CN107904220A

CN107904220A - 利用昆虫表达系统生产芦丁水解酶并制备槲皮素的方法

Info

Publication number: CN107904220A
Application number: CN201711199239.6A
Authority: CN
Inventors: 崔晓东; 王转花; 杜程
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2017-11-26
Filing date: 2017-11-26
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2037-11-26
Also published as: CN107904220B

Abstract

本发明公开一种利用昆虫表达系统生产芦丁水解酶并制备槲皮素的方法。本发明利用RT‑PCR方法获得FtRHE基因，与pFastBac Dual载体进行连接，获得重组的pFastBac Dual‑FtRHE质粒，并将该质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，筛选提取重组Bacmid DNA‑FtRHE；将其用脂质体介导法转染昆虫细胞，获得含FtRHE基因的重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染昆虫细胞收集上清，经Ni柱亲和纯化获得芦丁水解酶。所制备的芦丁水解酶可将芦丁专一性的水解为纯度达到98％以上的槲皮素。本发明克服了传统化学法制备槲皮素耗能大，污染大等缺点，符合低碳经济理念，有较为广阔的市场前景。

Description

利用昆虫表达系统生产芦丁水解酶并制备槲皮素的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种来自苦荞麦的以昆虫表达系统表达的芦丁水解酶，以及利用该芦丁水解酶，以芦丁为底物在体外合成槲皮素的方法。

背景技术

黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物。槲皮素是一种多羟基的天然黄酮类化合物，化学名为3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮，广泛存在于多种植物的花、叶和果实中，具有多种生物学活性和较高的药用价值。研究发现，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒作用，能够清除体内自由基、抑制恶性肿瘤生长和转移等功能，此外还具有扩张动脉、改善脑循环和抵抗血小板活化因子、降低毛细血管通透性和脆性等多种生物活性，并且槲皮素具有对人体无毒、无害、无致癌、无致死和无致畸等优点。槲皮素对胃癌，乳腺癌，肝癌，宫颈癌，结肠癌，前列腺癌，胆囊癌都具有抑制生长的作用，并可以诱导恶性肿瘤细胞发生凋亡。槲皮素通过提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，使肿瘤细胞停留在对化疗敏感的细胞周期，降低药物在人体及细胞内的降解速度，提高药物对肿瘤组织的针对性分布及摄取率，并有助于提高正常组织对药物副作用的抵抗力。在美国，槲皮素已经作为一种治疗前列腺癌的非处方药，在任何药店均可购买。

尽管天然槲皮素在自然界分布较为广泛，但在植物体内绝大多数以其糖苷的形式存在，如芦丁、金丝桃甙和槲皮甙。芦丁是槲皮素的主要存在形式之一。芦丁几乎存在于所有的芸香科和石楠科植物中，尤以芸香科植物的芸香草、豆科植物的槐米、蓼科植物的荞麦、金丝桃科植物的红旱莲、鼠李科植物的光枝勾儿茶、大蓟科植物的野梧桐叶等含量较为丰富，可以作为提取芦丁的原料。芦丁能降低毛细血管的通透性、维持血管正常的渗透压，对保持和恢复毛细血管的正常弹性有辅助功能。但是芦丁在抗肿瘤方面几乎没有作用。目前，我国芦丁生产，主要以槐米为原料进行提取，其含量可以占到干重10％～28％之间。

工业上常用芦丁为原料，以化学法及生物转化法来生产槲皮素。传统的化学法制备槲皮素，即先采用碱提取-酸沉淀法制备芦丁然后对芦丁进行重结晶纯化，再通过酸水解除去芸香糖而制得槲皮素。化学法制备槲皮素，耗时长，环境污染大。此外也可以采用微生物来转化芦丁，转化效率不高，并且转化产物为槲皮素和异槲皮素，给产物纯化带来一定难度。此外，也有采用天然提取的荞麦芦丁水解酶以芦丁为底物来制备槲皮素，但是天然的芦丁水解酶制备困难，含量较少，不宜大规模使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自苦荞麦的芦丁水解酶基因，该基因可以在昆虫表达系统中表达，并利用表达的酶来生产槲皮素的方法。

本发明提供的一种芦丁水解酶基因FtRHE，具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，由1539bp组成，编码512个氨基酸，属于β-葡萄糖苷酶家族I成员。

该基因FtRHE通过如下方法获得：

(1)从开花后20天的云南苦荞(云荞1号)幼嫩种子中提取总RNA；

(2)将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物CAAAACCATGGCTACTTTTACATCAATGT和ACATTAGTCATGCATCCATGACTGGATCT进行PCR反应，获得苦荞麦芦丁水解酶FtRHE编码基因；PCR扩增条件为：94℃3分钟；94℃1分钟，57℃30秒，72℃延伸2分钟，共计30个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物与pGEM-T连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，经蓝白筛选后，挑选白色单克隆菌，进行DNA测序，确定FtRHE序列信息。

本发明提供了一种可以在昆虫细胞中进行高效表达的杆状病毒，该杆状病毒含有基因FtRHE，该病毒的构建通过以下技术方案实现，步骤包括：

(1)通过RT-PCR,以FtRHE基因(SEQ ID No.2)为模板，在其5’端添加BamH I酶切位点，酶切位点之后添加编码His标签的序列(便于后续纯化)，3’端添加Not I酶切位点，获得目的序列；其中所使用的上游引物为：

GGATCCATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCCCAACGACCATGGCTACTTTTACATCAATGTCCTTCA，下游引物为：ACATTAGGCGGCCGCTCATTATGCATCCATGACTGGATCT。PCR扩增条件为：94℃3分钟；94℃1分钟，60℃30秒，72℃延伸2分钟，共计30个循环；72℃延伸10分钟。

(2)把目的基因序列经Bam HI和Not I双酶切后与同样经Bam HI和Not I双酶切后的pFastBac Dual载体进行连接，获得重组的pFastBac Dual-FtRHE质粒；

(3)转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞；

(4)经蓝白斑筛选(含卡那霉素；庆大霉素；四环素的固体培养基)，挑取含有重组Bacmid的白色菌落，提取重组Bacmid DNA-FtRHE；

(5)将提取的重组Bacmid DNA，用脂质体介导法转染昆虫细胞，36-48小时后收集上清，获得包含FtRHE基因的重组杆状病毒；

本发明提供了在昆虫表达系统中生产芦丁水解酶的方法，包括以下步骤：

(1)将制备获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞，28℃培养48-72小时，收集上清，10000g离心10分钟，去除细胞碎片等不溶物，得到芦丁水解酶粗品；

(2)按照每4mL上清加200uL 50％Ni-NTA的比例加入Ni-NTA，200rpm振荡1-2h；

(3)静置除去上清液，再加入清洗缓冲液，温柔混匀清洗缓冲液和Ni-NTA,静置弃去上清，重复上述步骤两次；

(4)加入200uL的洗脱缓冲液，温柔混匀洗脱缓冲液和Ni-NTA，静置10分钟，收集上清，重复上述步骤两次，合并三次得到的上清液，得到纯化的芦丁水解酶。

本发明提供了用芦丁水解酶制备槲皮素的方法，具体如下：

(1)反应缓冲液的配置：醋酸铵缓冲液(10mM/L,pH4-5)体积分数为70％-80％，乙醇体积分数为20％-30％；

(2)加入底物芦丁和芦丁水解酶，在37℃水浴保温30min，待室温冷却并析出黄色物质后，4℃静置20分钟，离心，收集沉淀，干燥，得到槲皮素产品。

与现有技术相比本发明的有益效果：本发明获得的苦荞麦芦丁水解酶基因FtRHE,并成功实现其在昆虫细胞的表达，利用重组表达的芦丁水解酶可以将芦丁专一性的水解为活性更强的槲皮素并且纯度达到98％以上。这为槲皮素的制备提供了新的方法，也为植物体内的小分子化合物的次生代谢途径提供一个参考。

附图说明

图1芦丁水解酶FtRHE基因琼脂糖凝胶电泳检测

图2琼脂糖凝胶电泳检测pFastBac Dual-FtRHE质粒的构建及鉴定

图3琼脂糖凝胶电泳检测重组Bacmid DNA-FtRHE

图4SDS-PAGE检测纯化的FtRHE

图5HPLC对芦丁水解酶水解产物槲皮素的检测

具体实施方式

实施例1：芦丁水解酶FtRHE基因获得

将开花后20天的苦荞幼嫩种子(云荞1号)液氮研磨呈粉末状，每100mg粉末加入1mLTrizol，剧烈震荡，混匀。室温放置5min使核蛋白复合物充分溶解，加入0.2mL氯仿。剧烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟。RNA存在于上层水相中，体积约为0.6mL。转移上层水相至新管中，加入0.5mL异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000g离心10分钟。弃上清，沉淀用1mL 75％的乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟。弃上清，干燥，加入40uL的超纯水，得到苦荞麦幼嫩籽粒总RNA。将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物CAAAACCATG GCTACTTTTACATCAATGT和ACATTAGTCATGCATCCATGACTGGATCT进行PCR反应，扩增条件为：94℃3分钟，94℃1分钟，60℃30秒，72℃延伸2分钟，共计30个循环。获得苦荞麦芦丁水解酶FtRHE编码基因。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，分子量大小约为1600bp(如图1)。

实施例2：pFastBac Dual-FtRHE重组质粒的构建及鉴定

以FtRHE基因的PCR产物为模板，引物GGATCCATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCCCAACGACCATGGCTACTTTTACATCAATGTCCTTCA和ACATTAGGCGGCCGCTCATTATGCATCCATGACTGGATCT(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行PCR扩增。PCR条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。扩增得到的PCR产物与pGEM-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选、酶切验证，测序后，保存菌种。将含有目的基因FtRHE的pGEM-T-FtRHE经Bam HI和Not I酶切后与同样经Bam HI和Not I酶切后的pFastBac Dual载体相连。将重组的pFastBac Dual-FtRHE(测序验证正确)质粒转化感受态DH10Bac，涂板于含卡那霉素/庆大霉素/四环素的固体培养基，采用蓝白斑筛选法挑取含有重组Bacmid的白色菌落。摇菌扩大培养后，离心收集菌体，采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒(试剂盒购自上海生工)。用Bac-to-Bac技术手册推荐的引物PUCr正向引物5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’和PUCf反向引物5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’对重组的Bacmid进行PCR验证。(见图2、图3)

实施例3：重组Bacmid-FtRHE的筛选及其杆状病毒的制备

用抗性和蓝白斑初步筛选，由于真核穿梭载体Bacmid上本来就有四环素和庆大霉素，加上DH10Bac菌有卡那霉素抗性，同时具有乳糖操纵子的结构，所以用Tet/Gen/Kana/LB/X-Gal/IPTG平板进行蓝白筛选。选取白色菌落涂布于新的Tet/Gen/Kana/LB/X-Gal/IPTG平板上继续培养，如此筛选3代依然为白色菌落的可视为转座完全。将含有重组克隆的菌液离心得到菌体沉淀，采用质粒抽提试剂盒提取杆粒，经PCR验证等确认重组杆粒中含有目的基因FtRHE。此时即可提取杆粒转染昆虫细胞，生产重组杆状病毒。首先Sf9细胞处于对数期(1.5–2.5×10⁶个细胞/mL)，且存活率高于95％，且培养物中无抗生素，则继续进行在每孔中加入200μL不含添加剂的昆虫细胞培养基(无抗生素和血清)。六孔板每孔中接种8×10⁵个上述的Sf9细胞。残留的培养基将提升转染效率。在培养箱使细胞在27℃下贴壁4小时。对于每种转染样本，取8μL TurboFect转染试剂稀释于100μL不含添加剂的昆虫培养基中(无抗生素或血清)，短暂涡旋混匀。取3μL杆状病毒DNA稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中(无抗生素或血清)，轻轻混匀。将稀释后的DNA与稀释的TurboFect转染试剂混合。轻轻混匀并在室温下孵育20分钟。逐滴加上述DNA-脂质体混合物到已贴壁的细胞中。28℃下孵育细胞3–5小时后加入600μL完全培养基(可以选择使用抗生素)。27℃下孵育细胞72小时，直至观察到绿色荧光(pFastBac Dual载体由本实验室插入一个EGFP荧光基因)。

实施例4：芦丁水解酶的表达及SDS-PAGE分析

将构建的杆状质粒转染Sf9细胞，72小时细胞出现绿色荧光以后收集杆状第一代病毒，即为第一代病毒P1，4℃避光保存。取处于对数生长期同时细胞活力超过95％的昆虫Sf9细胞接种于6孔细胞板中，每孔1mL(1.5–2.5×10⁶个细胞/mL)。28℃无菌静置使细胞贴壁，每孔加入0.5mL一代病毒，28℃静置培养直至出现荧光，大概48-72小时，收集二代病毒，4℃避光保存。同样的方法扩增得到三代病毒，三代病毒的病毒滴定度可以用于昆虫细胞的蛋白表达。三代病毒通过SDS-PAGE(10％的分离胶)分析结果表明目的蛋白FtRHE大量表达。收集三代病毒上清，1000g离心去除细胞碎片等，得到重组荞麦芦丁水解酶粗品；按照每4mL上清加200uL 50％Ni-NTA的比例加入Ni-NTA,200rpm振荡1h；静置除去上清液，再加入清洗缓冲液，温柔混匀清洗缓冲液和Ni-NTA,静置弃去上清，重复上述步骤两次；加入100uL的洗脱缓冲液，温柔混匀洗脱缓冲液和Ni-NTA，收集上清，重复上述步骤两次，合并三次得到的上清液，得到纯化的芦丁水解酶(见图4)。

实施例5：芦丁水解酶水解底物芦丁制备槲皮素

醋酸铵缓冲液(20mM/L,pH5)700uL，加入芦丁溶液200uL(10mg/mL,溶于乙醇溶液)和纯化芦丁水解酶100uL(10ug)，对照加100uL水，在37℃水浴保温30分钟，反应体系颜色加深，有沉淀析出。这时芦丁水解酶水解芦丁的颜色反应以及产生的槲皮素不溶于水而产生沉淀，沉淀即为槲皮素。反应前和反应后均将反应体系通过高效液相色谱，标品也通过高效液相检测，流动相为甲醇-0.4％磷酸(50：50)，流速1mL/min，检测波长254nm，Venusil XBPC18(L)柱购自Agela Technologies公司。经鉴定，生产的重组的芦丁水解酶可以将芦丁特异性地水解为槲皮素(见图5)。

序列表

<110> 山西大学

<120> 利用昆虫表达系统生产芦丁水解酶并制备槲皮素的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 512

<212> PRT

<213> 苦荞麦(Fagopyrum tataricum)

<400> 2

Met Ala Thr Phe Thr Ser Met Ser Phe Ile Phe Leu Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ser Phe Leu Ser Phe Ile Ala Pro Leu Val Glu Asp Thr Leu Thr

20 25 30

Arg Asn Ser Phe Pro Glu Gly Phe Val Phe Gly Ala Gly Ser Ala Ala

35 40 45

Tyr Gln Phe Glu Gly Ser Ala Ala Glu Asp Gly Arg Gly Ala Ser Ile

50 55 60

Trp Asp Tyr Phe Thr His Gln Tyr Pro Glu Lys Ile Lys Asp Gly Ser

65 70 75 80

Asn Gly Asp Ala Ala Asn Asp Phe Tyr His Leu Tyr Lys Glu Asp Val

85 90 95

Lys Leu Ala Lys Glu Met Gly Leu Asp Ser Phe Arg Phe Ser Ile Ser

100 105 110

Trp Ser Arg Ile Leu Pro Thr Gly Lys Val Ser Gly Gly Ile Asn Thr

115 120 125

Leu Gly Ile Lys Phe Tyr Ser Asp Leu Ile Asp Glu Leu Ile Asn Asn

130 135 140

Gly Leu Lys Pro Phe Val Thr Leu Phe His Trp Asp Leu Pro Gln Gly

145 150 155 160

Leu Met Asp Gln Tyr Gly Gly Phe Leu Ser Asn Glu Val Val Asp Asp

165 170 175

Phe Gln Asp Tyr Ala Asn Val Val Phe Ala Ala Phe Gly Ser Arg Val

180 185 190

Lys Tyr Trp Thr Thr Leu Asn Glu Pro Asn Leu Ser Ala Glu Phe Gly

195 200 205

Tyr Ser Leu Gly Leu His Ala Pro Gly Arg Cys Ser Asp Tyr Met Arg

210 215 220

Thr Cys Lys Ala Gly Asp Ser Ala Thr Glu Pro Tyr Ile Val Gly His

225 230 235 240

Asn Leu Leu Leu Cys His Ala Ala Val Val Glu Leu Tyr Lys Thr Arg

245 250 255

Tyr Ala Tyr Gln Lys Gly Ile Ile Gly Ile Val Val Ser Thr Asn Met

260 265 270

Val Val Pro Met Asn Asp Thr Leu Ala Asp Arg Leu Ala Thr Arg Arg

275 280 285

Ala Ile Asp Phe Asn Phe Gly Trp Phe Leu Asp Pro Ile Val Tyr Gly

290 295 300

Asp Tyr Pro Thr Thr Met Arg Ser Phe Leu Gly Ser Arg Leu Pro Asn

305 310 315 320

Phe Thr Ala Glu Gln Ser Thr Ser Leu Lys Gln Ser Phe Asp Phe Pro

325 330 335

Gly Leu Asn Tyr Tyr Thr Thr Phe Tyr Ala Ala Asn Ser Cys Ser Tyr

340 345 350

Asn Ser Val Asn Ile Ser Tyr Ser Thr Asp Ser Arg Ala Ile Leu Ser

355 360 365

Ser Tyr Lys Asp Gly Val Ala Ile Gly Glu Ser Thr Pro Ser Ala Trp

370 375 380

Leu Cys Ile Tyr Pro Gln Gly Leu Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Ile Lys

385 390 395 400

Ala Arg Tyr Asn Asn Pro Tyr Ile Phe Ile Thr Glu Asn Gly Met Ala

405 410 415

Gln Lys Ser Asn Gly Ser Leu Ala Asp Asn Pro Thr Ile Leu Gln Asp

420 425 430

Ala Gln Arg Ile Arg Tyr Tyr Asn Glu His Leu His Tyr Leu Leu Glu

435 440 445

Ala Ile Lys Glu Gly Ser Arg Val Gly Gly Tyr Tyr Ala Trp Ser Phe

450 455 460

Leu Asp Asp Phe Glu Trp Gly Ser Gly Tyr Thr Thr Arg Phe Gly Leu

465 470 475 480

Thr Phe Val Asp Phe Asn Thr Asn Leu Lys Arg Tyr Pro Lys Asp Ser

485 490 495

Tyr Tyr Trp Phe Lys Asn Phe Leu Ala Gln Asp Pro Val Met Asp Ala

500 505 510

<210> 2

<211> 1539

<212> DNA

<213> 苦荞麦(Fagopyrum tataricum)

<400> 2

atggctactt ttacatcaat gtccttcatc ttcctccttc tactggtact gtctttcttg 60

agcttcatag ctcctcttgt tgaagatact cttacaagaa atagctttcc tgagggcttt 120

gtatttggtg ctggatctgc tgcttaccag tttgaaggat ctgcagctga agatgggaga 180

ggagcaagca tctgggatta tttcactcat caatatccag aaaagataaa agatggaagc 240

aatggagatg ccgcaaatga tttctatcac ctctacaagg aagatgtaaa attggcaaaa 300

gaaatgggtt tggattcatt cagattttca atatcatggt ccagaatatt gccaacggga 360

aaggtgagtg gcggaatcaa cacattggga atcaagttct acagtgatct cattgacgaa 420

ctaataaaca atggactaaa gccatttgtt actctcttcc attgggactt acctcagggt 480

cttatggacc aatatggtgg attcttgagc aatgaggttg tggacgattt ccaagactac 540

gcaaacgtag tttttgcggc gtttggaagc cgagtgaaat attggacgac attgaacgag 600

cccaatctaa gtgctgagtt cggctattcg ttggggttac atgcacctgg ccgatgctcc 660

gattacatga gaacctgcaa ggctggagac tctgccaccg aaccttacat cgttggtcat 720

aacctccttc tttgtcatgc cgccgtagtt gaactgtaca aaactcgcta tgcttatcaa 780

aagggtataa ttggaatagt tgtttcaaca aatatggtgg tacccatgaa cgacactctt 840

gcggatcgat tggcaacaag acgtgctatt gacttcaact ttggatggtt tcttgatcca 900

attgtgtacg gtgattatcc tacgaccatg agatctttct tgggaagtcg attgcccaac 960

tttacggcgg aacaatcaac atcattaaaa caatcgtttg acttcccagg actcaattac 1020

tatacaactt tttatgcagc caattcttgc tcttacaata gcgtcaacat cagctactcg 1080

accgacagtc gtgcaatatt atcctcgtac aaggacggag ttgctatagg tgaatcgaca 1140

ccttcagcat ggctgtgcat atatccccag ggccttcagt atctattgcg atacatcaaa 1200

gcaaggtaca acaatccata tatcttcatc actgagaatg gcatggctca aaagagcaac 1260

ggttcattag ctgacaaccc gacgattctg caagatgccc agaggattcg atactataac 1320

gaacatctgc actaccttct cgaggcaatc aaagagggat caagagtagg aggatactat 1380

gcttggtctt tccttgacga tttcgagtgg ggttctgggt ataccacaag atttgggctc 1440

acctttgtgg atttcaacac taatttgaag agatatccaa aggattctta ctattggttc 1500

aagaatttcc tcgcccaaga tccagtcatg gatgcatga 1539

Claims

1.一种芦丁水解酶，其特征在于具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的芦丁水解酶的基因FtRHE，其核苷酸序列为SEQ ID No.2。

3.一种可以在昆虫细胞中进行高效表达的杆状病毒，含有权利要求2所述的基因FtRHE。

4.如权利要求3所述的一种可以在昆虫细胞中进行高效表达的杆状病毒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)从开花后20天的苦荞幼嫩种子中提取总RNA；

(2)将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物CAAAACCATGGCTACTTTTACATCAATGT和ACATTAGTCATGCATCCATGACTGGATCT进行RT-PCR反应，获得芦丁水解酶FtRHE基因；

(3)设计新的引物，在上游引物5’端添加BamH I酶切位点，酶切位点之后添加编码His标签序列，下游引物3’端添加Not I酶切位点，以该对引物和步骤2获得的FtRHE基因为模版进行PCR扩增，获得目的基因；其中所使用的上游引物为：

GGATCCATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCCCAACGACCATGGCTACTTTTACATCAATGTCCTTCA，下游引物为：ACATTAGGCGGCCGCTCATTAT

GCATCCATGACTGGATCT；

(4)把目的基因经Bam HI和Not I双酶切后与同样经Bam HI和Not I双酶切后的pFastBac Dual载体进行连接，获得重组的pFastBac Dual-FtRHE质粒；

(5)将步骤4获得的pFastBac Dual-FtRHE质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，经蓝白斑筛选，挑取含有重组Bacmid的白色菌落，提取重组Bacmid DNA；

(6)将提取重组Bacmid DNA，用脂质体介导法转染昆虫细胞，36-48小时后收集上清，获得包含FtRHE基因的重组杆状病毒。

5.一种在昆虫表达系统中生产芦丁水解酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将权利要求3所述的杆状病毒感染昆虫细胞，28℃培养48-72小时，收集上清，10000g离心去除细胞碎片等，得到芦丁水解酶粗品；

(2)按照每4mL上清加200uL 50％Ni-NTA的比例加入Ni-NTA,200rpm振荡1-2h；

6.一种利用芦丁水解酶制备槲皮素的方法，其特征在于步骤如下：

(1)配置浓度10mM/L、pH4-5的醋酸铵缓冲液，其体积分数为70％-80％，乙醇体积分数为20％-30％；

(2)加入底物芦丁和权利要求5所述方法制备的芦丁水解酶，在37℃水浴保温30min，待室温冷却并析出黄色物质后，4℃静置20分钟，离心，收集沉淀，干燥，得到槲皮素产品。