CN108048458B - 一种水稻抗倒伏基因的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组用于检测水稻抗倒伏基因SCM3的引物组，所述基因SCM3包括三个SNP分子标记，分别为K_030531、K_030532、K_030533，其中，K_030531的多态性碱基为C或T，K_030532的多态性碱基为T或C，K_030533的多态性碱基为C或G。利用所述的分子标记，可以快速、精确的检测SCM3基因，大幅提高基因转育的效率。且检测过程不需要酶切、电泳及测序等，操作简便，利于高通量快速检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染、甲醛对人体的危害。

Description

一种水稻抗倒伏基因的SNP标记及其应用

技术领域：

本发明涉及分子标记领域，具体的，涉及一种水稻抗倒伏基因的SNP分子标记。

背景技术：

近年来随着高产水稻的选育和推广，水稻倒伏成为一种普遍现象。水稻倒伏严重影响水稻的产量、稻米品种，提高收割难度和成本。水稻抗倒伏性状是由数量性状位点(QTL)控制的，目前克隆的抗倒伏基因中真正用于水稻的遗传改良和育种比较少。

传统系谱法育种是近年来最为普遍的水稻育种方法，也因此诞生了大量的高产量优质水稻品种。但是传统的杂交结合表型的选育方法往往因为宏观上表型把握不准而需要加大回交群体，这极大的增加了育种工作量与成本。

如CN105284589A公开了一种抗倒伏水稻品种培育方法，先根据当地水稻施氮水平与种植密度设置致倒逆境并筛选出抗倒资源；利用抗倒资源与其它综合性状优良的材料人工杂交，按系谱选育法，培育出抗倒常规品种、抗倒不育系、抗倒恢复系；用抗倒不育系与抗倒恢复系配制杂交组合，培育出抗倒杂交组合，此技术为传统育种方法，育种效率较低。

近年来兴起的分子标记辅助育种可以从遗传基础上跟踪目标性状，选择含有目标基因的单株进行杂交(回交)，这样不但能准确的进行目标性状方向的育种，而且能减小回交群体的大小，节省成本。

CN106086180A公开了一种水稻抗倒伏主效QTL qSR5.1的分子标记辅助育种方法，利用与抗倒伏主效QTL qSR5.1紧密连锁的分子标记RM5796的引物对和ILP5-11的引物对，对育种群体的各家系DNA进行PCR扩增，如扩增出对应大小的DNA片段，则标志着该家系中抗倒伏主效QTL qSR5.1的存在。本发明采用水稻抗倒伏主效QTL qSR5.1的分子标记方法，该方法是应用筛选到的与水稻抗倒伏品种023S第5号染色体上定位到的抗倒伏主效QTLqSR5.1紧密连锁的2个分子标记，它们能有效预测水稻育种群体中各家系的抗倒伏性，加快抗倒伏品种的选育速度。但是这种分子标记在基因组中出现的频率远低于SNP标记，而且不能实现检测的高通量。

SNP是single nucleotide polymorphism的缩写，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP包括单个碱基的转换或颠换，也包括插入或缺失，在整个基因组上具有高密度性，因此比较容易找到目标基因的SNP。利用目标基因的SNP标记可以在育种过程中进行相关性状的精准选育，也可以将相关的SNP锚定进芯片，在进行全基因组标记选择的同时选择含有此目标基因的个体(单株)。

然而，由于抗倒伏这个性状是由数量性状控制，表型值又不易准确测定，因此目前克隆的主效基因比较少，而真正针对主效基因设计的SNP标记也比较少。关于水稻抗倒伏这一性状的SNP分子标记基本都是根据QTL来设计的，因此这样的SNP标记在实际育种中价值可能较小。

发明内容：

有鉴于此，提出本发明。

根据文献资料将水稻SCM3基因定位在第3染色体上参照日本晴的物理位置：28428504-28430438区间内。

本发明的第一方面，提供了一组应用于水稻抗倒伏基因SCM3检测的SNP分子标记，所述分子标记为K_030531、K_030532、K_030533，其中，K_030531的多态性碱基为C或T，K_030532的多态性碱基为T或C，K_030533的多态性碱基为C或G。

进一步的，所述K_030531位于水稻参考基因组MSU7.0第3染色体上第28428063位碱基处；所述K_030532位于水稻参考基因组MSU7.0第3染色体上第28428410位碱基处；所述K_030533位于水稻参考基因组MSU7.0第3染色体上第28428721位碱基处。

本发明的另一方面，提供了检测K_030531、K_030532、K_030533这三种SNP分子标记的引物组，每组引物包括两条特异性引物及一条通用引物，引物组序列具体如表1所示：

表1分子标记K_030531、K_030532、K_030533的引物

本发明中，利用上述引物对SNP位点的检测可以采用本领域的常规方法，如PCR、荧光定量PCR、KASP技术等。上述应用的实质为该分子标记的检测方法。其中，PCR反应程序与体系可采用本领域常规技术，本发明对此不另作限定。

如，本发明可以采用KASP技术对SNP位点进行检测，检测方法包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，分别利用上述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光接头序列；所述荧光序列可为KASP反应试剂指定的荧光接头序列。在本发明的一个具体实施方式中，选择使用LGC公司的KASP反应试剂，引物合成时将FAM或HEX荧光接头序列分别连接在两条特异性引物的5’端。

S3、若三组引物均只检测到引物Primer Y所对应的荧光信号，则判断水稻样品为纯和的SCM3基因型(抗倒伏)；若三组引物未同时检测到引物Primer Y所对应的荧光信号，则判断水稻样品为水稻纯和的scm3基因型(非抗倒伏)；若三组引物同时检测到两种荧光信号，则判断水稻样品为杂和的SCM3基因型(如图1-3所示)。

本发明的另一方面，提供了一种检测水稻抗倒伏基因SCM3的方法，检测方法包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，对K_030531、K_030532、K_030533这三种SNP分子标记进行检测；

S3、若三组引物均只检测到引物Primer Y所对应的碱基，则判断水稻样品为纯和的SCM3基因型(抗倒伏)；若三组引物未同时检测到引物Primer Y所对应的碱基，则判断水稻样品为水稻纯和的scm3基因型(非抗倒伏)；若三组引物同时检测到Primer X、Primer Y所对应的碱基，则判断水稻样品为杂和的SCM3基因型。

本发明的另一方面，提供一种上述分子标记在水稻抗倒伏育种中的应用，利用上述分子标记的检测方法对上述分子标记进行检测，选择携带有SCM3基因的水稻样品进行后续育种。

本发明的另一方面，提供了一种检测SCM3基因SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括K_030531、K_030532、K_030533这三种SNP分子标记的引物，也就是包括SEQ ID NO.1-9的引物。

优选的，每种分子标记的特异性引物5’端分别连接不同的荧光接头序列。所述荧光接头序列可以为FAM或HEX荧光接头序列。

所述试剂盒用于水稻抗倒伏育种。

本发明的另一方面，提供一种基因芯片，所述基因芯片包括SEQ ID NO.1-9的引物。所述基因芯片应用于水稻等植物的基因分型。

本发明通过对水稻SCM3基因克隆者提供的序列以及95份资源材料基因分型结果做分析，发现品种R900与SCM3基因的原始供体Chugoku117可以划为同一个单倍型。因此R900可能具有Chugoku117在水稻抗倒伏方面同样的功能，通过R900与非抗倒的水稻品种构建遗传分离群体，并通过不同基因型后代的表型发现，R900中的SCM3等位基因确实具有显著的抗倒伏功能。因此该材料(含有SCM3基因)在水稻抗倒伏育种上具有重要作用。使用含有此基因的水稻供体材料(R900)与大面积推广的非抗倒伏杂交稻亲本或常规稻杂交，并通过连续的回交使目标基因进入要改良的品种中，这样就可以达到改良水稻品种抗倒伏性状的目的。

本发明的主要作用就是鉴定或辅助鉴定水稻的抗倒伏性状，在不需要直接测定某水稻品种抗倒伏表型的同时通过测定其基因型在“K_030531、K_030532、K_030533”上的多态性来判断水稻的抗倒伏性状。基因型多态性的测定上包括基因芯片技术，Taqman技术，分子信标技术和焦磷酸测序法等。在水稻苗期之前来判断其倒伏抗性在定向改良和品种选育中有重大意义。因为在杂交(或回交)时，水稻尚未灌浆，此时不能通过具体的水稻抗倒伏表型值来判断其为抗倒还是非抗倒材料，但是又必须选择抗倒伏的材料来进行杂交。通过检测“K_030531、K_030532、K_030533”在具体单株中的多态性来预测其倒伏抗性情况，选择合适的单株进行种植，进而杂交(回交)，减少回交的工作量和群体的规模，从而节省时间和成本。同时SNP分子标记在基因组上的密度大，也更容易开发，利用KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，可以快速、精准的检测SCM3基因。在抗倒伏品种选育时亦可通过此种方法选择目标单株。

本发明的有益效果为：

本发明是针对经过表型筛选，基因功能显著的抗倒伏基因开发的标记，可同时用在籼稻、粳稻的品种改良和育种上。本发明可以在苗期之前通过检测基因型来推测表型，节省育种时间，减少种植面积。本发明利用KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，可以快速、精准的检测SCM3基因，高通量的应用在商业化分子育种中，同时在实验过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染，避免了EB等有毒物的使用。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为K_030531的标记分型图；

图2为K_030532的标记分型图；

图3为K_030533的标记分型图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。

在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

根据文献资料将水稻SCM3基因定位在第3染色体上参照日本晴的物理位置：28428504-28430438区间内。以基因区间为中心向两侧各扩大了50kb，根据国际水稻所3000份水稻重测序数据进行SNP位点提取，参考华智水稻生物技术有限公司对8份表型清楚的材料的测序结果进行分析，可以将这9份材料的SNP信息归纳如下，如表2所示：

表2实验中9份水稻的SNP信息

其中SNP6为文章中报道的差异位点，而SNP1、SNP2、SNP4、SNP5为连锁变异位点，因此可以将以上材料归为3种单倍型(Haplotype)，其中R900与克隆该基因的供体Chugoku117为同一个单倍型。根据以上SNP的差异，利用BatchPrimer3针对SNP1、SNP2、SNP4、SNP5和SNP6设计5对引物。

再根据23份水稻材料对引物的测试情况选择3对在抗倒材料和非抗倒材料中具有多态性的标记，因此我们初步确定K_030531、K_030532、K_030533这三个SNP标记为候选的抗倒伏SNP标记，测试结果如表3所示：

表3 SNP标记与倒伏性状的关系

根据表3的结果可知，K_030531、K_030532、K_030533这三个SNP标记的检测结果分别为C、T、G时，水稻表现为抗倒伏的性状。

实施例2

根据水稻SCM3克隆的文章，以及基因分型结果，我们选择了在这3个SNP上有差异的两对亲本材料(R900、Tetep以及R900、华恢705)进行杂交，选择阳性的F1单株，每个组合混收500粒左右的种子，F2家系的表型用来验证候选的标记。同时取F2叶片抽提DNA，进行基因分型，结合表型值对以上初步确定的3个SNP进行再次验证，结果证明K_030531、K_030532、K_030533三个标记是有功能的标记组合。

R900×Tetep F2代的表型验证结果如表4所示，K_030531、K_030532、K_030533这三个SNP标记的检测结果分别为C、T、G时，检测单株为抗倒伏SCM3基因型(R)；K_030531、K_030532、K_030533这三个SNP标记未检测出C-T-G单倍型时，检测单株为非抗倒伏scm3基因型(S)。

表4 R900×Tetep F2代表型验证结果

其中以上基因型为R的家系与R900是同一个单倍型，为抗倒伏的基因型，基因型为S的家系为非抗倒伏基因型。

R900×华恢705F2代的表型验证结果如表5所示。

表5 R900×华恢705F2代表型验证结果

其中以上基因型为R的家系与R900是同一个单倍型，为抗倒伏的基因型，基因型为S的家系为非抗倒伏基因型。

根据表4、表5的检测结果可知，采用本发明提供的SNP分子标记，其对水稻抗倒伏性状的预测准确率高，可以应用于水稻育种中，以提高育种效率。

应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一组应用于水稻抗倒伏基因SCM3检测的SNP分子标记的引物组，其特征在于：所述分子标记为K_030531、K_030532和K_030533，其中，K_030531的多态性碱基为C或T，K_030532的多态性碱基为T或C，K_030533的多态性碱基为C或G；

所述K_030531位于水稻参考基因组MSU7.0第3染色体上第28428063位碱基处；所述K_030532位于水稻参考基因组MSU7.0第3染色体上第28428410位碱基处；所述K_030533位于水稻参考基因组MSU7.0第3染色体上第28428721位碱基处；

用于检测所述SNP分子标记的引物组包括，

用于检测分子标记K_030531的引物组，

其特异性引物序列为：

Primer Seq Allele X：TCCTCTGAACCCTACTCGACA

Primer Seq Allele Y：CTCTGAACCCTACTCGACG

通用引物序列为：

TGTATGTTGATGTTGATGAGCT；

用于检测分子标记K_030532的引物组，

其特异性引物序列为：

Primer Seq Allele X：CTTTGCCTTGTATTCTCCTCC

Primer Seq Allele Y：CTTTGCCTTGTATTCTCCTCT

通用引物序列为：

TGGTCATCGATCAGTCATCA；

和用于检测分子标记K_030533的引物组，

其特异性引物序列为：

Primer Seq Allele X：AGGAGTAGAACACACACACAG

Primer Seq Allele Y：AGGAGTAGAACACACACACAC

通用引物序列为：

ACTCCACATGAGCCCATGCT。

2.根据权利要求1所述的分子标记的引物组，其特征在于：特异性引物分别连接不同的荧光接头序列。

3.根据权利要求2所述的分子标记的引物组，其特征在于：所述荧光接头序列为FAM或HEX荧光接头序列。

4.一种水稻抗倒伏基因SCM3的检测方法，检测方法包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述的引物组对K_030531、K_030532、K_030533这三种SNP分子标记进行检测；

S3、若三组引物均只检测到引物Primer Y所对应的碱基，则判断水稻样品为纯和的SCM3基因型，表现为抗倒伏；若三组引物未同时检测到引物Primer Y所对应的碱基，则判断水稻样品为纯和的scm3基因型，表现为非抗倒伏；若三组引物同时检测到Primer X、PrimerY所对应的碱基，则判断水稻样品为杂和的SCM3基因型。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：S2中，利用如权利要求1所述的引物组进行KASP反应检测，其中，每组引物中不同特异性引物分别连接不同的荧光接头序列。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：特异性引物5’端连接FAM或HEX荧光接头序列。

7.权利要求1所述的引物组在水稻抗倒伏育种中的应用。

8.一种检测SCM3基因SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。

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