，加热温度为40-60℃，然后过滤，收集滤液；将滤液与水按照体积比1:10-30进行混合，对混合液进行加热回流，加热温度为40-60℃，获得结晶物，将结晶物进行真空干燥，获得纯度高于95%的槲皮素。
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