CN116004563A - 一种茶树类黄酮糖基转移酶及其应用 - Google Patents
一种茶树类黄酮糖基转移酶及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种茶树类黄酮糖基转移酶及其应用，涉及分子生物学领域和生物化学分析领域。所述类黄酮糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明基于代谢物与全基因组关联分析的方法，发现当茶树中糖基转移酶CsUGT708C的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示时，其具有高效催化多个类黄酮生成糖基化的代谢物的能力，同时对应在茶树体中芹菜素6,8‑二‑C‑内苷等糖苷化的代谢物含量较高。因此，可以根据茶树中糖基转移酶CsUGT708C的基因型进行茶树育种的前期筛选，从而有利于提高抗逆性茶树品种的选育效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域和生物化学分析领域，特别是涉及一种茶树类黄酮糖基转移酶及其应用。
背景技术
类黄酮的糖基化是茶树体中普遍存在的现象，这对于维持茶树体的细胞代谢平衡具有重要作用。UDP-糖基转移酶(UDP-glycosyl transferase，UGT)是糖基化酶的主成员之一，以尿苷二磷酸-糖(UDP-糖)作为糖基供体，转移到受体分子，以达到调节受体分子的水溶性、稳定性及生物活性。在茶树中类黄酮的糖基化与茶树抵御外界环境胁迫密切相关，糖基化黄酮类代谢物提高了溶解性、稳定性及其他生物活性，参与了茶树的抗寒冷、抗旱、抗盐碱等胁迫。茶树抗逆性的研究是茶树育种重要内容，因此解析类黄酮的糖基化的分子机制，加强对糖基转移酶基因的应用，对开发新的育种方法，提升育种效率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种茶树类黄酮糖基转移酶及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明基于代谢物与全基因组关联分析的方法，发现当茶树中糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示时，其具有高效催化多个类黄酮生成糖基化的代谢物的能力，因此，可以根据茶树中糖基转移酶的基因型进行茶树育种的前期筛选，从而有利于提高抗逆性茶树的育种效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供类黄酮糖基转移酶，所述类黄酮糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明还提供上述的分子标记在茶树育种中的应用。
进一步地，所述应用为筛选类黄酮的糖基化水平高的茶树种质。
本发明还提供一种筛选类黄酮的糖基化水平高的茶树种质的方法，包括以下步骤：
(1)以茶树的cDNA为模板，采用SEQ ID NO.1-2所示的引物对，进行PCR扩增，得到克隆基因；
(2)对所述克隆基因进行测序和蛋白翻译，当所述克隆基因翻译成的蛋白序列仅如SEQ ID NO.3所示时，所述茶树即为类黄酮的糖基化水平高的茶树种质。
进一步地，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应体系为所述PCR扩增的反应体系为：cDNA模板2μL，10×扩增缓冲液3μL，4种dNTP混合物0.6μL，正反向引物各0.6μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，超纯水24μL。
进一步地，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应程序为：步骤1温度94℃，2min；步骤2温度94℃，25s；步骤3温度56℃，20s；步骤4温度72℃，35s；步骤5温度72℃5min，步骤2-4循环35次。
本发明还提供一种筛选类黄酮的糖基化水平高的茶树种质的试剂盒，包括SEQ IDNO.1-2所示的引物对。
本发明公开了以下技术效果：
本发明基于代谢物与全基因组关联分析的方法，成功克隆糖基转移酶CsUGT708C的两个等位基因，并根据该基因的基因型进行茶树的分子标记辅助育种。该基因的单核苷酸多态性(SNP)包含4个非同义突变的碱基，CsUGT708C1基因非同义突变的SNP位点为C(胞嘧啶)-A(腺嘌呤)-A(腺嘌呤)-C(胞嘧啶)，编码的蛋白酶具有高效催化多个类黄酮生成糖基化的代谢物的能力，同时对应在茶树体中芹菜素6,8-二-C-内苷等糖苷化的代谢物含量较高；CsUGT708C2基因非同义突变的SNP位点为T(胸腺嘧啶)-G(鸟嘌呤)-G(鸟嘌呤)-G(鸟嘌呤)时，编码的蛋白酶催化效率较低，同时对应在茶树体中芹菜素6,8-二-C-内苷等糖苷化的代谢物含量较低。根据茶树中糖基转移酶CsUGT708C的基因型进行茶树育种的前期筛选，有利于提高抗逆性茶树品种的选育效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同等位基因对应类黄酮的糖基化代谢物的含量差异；
图2为芹菜素6,8-二-C-内苷的全基因组关联分析结果；其中，A为代谢物含量区间分布图；B为表型数的分位数-分位数图；C为代谢物的含量与QTL的关系图；
图3为糖基化根皮素的全基因组关联分析结果；其中，A为代谢物含量区间分布图；B为表型数的分位数-分位数图；C为代谢物的含量与QTL的关系图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)利用220份茶树种质资源(表1)的mRNA测序，比对到茶树参考基因组G240(茶树参考基因组G240注释文件从下载，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，根据RNA测序结果获得表达基因SNPs，同时利用LCMS对220份资源中的叶片进行芹菜素6,8-二-C-内苷和糖苷化根皮素2种糖苷化类黄酮代谢物进行定性定量分析，将代谢物的含量作为表型数据与基因型数据进行关联分析，定位了位于1号染色体49081988bp-49485113bp位置的糖基转移酶基因CsUGT708C(图2和3)。
表1220份茶树种质资源
(2)克隆糖基转移酶CsUGT708C的等位基因，并根据该基因的基因型进行茶树的分子标记辅助育种。设计引物，正向引物序列5'-ATGGCGAACGCCGACGATTTT-3'(SEQ ID NO.1)，反向引物序列5'-GGCAGTCTCTGCAAGCCTCAA-3'(SEQ ID NO.2)。
以茶树的cDNA为模板(2μL)，采用SEQ ID NO.1-2所示的引物对，进行PCR扩增，得到克隆基因。
PCR扩增体系为：10×扩增缓冲液3μL，4种dNTP混合物(dATP，dGTP，dTTP，dCTP各0.15μL)0.6μL，正反向引物各0.6μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，超纯水24μL。
扩增程序：步骤1温度94℃，2min；步骤2温度94℃，25s；步骤3温度56℃，20s；步骤4温度72℃，35s；步骤5温度72℃5min，步骤2-4循环35次。
对克隆基因进行测序和蛋白序列翻译，当克隆基因只能翻译为CsUGT708C1蛋白(SEQ ID NO.3)时(表明该基因两个等位基因翻译蛋白相同)，该茶树为芹菜素6,8-二-C-内苷和糖苷化根皮素含量高的茶树种质；当克隆基因只能翻译为CsUGT708C2蛋白(SEQ IDNO.4)时，该茶树为芹菜素6,8-二-C-内苷、糖苷化根皮素等2种糖基化类黄酮代谢物含量低的茶树种质(图1)。因此，可以根据茶树中糖基转移酶CsUGT708C的基因型进行茶树育种的前期筛选。
CsUGT708C1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
MANADDFSGKSPHVAVLPGAGMGHLTPALRLAAMLSSRGCLVTLIAVKPTVSAAESTTISNFFSTYPHINRLDFEILPRKPPSSTNDDPFFIQFEAISRSVAHLLKPLLLSSSPPLSAIFSDFTVSMTLTPILEELCIPNYVLSVTCARFLSLLAYLPYLINENSPKFGESDDYVHIPGLSPLPLSTIPPPFFNPTLFFTSFAISNALFLPKAKGILVNTFERFEPDTLAALNNGRVLSNLPPVHPIGPLEPYKLEKGEQLSWLDDQSVKSVVYVCFGNRTAMSKDQIRELGDGLERSGCPFLWVLKSSKVDKEDTEEIEDLLGDSFLERIKNRGIVVKAWVNQEQILAHPAIGGFVSHAGWNSVMEAARYGVPLLAWPPHGDQRVISEVVENAGFGVWVRDWGWGGERVVKGEEIGDKVKQLMSDEKLRNRAMEVEEEARKAFQDANGSSEKALMGIIETLRLAETA*。
CsUGT708C2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：
MANADDFSGKSPHVAVLPGAGMGHLTPALRLAAMLSSRGCLVTLIAVKPTVSAAESTTISNFFSTYPHINRLDFEILPRKPPSSTNDDPFFIQFEAISRSVVHLLKPLLLSSSPPLSAIFSDFTVSMTLTPILEELCIPNYVLSVTCARFLSLLAYLPYLINENSPKFGESDDYVHIPGLSPLPLSTIPPPFFNPTLFFTSFAISNALFLPKAKGILVNTFERFEPDTLAALNNGRVLSNLPPVHPIGPLEPYKLEKGEQLSWLDDQSVKSVVYVCFGNRTAMSKDQIRELGDGLERSGCPFLWVLKSSKVDKEDTEEIEDLLGDSFLERIKNRGIVVKAWVNQEQVLAHPAIGGFVSHAGWNSVMEAARYGVPLLAWPPHGDQRVISEVVENAGFGVWVRDWGWGGERVVKGEEIGGKVKQLMSDEKLRNRAMEVEEEARKAFQDANGSSEKALMGIIETLRLAETA*。
在此提供编码CsUGT708C1蛋白的基因序列中的一种(如SEQ ID NO.5所示)和编码CsUGT708C2蛋白的基因序列中的一种(如SEQ ID NO.6所示)，除了上述序列外，编码CsUGT708C1或CsUGT708C2蛋白的还具有其他基因序列(这些编码基因具有多个位点的同义突变，如表2所示)。
SEQ ID NO.5：
ATGGCGAACGCCGACGATTTTTCGGGAAAATCGCCTCATGTTGCTGTCCTCCCCGGCGCCGGCATGGGTCATCTGACTCCGGCCCTCCGGCTAGCCGCCATGCTATCTTCACGAGGCTGTCTCGTAACTCTAATTGCAGTCAAGCCTACTGTCTCTGCTGCTGAGTCCACCACCATCTCTAACTTCTTCTCCACCTACCCACATATCAATCGTCTCGATTTTGAAATCCTTCCCCGTAAGCCCCCCAGTTCTACCAACGACGACCCTTTCTTCATTCAATTCGAAGCCATTAGTCGCTCTGTTGCTCACCTTCTCAAGCCTCTCTTGTTATCTT CCTCTCCACCTCTCTCTGCTATCTTCTCTGATTTCACTGTTTCCATGACTCTCACTCCTATTCTTGAGGAACTCTGCATACCCAATTACGTTCTCTCCGTTACCTGTGCTAGATTTCTCTCTCTCCTGGCTTACCTTCCTTACTTGATCAATGAAAACTCTCCGAAATTCGGTGAATCCGATGACTATGTGCACATCCCAGGTTTATCCCCACTGCCTCTGTCAACTATTCCTCCACCATTCTTCAATCCAACTCTGTTCTTCACGTCGTTTGCAATATCGAACGCTCTGTTTCTACCGAAAGCGAAAGGTATTTTGGTAAACACCTTTGAGCGATTCGAACCCGACACACTCGCTGCACTCAACAATGGCAGAGTCTTAAGTAACCTCCCACCTGTTCACCCAATTGGCCCATTAGAGCCTTACAAGCTCGAAAAAGGAGAACAACTTTCATGGTTAGACGACCAGAGTGTTAAATCTGTGGTGTACGTTTGCTTCGGAAACAGAACAGCCATGTCAAAGGACCAAATCAGAGAACTTGGAGATGGGTTAGAGAGAAGTGGGTGTCCATTCTTGTGGGTTTTGAAATCCAGCAAAGTAGACAAAGAAGACACCGAAGAGATTGAAGATTTGCTTGGCGATTCGTTTCTGGAAAGGATAAAAAACAGGGGAATCGTAGTGAAAGCATGGGTAAATCAGGAGCAAATTCTAGCACACCCGGCCATTGGGGGTTTCGTCAGCCACGCTGGATGGAATTCGGTGATGGAAGCGGCTCGGTACGGCGTGCCGCTGTTGGCGTGGCCTCCACACGGCGACCAGAGGGTGATTTCAGAGGTGGTCGAGAATGCTGGGTTTGGGGTGTGGGTGAGAGATTGGGGTTGGGGTGGAGAGAGGGTGGTGAAAGGGGAAGAGATTGGAGACAAGGTTAAACAGCTGATGAGTGATGAGAAGTTGAGGAATAGAGCTATGGAGGTTGAGGAAGAAGCTAGGAAGGCTTTTCAGGATGCTAATGGGAGCTCTGAGAAGGCATTGATGGGAATTATTGAAACGTTGAGGCTTGCAGAGACTGCCTAA。
SEQ ID NO.6：
ATGGCGAACGCCGACGATTTTTCGGGAAAATCGCCTCATGTTGCTGTCCTACCCGGCGCCGGCATGGGTCATCTGACTCCGGCCCTCCGGCTAGCCGCAATGCTATCTTCACGAGGCTGTCTCGTAACTCTAATTGCAGTCAAGCCTACTGTCTCTGCTGCTGAGTCCACCACCATCTCTAACTTCTTCTCCACCTACCCACATATCAATCGTCTCGATTTTGAGATCCTTCCCCGTAAGCCCCCCAGTTCTACCAACGACGACCCTTTCTTCATTCAATTCGAAGCCATTAGTCGCTCTGTTGTTCACCTTCTCAAGCCTCTCTTGTTATCTTCCTCTCCACCTCTCTCTGCTATCTTCTCTGATTTCACTGTTTCCATGACTCTCACTCCTATTCTTGAGGAACTCTGCATACCCAATTACGTTCTCTCCGTTACCTGCGCTAGATTTCTCTCTCTCCTGGCTTACCTTCCTTACTTGATCAATGAAAACTCTCCGAAATTCG GTGAATCCGATGACTATGTGCACATCCCAGGTTTATCCCCACTGCCTCTGTCAACTATTCCTCCACCATTCTTCAATCCAACTCTGTTCTTCACGTCGTTTGCAATATCGAACGCTCTGTTTCTACCGAAAGCGAAAGGTATTTTGGTAAACACCTTTGAGCGATTCGAACCCGACACACTCGCTGCACTCAACAATGGCAGAGTCTTAAGTAACCTCCCACCTGTTCACCCAATTGGCCCATTAGAGCCTTACAAGCTCGAAAAAGGAGAACAACTTTCATGGTTAGACGACCAGAGTGTTAAATCTGTGGTGTACGTTTGCTTCGGAAACAGAACAGCCATGTCAAAGGACCAAATCAGAGAACTTGGAGATGGGTTAGAGAGAAGCGGGTGTCCATTCTTGTGGGTTTTGAAATCCAGCAAAGTAGACAAAGAAGACACCGAAGAGATTGAAGATTTGCTTGGCGATTCGTTTCTGGAAAGGATAAAAAACAGGGGAATCGTAGTGAAAGCATGGGTAAATCAGGAGCAAGTTCTAGCACACCCTGCCATTGGGGGTTTCGTCAGCCACGCTGGATGGAATTCGGTGATGGAAGCGGCTCGGTACGGCGTGCCGCTGTTGGCGTGGCCTCCACACGGCGACCAGAGGGTGATTTCAGAGGTGGTCGAGAATGCTGGGTTTGGGGTGTGGGTGAGAGATTGGGGTTGGGGTGGAGAGAGGGTGGTGAAAGGGGAAGAGATTGGAGGGAAGGTTAAACAGCTGATGAGTGATGAGAAGTTGAGGAATAGAGCTATGGAGGTTGAGGAAGAAGCTAGGAAGGCTTTTCAAGATGCTAATGGGAGCTCTGAGAAGGCATTGATGGGAATTATTGAAACGTTGAGGCTTGCAGAGACTGCCTAA。
CsUGT708C1和CsUGT708C2蛋白的氨基酸变化和其编码基因碱基的突变碱基情况见表2。
表2
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种类黄酮糖基转移酶，其特征在于，所述类黄酮糖基转移酶的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
2.一种如权利要求1所述的类黄酮糖基转移酶在茶树育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为筛选类黄酮的糖基化水平高的茶树种质。
4.一种筛选类黄酮的糖基化水平高的茶树种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以茶树的cDNA为模板，采用SEQ ID NO.1-2所示的引物对，进行PCR扩增，得到克隆基因；
(2)对所述克隆基因进行测序和蛋白翻译，当所述克隆基因翻译成的蛋白序列仅如SEQID NO.3所示时，所述茶树即为类黄酮的糖基化水平高的茶树种质。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应体系为：cDNA模板2μL，10×扩增缓冲液3μL，4种dNTP混合物0.6μL，正反向引物各0.6μL，TaqDNA聚合酶2.5μL，超纯水24μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应程序为：步骤1温度94℃，2min；步骤2温度94℃，25s；步骤3温度56℃，20s；步骤4温度72℃，35s；步骤5温度72℃5min，步骤2-4循环35次。
7.一种筛选类黄酮的糖基化水平高的茶树种质的试剂盒，其特征在于，包括SEQ IDNO.1-2所示的引物对。
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