CN105087613A - 黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因及其编码蛋白和应用。本发明公开了一种能高效转化黄酮醇生成黄酮醇7-O-葡萄糖苷的UDP-葡萄糖基转移酶基因。该基因是从茶叶鲜叶中分离获得的，为一种黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶，该基因被UGT糖基转移酶命名法委员会命名为CsUGT75L12。它克隆了一个全长为1826bp的cDNA序列，ORF序列为1536bp，可以编码含512个氨基酸序列的蛋白质肽链。通过构建重组质粒，实现了CsUGT75L12基因在大肠杆菌中的重组表达，并得到纯化的重组蛋白。在体外，重组蛋白可以高效地将黄酮醇化合物转化成黄酮醇7-O-葡萄糖苷化合物，转化率达到85.2％。本发明为实现黄酮醇糖苷类物质商品化生产提供了代谢工程基础。

Description

黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种黄酮醇7位葡萄糖基转移酶基因CsUGT75L12及其编码蛋白和应用。

背景技术

黄酮类化合物是构成茶叶品质及功能成分的特征性物质，是影响茶叶滋味、汤色的重要因素。是自然界普遍存在的一类低分子量的多酚化合物，黄酮类化合物是由苯丙氨盐途径合成，根据黄酮类化合物中心C环的不同修饰，可分为黄酮、黄酮醇、黄烷醇、异黄酮、黄烷酮和花青素等几大类。表1分别列举了一些常见的黄酮、黄酮醇和花青素的化合物及其结构。

黄酮类化合物是药用植物的主要活性成分之一，如抗突变，抗糖尿病，抗菌，消炎，降血压，抗紫外线，控制体重以及帕金斯病的防治等，还有保护肝脏、抑制癌细胞增生、增加血液的抗氧化活性等药效，是新药研发的活性先导物的来源宝库。但是，天然存在的黄酮类化合物往往具有水溶性差、稳定性不好、作用靶点多、选择性较差、药效不好等缺点，给适应性新药的寻找与开发还来了相当大的困难。进而进行化学修饰研究，是新药研制的一条有效途径之一。

经过糖苷化修饰后的黄酮类化合物，以黄酮糖苷的形式存在于植物体内，糖苷化修饰后的化合物，可作为一种活化的中间体参与到其它代谢途径。糖苷化是对黄酮类化合物进行化学修饰的有效途径之一，它可改善黄酮类化合物的水溶性、稳定性、选择性，提高黄酮类化合物的药效。

黄酮醇-7-O葡萄糖基转移酶，是一种依赖于尿苷二磷酸糖(UDPG)的糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs)。它能专一性的催化黄酮类化合物在A环的第7位羟基糖苷化，高效的形成黄酮-7-O葡萄糖苷单糖苷，(图1)。目前C环3位羟基糖苷化已经在茶树，葡萄等植物中被鉴定，在大豆、葛根等植物中也发现异黄酮7-O葡萄糖转移酶的存在，它能够催化异黄酮A环的第7位羟基发生糖苷化，迄今为止，茶树中编码尿苷二磷酸葡萄糖依赖的黄酮醇7-O葡萄糖基转移酶的基因还没有得到验证。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因，通过构建重组工程菌，得到重组蛋白，借助于酶反应方法，利用基因工程菌的重组蛋白作为催化酶，得到转化率为85.2％的高效转化生成山奈酚7-O-葡萄糖苷的反应条件。验证了茶树中编码尿苷二磷酸葡萄糖依赖的黄酮醇7-O葡萄糖基转移酶的基因。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因，该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

优选的，所述黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因应用于黄酮醇第七位羟基发生糖苷化，所述黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因应用于单糖苷生物合成。

一种黄酮醇7-O-葡萄糖基转移CsUGT75L12基因的编码蛋白，所述编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

一种重组质粒，所述重组质粒含有所述黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

一种重组质粒的构建方法，将黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT75L12。

一种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有所述重组质粒，或其基因组中整合有所述的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因核苷酸序列，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

优选的，所述转基因工程菌为含有所述重组质粒的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株，或其基因组中整合有所述的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因核苷酸序列的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株。

一种重组蛋白，所述重组蛋白为含有所述的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因的编码蛋白，具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

优选的，所述重组蛋白作为催化酶，通过建立最适酶反应条件，得到黄酮醇7-O-葡萄糖苷。

优选的，所述最适酶反应条件为：反应体系PH为8.5～9.5，反应温度为30～37℃，反应时间为35～42min，酶加入量为0～25ug。

(三)有益效果

本发明提供了一种黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶基因CsUGT75L12功能，本发明还提供了含有CsUGT75L12基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，提供一种利用工程菌生产黄酮醇-7-O葡萄糖苷的方法。本发明与传统的分离提取、化学合成等方法比较而言，本方法的优点在于原料简单易得，方法简单，生产成本低，试剂用量少，产率高达85.2％等优势。本发明为实现黄酮醇7-O糖苷商品化生产提供了代谢工程基础。

附图说明

图1为黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶的催化流程图与化学结构式，以山奈酚为糖受体，UDP-葡萄糖为糖供体，经过rCsUGT75L12催化生成山奈酚7-O-葡萄糖苷和UDP。

图2为CsUGT75L12重组蛋白(rCsUGT75L12)的SDS-PAGE蛋白电泳分析图；其中，M为蛋白Marker；1为重组质粒诱导前；2为重组质粒诱导后；3为诱导后破碎后上清；4为诱导后破碎后沉淀；5为纯化后蛋白。

图3为HPLC分析rCsUGT75L12催化的酶活产物结果图，其中，图3-A～3-C以UDP-葡萄糖为糖供体，以黄酮醇化合物(山奈酚,芹菜素和柚皮素)作为糖受体的HPLC图谱；

图4为重组CsUGT75L12蛋白催化合成黄酮醇7-O-葡萄糖苷产物的一级质谱和二级质谱分析图谱；其中，图4-A～4-C分别是山奈酚7-O-葡萄糖苷,芹菜素7-O-葡萄糖苷和柚皮素7-O-葡萄糖苷的一级质谱和二级质谱分析图谱；

图5为反应在不同的酶反应条件下的HPLC图谱，A-C分别代表了酶反应的不同条件。

图6为pMal-c2X质粒图谱

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例及实施例附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。其中几种常见的黄酮和黄酮类化合物及结构式如表1所示。

表1几种常见的黄酮和黄酮醇类化合物及结构式

一、材料

1、茶树品种：农抗早(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze.var.sinensiscultivarNongkangzao)，采集茶树鲜叶，迅速用液氮冷冻，储存于-80℃冰箱中备用；

2、pMal-c2X载体，其中pMal-c2X质粒图谱如图6所示；

3、大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌：购于上海北诺生物科技有限公司；

4、LB培养基：称取10g的NaCl，5g的酵母提取物，10g的胰蛋白胨，加入950mL去超纯水搅拌溶解，用1mol/L的NaOH调pH至7.0，加水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌15min，即获得LB液体培养基，LB固体培养基为在LB液体培养基中加入15g的琼脂粉即可；

5、质量比为40％的葡萄糖溶液：称取40g葡萄糖，加入超纯水溶解搅拌均匀，定容至100mL，110℃灭菌10min；

6、氨苄青霉素母液(Amp+，100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素Amp，溶于10mL灭菌水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存；

7、1mol/L的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)：称取2.383gIPTG，溶于灭菌超纯水，定容至10mL，过滤除菌，分装并于-20℃保存；

8、蛋白纯化缓冲液：上柱缓冲液：称取0.37gEDTA，11.67gNaCl，2.42gTris，0.15gDTT于足量纯水中，搅拌使其充分混匀。用稀盐酸调其PH至7.4，定容至1L,即得上柱缓冲液。洗脱缓冲液：1L上柱缓冲液中加入3.60g麦芽糖，溶解搅拌均匀。

9、100mM的pH7.5的Tris-HCL缓冲溶液：称取1.1214gTris加水至90mL搅拌溶解均匀，加稀HCL调pH至7.5，补水定容至100mL；

10、体积比为1％的乙酸：用移液管量取10mL色谱级乙酸溶液于1L容量瓶中，用超纯水定容至1L。

二、CsUGT75L12基因的克隆：

1、设计带有表达载体pMal-c2X载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示：

SEQIDNO：3：正向引物：5’-TCTAGAATGCAAGCGGAGAAAGCTAGGC-3’

SEQIDNO：4：反向引物：5’-CTGCAGCTATAAGCAATCTCCTCCAACC-3’；

2、按照TaKaRaRNAiso试剂盒和RNAisoPlus试剂盒说明书，提取茶树品种农抗早鲜叶RNA，并反转录为cDNA；

3、以反转录产物cDNA为模板，用SEQIDNO：3和SEQIDNO：4引物进行扩增，扩增程序为94℃预变性30s，94℃变性10s，62℃退火20s，72℃延伸50s，30个循环，72℃继续延伸10min，获得的PCR产物置于16℃保存。

4、将PCR产物利用PCR纯化试剂盒纯化，并连接到pMD19-TSimpleVector后进行菌落PCR验证，获得阳性菌落，提取菌落质粒，获得含有CsUGT75L12基因的T载体，同时将菌液送至深圳华大公司进行测序。

三、CsUGT75L12基因的原核表达及功能验证

本实施例中所用到的原核表达和及其功能验证技术手段为本领域的普通技术人员常用或完全可以理解技术手段。

1、将含有CsUGT75L12基因的T载体用XbaⅠ和PstⅠ进行双酶切，酶切产物连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中，获得pMal-c2X-CsUGT75L12重组质粒；

2、将pMal-c2X-CsUGT75L12重组质粒转化到大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌中，接种到100μL的LB液体培养基，37℃，180r/min下培养45～60min；取100μL的菌液涂布于含100μg/mLAmp+的LB平板上，37℃倒置培养；

3、经过菌落PCR验证，挑取阳性菌落，接种至含2g/L的100mL的灭菌的LB液体培养基中，28℃，200r/min下震荡培养，直至OD600≈0.6，获得转基因的工程菌；

4、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃过夜培养，收集菌体，加入10mL上柱缓冲溶液，充分悬浮菌体，置于-20℃过夜，将菌体置于冰上解冻，待解冻后置于超声破碎仪中以15％功率超声破碎10min，12000rpm离心收集上清液；利用直链淀粉树脂亲和柱纯化重组蛋白(affinitychromatographyonanamylaseresin，NewEnglandBiolabs，MA，USA)，利用本领域常用的SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图2所示。

图2中可看出，pMal-c2X-CsUGT75L12重组质粒转化表达宿主菌Novablue(DE3)，诱导表达后(泳道2)与诱导前(泳道1)相比，该基因在诱导后(泳道2)有重组蛋白的表达，且重组蛋白条带的大小与预测的一致，加上42.5kDa麦芽糖结合蛋白(MBP)重组标签后蛋白大小为99kd，所以在SDS-PAGE蛋白电泳分析图的100kd处有明显的重组蛋白条带；诱导后菌体经超声破碎离心后，沉淀中没有看到融合蛋白条带(泳道4)，而上清中有可溶性重组蛋白(泳道3)，说明诱导的重组蛋白表达在上清中，可用于进一步纯化分析；上清蛋白经直链淀粉树脂柱纯化后，得到较纯的重组蛋白(泳道5)，纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。

四、CsUGT75L12重组蛋白的酶学活性检测分析：

1、对类黄酮底物的酶活检测

总反应体系50μL，100mMpH7.5的Tris-HCL缓冲溶液包含5mMUDP-葡萄糖或UDP-半乳糖作为糖基供体，200μM潜在的类黄酮化合物(山奈酚、槲皮素、杨梅素、山奈素、柚皮素、圣草酚、芹菜素、儿茶素和矢车菊色素)作为糖基受体、10-20μg的纯化后的重组蛋白和0.1％的β-巯基乙醇。

所有酶反应体系，在30℃水浴30min后加入等体积的甲醇终止反应，矢车菊为底物的反应体系例外，需加入20μL的5％盐酸终止反应，反应均以空载蛋白作为对照，获得酶反应产物。

2、酶的高效转化率反应条件的检测

在总反应体系为50μL条件下，以山奈酚为糖受体和UDP-葡萄糖为糖供体，分别对酶反应的PH、温度、时间做了梯度检测，通过建立最适反应条件，获得了高效转化生成山奈酚7-O-葡萄糖苷的条件，结果表2所示。

表2不同酶反应件下的转化率

五、产物的鉴定

1、HPLC鉴定

酶反应产物经产物标准品结合HPLC进行鉴定，所述HPLC色谱检测条件如下：日本岛津20AD高效液相色谱仪；色谱柱：菲罗门圣洁兰4u辐深250*4.6mm(PhenomenexSynergi4uFusion250*4.6mm)；检测器：日本岛津SPD6AV可调波长紫外检测器；灵敏度：0.01；检测波长：366nm；流速：1mL/min；进样体积为5μL；流动相A为含1％(v/v)乙酸溶液；流动相B为100％乙腈溶液；对于类黄酮化合物的检测，HPLC梯度程序设置为：0～5min，10～15％B；5～15min，15～40％B；15～20min，40～60％B；20～25min，60～80％B；25～30min，80～10％B；30～32min，stop。

利用HPLC及黄酮醇糖苷标准品分析酶反应产物，结果如图3所示，从图中可发现rCsUGT75L12可特异性的催化黄酮、黄烷酮和黄酮醇底物，对其它类黄酮及酚酸化合物均未检测到任何活性；与标准品比较，还可以发现rCsUGT75L12区域选择性的催化黄酮醇(山奈酚，槲皮素和杨梅素)7-OH上的糖苷化，说明CsUGT75L12具有葡萄糖转移酶功能的活性。

将rCsUGT75L12分别以UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖为糖供体进行比活力比较时，发现rCsUGT75L12只对UDP-葡萄糖为糖供体有活性，由此说明rCsUGT75L12对葡萄糖基转移活性具有很高的专一性。

2、UPLC–MS/MS鉴定

酶反应产物经产物标准品结合UPLC-MS进行鉴定，所述UPLC-MS检测条件如下：维特斯HSST3色谱柱(WatersACQUITYUPLCHSST3，150mm×2.1mm，1.7tzm)；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样体积为5μL；流动相A为含1％(v/v)乙酸溶液；流动相B为100％乙腈溶液；对于类黄酮化合物的检测，UPLC梯度程序设置为：0～5min，10～15％B；5～15min，15～40％B；15～20min，40～60％B；20～25min，60～80％B；25～30min，80～10％B；30～32min，stop。光谱检测波长扫描范围为200～550nm。在化合物的MS定性识别中，采用ESI电喷雾离子源，负离子模式；毛细管电压为3.5kV，离子源温度为350℃，雾化气(氮气)流速为6L/min，化合物检测扫描质荷比范围设置为m/z100～1000，碰撞电压为45V，结果如图4所示。

综上，本发明实施例具有如下有益效果：本发明研究一种能编码尿苷二磷酸葡萄糖依赖的黄酮醇7-O葡萄糖转移酶CsUGT75L12基因，通过构建重组工程菌，得到重组蛋白，提供一种利用工程菌生产黄酮醇7-O葡萄糖苷的方法。本发明与传统的分离提取、化学合成等方法比较而言，本方法的优点在于原料简单易得，方法简单，生产成本低，试剂用量少，得率高达85.2％等优势。本发明为实现黄酮醇7-O糖苷商品化生产提供了代谢工程基础。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

ATGCAAGCGGAGAAAGCTAGGCAGCTCACTTCTAACAACCACAAACAACTCTGTTTTGTACAGAGCAGCCAAACAACACCCAATACCAACCCCACACAAACCTCACACGCCGCCACAATGGTGCAGCACGGCCACATCCTCCTCCTGACTTTTCCGGCACAAGGCCACATCAACCCTTCTCTCCAATTCGCCAAGCGTCTCATTAACATGGGTCTCCAGGTCACCTTCGCCACCAGCGTCTTCGCCCAACGCCGCATCTCCAAAACCACTGGAACCACAGCCAAGGGCTTGAAGTTCGCCGCCTTTTCCGACGGCTACGATGATGGGTTCCAACCAGGAAACGATGTACAACACAAGTTCTCCGAGATCAGAATCAACAGCTCTCTTGCCATCAGAGAAATCATCGCCGCTAGCGCCGCCGAAGGCCGCCCGGTCACCTGCTTGGTCTACACTCTCCTCCTCCCTTGGGCGGCGAAGGTGGCGCGTGATTGTCACATCCCATCAGCTCTTCTCTGGATTCAACCTGCCACAGTTTTAGACATATACTACTATTACTTCAATGGTTATAAAGAGGTGATTACAAAAAATTGCAATGGCAAAGACTCTTCTTCTTCATGTTCAATTGAATTACCAGGATTGCCATTGCTCACTAGCCATGACCTTCCTTCCTTTCTATTCTCTTCAAGCTCAGATATATACAGTTTGTCACTCCCGACCTTCAAAGAGCATATAGAAACACTTGATGCAGAAACAAGCCCCAAAGTTCTTGTAAACACATTCGATGCATTAGAACCCGAGGGCTTGAAAGCTATTGGAAAGTACAATTTGATCGGAATTGGACCCTTAATCCCATCGGTTTTCTTGGATGGGAAAGACCCATCAGACACTTCTTTTAAAGGGGACCTATTTCATGCATCTGGAAACTACATCGAATGGTTGAGCTCGAAGCCCAAATCATCGGTTGTTTACGTGTCTTTTGGAAGCCTATTAGTGTTGCCAATGCCAAAGCGACAAATGGAGGAGATTGGTCGTGGTTTACTGGAAAGTCATAGGCCATTCTTGTGGGTGATGAGAGGAGAAGAAGAAAAAGTAGAAGAAGATAGATTAAGTTGCATTGAAGAATTGAAGCAACAAGGGATGATAGTGCCATGGTGTTCTCAATTAGAAGTTCTTTCGCACCCGTCATTGGGATGTTTTGTGACACATTGTGGTTGGAATTCGACGTTGGAGAGCTTCGCTTCTGGGGTTCCTATGGTGGCGTTTCCTCAATGGACGGACCAATGGACGAATGCGAAGCTGGTGGAAGATGTGTGGAAGACTGGAGTGAGAGTGAGGAGAAATGAAGAAGGAATAGTTGAGGGTGATGAGATTAAGAGGTGCATAGAGATGGTGATGGAAGATGGAGTGAGAGGGGAACAAATGAGGAGGAATGCAAAGAAATGGGGAGATTTGGGAAGGGAAGCTGTCAAGAAAGCTGGGTCCTCCAACAAAAATCTCATGTCTTTTGTGGAGGAGGTTGGAGGAGATTGCTTATAG

SEQIDNO：1

MQAEKARQLTSNNHKQLCFVQSSQTTPNTNPTQTSHAATMVQHGHILLLTFPAQGHINPSLQFAKRLINMGLQVTFATSVFAQRRISKTTGTTAKGLKFAAFSDGYDDGFQPGNDVQHKFSEIRINSSLAIREIIAASAAEGRPVTCLVYTLLLPWAAKVARDCHIPSALLWIQPATVLDIYYYYFNGYKEVITKNCNGKDSSSSCSIELPGLPLLTSHDLPSFLFSSSSDIYSLSLPTFKEHIETLDAETSPKVLVNTFDALEPEGLKAIGKYNLIGIGPLIPSVFLDGKDPSDTSFKGDLFHASGNYIEWLSSKPKSSVVYVSFGSLLVLPMPKRQMEEIGRGLLESHRPFLWVMRGEEEKVEEDRLSCIEELKQQGMIVPWCSQLEVLSHPSLGCFVTHCGWNSTLESFASGVPMVAFPQWTDQWTNAKLVEDVWKTGVRVRRNEEGIVEGDEIKRCIEMVMEDGVRGEQMRRNAKKWGDLGREAVKKAGSSNKNLMSFVEEVGGDCL

SEQIDNO：2

TCTAGAATGCAAGCGGAGAAAGCTAGGC

SEQIDNO：3

CTGCAGCTATAAGCAATCTCCTCCAACC

SEQIDNO：4。

Claims (10)

1.一种黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因，其特征在于，该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因，其特征在于，所述黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因在黄酮醇第七位羟基发生糖苷化，所述黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因应用于单糖苷生物合成。

3.一种如权利要求1或2所述的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移CsUGT75L12基因的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有如权利要求1所述黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因的核苷酸序列。

5.一种如权利要求5所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，将黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT75L12。

6.一种转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌含有如权利要求5所述的重组质粒，或其基因组中整合有外源的如权利要求1所述的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因核苷酸序列。

7.根据权利要求7所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为含有所述重组质粒的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株，或其基因组中整合有所述的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因核苷酸序列的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株。

8.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为含有如权利要求4所述的黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因的编码蛋白，具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求9所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白作为催化酶，通过建立最适酶反应条件，得到黄酮醇7-O-葡萄糖苷。

10.根据权利要求10所述的重组蛋白，其特征在于，所述最适酶反应条件为：反应体系PH为8.5～9.5，反应温度为30～37℃，反应时间为35～42min，酶加入量为0～25ug。