CN113481312A - 与豌豆荚壁嫩度主效qtl紧密连锁的kasp分子标记及其开发方法和应用 - Google Patents

与豌豆荚壁嫩度主效qtl紧密连锁的kasp分子标记及其开发方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，包括第一KASP分子标记和/或第二KASP分子标记，第一KASP分子标记特异性检测豌豆的Chr1LG6染色体的第297000666位点，第二KASP分子标记特异性检测所述的豌豆的Chr1LG6染色体的第302006525位点。还提供了相关开发方法和应用。本发明的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁，可在豌豆生长早期快速、准确对荚壁嫩度进行预判，实现以软荚型或硬荚型为育种靶标的分子标记辅助选择，提高育种选择精度，加快育种进程，在豌豆食荚品质改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。

Description

与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记及其开发 方法和应用
技术领域
本发明涉及生物信息学及分子标记遗传学技术领域，更具体地，涉及豌豆KASP分子标记技术领域，特别是指一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记及其开发方法和应用。
背景技术
豌豆(Pisum sativum L.)隶属豆科豌豆属，是全球最重要的四大豆类作物之一，也是我国第二大食用豆类，其种植区域几乎覆盖全国各地。根据荚壁类型和食用部位的不同，豌豆又被分为粒用型豌豆和食荚型豌豆。据联合国粮农组织统计数据，我国豌豆年产总产量达1450万吨，占世界总产量的40％以上(FAOSTAT 2020)。
豆荚是食荚豌豆的食用器官。其品质包括外在品质，如荚型荚色、产量；内在品质，如矿物质、维生素、氨基酸、膳食纤维等营养物质；口感品质，如嫩度、甜度等。其中，荚壁的嫩度是直接影响豌豆食用品质和商品价值、决定其品种用途的重要因素。粒用型豌豆荚壁坚硬、纤维发达，豆荚厚而饱满，常以豆粒为食用部分；而食荚型豌豆荚壁脆软、纤维含量少，嫩荚期呈肉质化的荚壳可连同籽粒一起食用，口感清脆，亦称荷兰豆或甜豌豆，是蔬菜中的时令佳品。随着人们膳食结构的改变，对不同类型豌豆的商品需求正发生着巨大变化。因此，如何实现豌豆育种在以追求高产粒用品质和兼顾嫩荚等食荚品质之间的按需灵活转变是贴近生产实际、满足市场多样化需求的重要途径，围绕荚壁性状的遗传改良因此具有重大的现实意义。
但是，由于豌豆分子生物学研究的相对滞后性，相比其它作物，豌豆的品种改良依然以基于表型选择的传统手段为主，准确度不高且效率低下。特别地，如豌豆荚壁形成等荚部性状必须要在其生育后期才能进行观测，周期较长，对相关性状的遗传改良造成极大阻碍。
分子标记辅助选择(MAS，Marker-Assisted Selection)可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，帮助实现目标性状的超早期、精准选择，加快育种进程，对豌豆的粒用品种/食荚品种育种具有重要指导作用。特别地，KASP (Kompetitive AlleleSpecific PCR)作为新型的分子标记技术，可实现单核苷酸变异分析，具有准确性高、灵活性强、成本低以及高效成熟等优点，近年已在许多作物的产量、品质等遗传学研究上广泛采用。
然而，受限于豌豆组学研究和荚壁形成的复杂性，迄今尚未报道与之相关的分子标记，利用分子标记辅助选择的品种改良依然无法实现。开发适用于高通量筛选和辅助豌豆荚嫩度育种的KASP分子标记对豌豆的品质改良意义重大。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，其与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁，可在豌豆生长早期快速、准确对荚壁嫩度进行预判，实现以软荚型或硬荚型为育种靶标的分子标记辅助选择，提高育种选择精度，加快育种进程，在豌豆食荚品质改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，其设计巧妙，采用该KASP分子标记进行检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法，由其开发的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁，可在豌豆生长早期快速、准确对荚壁嫩度进行预判，实现以软荚型或硬荚型为育种靶标的分子标记辅助选择，提高育种选择精度，加快育种进程，在豌豆食荚品质改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法，其设计巧妙，操作简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记在早期检测豌豆荚壁嫩度中的应用，从而可在豌豆生长早期快速、准确对荚壁嫩度进行预判，实现以软荚型或硬荚型为育种靶标的分子标记辅助选择，提高育种选择精度，加快育种进程，在豌豆食荚品质改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记在早期检测豌豆荚壁嫩度中的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供了一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，其特点是，所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记包括第一KASP分子标记和/或第二-KASP分子标记，所述第一KASP分子标记特异性检测豌豆的Chr1LG6染色体的第297000666位点，所述第二KASP分子标记特异性检测所述的豌豆的Chr1LG6染色体的第302006525位点。
这里的“第一KASP分子标记和/或第二KASP分子标记”指的是至少其中一种的意思，即第一KASP分子标记、第二KASP分子标记、以及第一KASP分子标记和第二KASP分子标记。
较佳地，所述第一KASP分子标记包括如SEQ ID NO：28～SEQ ID NO：30所示的引物序列，所述第二KASP分子标记包括如SEQ ID NO：34～SEQ ID NO：36所示的引物序列。
在本发明的第二方面，提供了一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)将硬荚型豌豆品种和软荚型豌豆品种作为亲本材料配置杂交组合，构建F2群体，将所述F2群体进行种植，测量所述F2群体的嫩荚期豆荚厚度，并观测所述F2群体的成熟期荚壁为脆薄半透明型还是柔韧且坚硬型，获得所述F2群体的表型数据；
(2)从所述F2群体中选取多个嫩荚期豆荚薄且成熟期荚壁脆薄半透明型的极端个体组成第一基因池，选取多个嫩荚期豆荚厚且成熟期荚壁柔韧且坚硬型的极端个体组成第二基因池，并连同所述亲本材料展开基因组重测序，分析得到所述第一基因池的SNPs位点和所述第二基因池的SNPs位点，分别计算所述SNPs位点的频率及所述SNPs位点中相对应的SNPs位点的频率差值即delta值，并进行统计分析，以SNPs-index为纵坐标、染色体位置为横坐标作图，发现与豌豆的荚壁嫩度相关的主效基因的位置区域；
(3)基于所述位置区域，参考所述基因组重测序所得的全基因组SNP、InDel及其双侧翼序列信息，设计KASP引物，从中挑选出在所述位置区域的染色体上分布均匀，且在所述亲本材料中扩增性强、稳定性好的多对KASP引物，对所述F2群体进行高通量基因分型获得所述F2群体的分型数据，联合所述的F2群体的表型数据及所述的F2群体的分型数据进行连锁分析，获得所述的与豌豆的荚壁嫩度相关的主效基因的目标区间；
(4)根据所述目标区间，获得距离所述目标区间最近的KASP引物作为所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述硬荚型豌豆品种为PS71，所述软荚型豌豆品种为PS35。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述F2群体包含230个株系。
较佳地，在所述步骤(2)中，所述的嫩荚期豆荚薄且成熟期荚壁脆薄半透明型的极端个体和所述的嫩荚期豆荚厚且成熟期荚壁柔韧且坚硬型的极端个体均为30个。
较佳地，在所述步骤(3)中，所述统计分析分别在100MB，10KB、100KB，1KB、10KB，1KB 3种不同窗口和步长组合下进行。
在本发明的第三方面，提供了一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，其特点是，采用上述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法获得。
在本发明的第四方面，提供了上述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记或者上述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法获得的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记在早期检测豌豆荚壁嫩度中的应用。
较佳地，所述应用包括以下步骤：
1)以待测豌豆的基因组DNA为模板，采用所述KASP分子标记进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描；以及
2)根据所述荧光信号扫描的结果判断位于所述第297000666位点为G还是A，判断位于所述第302006525位点为T还是C，当所述第297000666位点为G和/或所述第302006525位点为T时，则所述待测豌豆为软荚类型，当所述第297000666位点为A和/或所述第302006525位点为C时，则所述待测豌豆为硬荚类型。
本发明的有益效果在于：
a.本发明的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记包括第一KASP分子标记和/或第二-KASP分子标记，第一KASP分子标记特异性检测豌豆的Chr1LG6染色体的第297000666位点，第二-KASP分子标记特异性检测所述的豌豆的Chr1LG6染色体的第302006525位点，因此，其与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁，可在豌豆生长早期快速、准确对荚壁嫩度进行预判，实现以软荚型或硬荚型为育种靶标的分子标记辅助选择，提高育种选择精度，加快育种进程，在豌豆食荚品质改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
b.本发明的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记包括第一KASP分子标记和/或第二KASP分子标记，第一KASP分子标记特异性检测豌豆的Chr1LG6染色体的第297000666位点，第二KASP分子标记特异性检测所述的豌豆的Chr1LG6染色体的第302006525位点，因此，其设计巧妙，采用该KASP分子标记进行检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
c.本发明的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法采用硬荚型豌豆品种和软荚型豌豆品种构建F2群体，种植后测量嫩荚期豆荚厚度，并观测成熟期荚壁表型，获得表型数据；选取多个嫩荚期豆荚薄且成熟期荚壁脆薄半透明型的极端个作组成第一基因池，选取多个嫩荚期豆荚厚且成熟期荚壁柔韧且坚硬型的极端个体组成第二基因池，并连同亲本材料展开基因组重测序，分析得到SNPs位点，分别计算SNPs位点的频率及对应SNPs位点的频率差值即delta值，并进行统计分析，以SNPs-index为纵坐标、染色体位置为横坐标作图，发现与豌豆的荚壁嫩度相关的主效基因的位置区域；基于位置区域，参考基因组重测序所得的全基因组SNP、InDel及其双侧翼序列信息，设计KASP引物，从中挑选出在位置区域的染色体上分布均匀，且在亲本材料中扩增性强、稳定性好的多对KASP引物，对F2群体进行高通量基因分型获得分型数据，联合表型数据及分型数据进行连锁分析，获得与豌豆的荚壁嫩度相关的主效基因的目标区间；根据目标区间，获得距离目标区间最近的KASP引物作为与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，因此，由其开发的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁，可在豌豆生长早期快速、准确对荚壁嫩度进行预判，实现以软荚型或硬荚型为育种靶标的分子标记辅助选择，提高育种选择精度，加快育种进程，在豌豆食荚品质改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
d.本发明的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法采用硬荚型豌豆品种和软荚型豌豆品种构建F2群体，种植后测量嫩荚期豆荚厚度，并观测成熟期荚壁表型，获得表型数据；选取多个嫩荚期豆荚薄且成熟期荚壁脆薄半透明型的极端个体组成第一基因池，选取多个嫩荚期豆荚厚且成熟期荚壁柔韧且坚硬型的极端个体组成第二基因池，并连同亲本材料展开基因组重测序，分析得到SNPs位点，分别计算SNPs位点的频率及对应SNPs位点的频率差值即delta值，并进行统计分析，以SNPs-index为纵坐标、染色体位置为横坐标作图，发现与豌豆的荚壁嫩度相关的主效基因的位置区域；基于位置区域，参考基因组重测序所得的全基因组SNP、InDel及其双侧翼序列信息，设计KASP引物，从中挑选出在位置区域的染色体上分布均匀，且在亲本材料中扩增性强、稳定性好的多对KASP引物，对F2群体进行高通量基因分型获得分型数据，联合表型数据及分型数据进行连锁分析，获得与豌豆的荚壁嫩度相关的主效基因的目标区间；根据目标区间，获得距离目标区间最近的KASP引物作为与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，因此，其设计巧妙，操作简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
e.本发明的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记在早期检测豌豆荚壁嫩度中的应用，从而可在豌豆生长早期快速、准确对荚壁嫩度进行预判，实现以软荚型或硬荚型为育种靶标的分子标记辅助选择，提高育种选择精度，加快育种进程，在豌豆食荚品质改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
f.本发明的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记在早期检测豌豆荚壁嫩度中的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
图1为本发明的具体实施例中F2群体的各株系的嫩荚期豆荚厚度的频率分布示意图(a)和成熟期荚壁表征的统计结果示意图(b)。
图2为本发明的具体实施例中选择的用于BSA-Seq(Bulked segregantsequencing)的极端表型株系，其中a：组成第一基因池的极端株系(软荚型)在嫩荚期和成熟期的荚部表型；b：组成第二基因池的极端株系(硬荚型)在嫩荚期和成熟期的荚部表型；c：极端株系在嫩荚期的豆荚厚度(1～30号株系(左半部、斜线填充)和31～60号株系(右半部、横线填充)分布代表第一基因池株系和第二基因池株系)；其中，1～30号株系对应在F2群体中的株系编号分别为：F2-4、F2-13、F2-27、F2-30、F2-32、F2-33、F2-39、F2-41、F2-63、F2-77、F2-82、F2-89、F2-94、F2-97、F2-99、F2-101、F2-1 10、F2-112、F2-116、F2-118、F2-137、F2-143、F2-146、F2-149、F2-157、F2-160、F2-167、F2-179、F2-183、F2-215；31～60号株系对应在F2群体中的株系编号分别为：F2-3、F2-6、F2-19、F2-36、F2-38、F2-67、F2-83、F2-91、F2-103、F2-105、F2-108、F2-113、F2-122、F2-127、F2-128、F2-130、F2-132、F2-134、F2-162、F2-169、F2-185、F2-189、F2-191、F2-193、F2-196、F2-203、F2-204、F2-208、F2-224、F2-227。
图3为本发明的具体实施例中两个极端池SNPs位点delta-snp-index值全基因组扫描结果，其中a：第一基因池；b：第二基因池；c：snp-index在第一基因池和第二基因池中的差异。
图4为KASP引物KASP-10对亲本及F2群体的扩增检测结果，其中典型的软荚型品种中该位点为G，典型的硬荚型品种中该位点为A，坐标轴数值代表等位基因荧光信号强度，黑、蓝、红、紫点分布代表阴性对照(NTC)(即ddH20)、纯合子G/G、纯合子A/A以及杂合子G/A。
图5为KASP引物KASP-12对亲本及F2群体的扩增检测结果，其中典型的软荚型品种中该位点为T，典型的硬荚型品种中该位点为C；坐标轴数值代表等位基因荧光信号强度，黑、蓝、红、紫点分布代表阴性对照(NTC)(即ddH20)、纯合子T/T、纯合子C/C以及杂合子T/C。
图6为荚壁嫩度主效QTL精细定位图，其中a：主效QTL被定位在KASP-10和KASP-12之间，对应物理距离为5MB；b：F2群体中发生于该区间的重组事件；KASP-11为共分离标记；基因型：A为“PS35”(软荚型亲本)，B为“PS71”(硬荚型亲本)，H代表杂合；其中，植株表型依据F2株系在成熟期的荚壁表征，“0”代表该株系表型与软荚亲本“PS35”表型一致，“1”代表该株系荚壁表型与硬荚亲本“PS71”表型一致。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。实施实例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下述实施例中所用的豌豆材料由中国计量大学保存，可被本领域技术和研究人员获得使用。所用的其他耗材、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
1)群体材料构建及遗传分析
本发明人在前期的研究过程中，通过对硬荚型豌豆品种(“PS71”，由中国计量大学植物质量安全生物学实验室保存并提供)和软荚型豌豆品种(“PS35”，由中国计量大学植物质量安全生物学实验室保存并提供)的观测发现：嫩荚期两者在豆荚厚度上开始具有明显差异，硬荚型豌豆豆荚厚(4.86mm～6.54mm)而软荚型豌豆豆荚较薄(1.96mm～3.72mm)；发育至成熟期，硬荚型豌豆豆荚表现柔韧且坚硬，而软荚型豌豆豆荚表现脆薄呈半透明状。基于此，本发明以上述不同类型豌豆品种为研究对象，并以两者作为亲本材料配置杂交组合，构建了包含230个株系的F2群体(请参见表1所示)(该群体获得自中国计量大学植物质量安全生物学实验室)。2019年冬季将上述两个亲本品种及由它们衍生的F2群体种植于江苏省农科院院内试验基地，自荚果发育初期至后期持续对各株系的豆荚发育进行表型观测，并选择：①在嫩荚期取豆荚中间部位为测量点，使用游标卡尺(精度：±0.02/0.001)对开花后相同天数的豆荚厚度进行测量统计(请参见表1和图1所示)；②另在成熟期参考亲本表型对各株系荚壁外观进行观察，从表观上判断它们与哪一个亲本表型：“柔韧且坚硬型”(即类似亲本“PS71”表型)/“脆薄半透明型”(即类似亲本“PS35”表型)更为接近(请参见表1和图1所示)，从而保证表型鉴定的准确性。
表1 F2群体各株系及表型数据
Figure BDA0002958246150000081
Figure BDA0002958246150000091
Figure BDA0002958246150000101
其中，成熟期荚壁表征一栏中，“0”代表该株系荚壁表现为“脆薄半透明型”(即类似亲本“PS35”表型)；“1”代表该株系荚壁表现为“柔韧且坚硬型”(即类似亲本“PS71”表型)。
2)BSA-Seq(Bulked segregant sequencing)分析
联合不同时期的观测结果，从F2群体中选取嫩荚期豆荚薄且成熟期荚壁脆薄半透明型的极端个体30个(请参见表2所示)，组成第一基因池；选取嫩荚期豆荚厚且成熟期荚壁柔韧且坚硬型的极端个体30个(请参见表2所示)，组成第二基因池，并连同两个亲本展开基因组重测序(请参见图2所示)。采用SNP-Index算法对性状相关侯选区域进行选择。分别计算两个基因池的SNP-index，用Δ(SNP-Index)统计两个基因池之间基因型频率的显著差异，并进行LOESS回归拟合。为确保结果的可靠性，我们设置了3种不同的窗口和位移组合(分别为100Mb、10Kb；100Kb、1Kb；10Kb、1Kb)计算窗口内SNP-Index，并选取Δ(SNP-Index)LOESS拟合曲线的最高峰段为候选区域，以SNPs-index为纵坐标，染色体位置为横坐标作图，3种组合分析均在Chr1LG6染色体上检测到一明显峰段(请参见图3所示)，说明该位置有一主效基因与豌豆的荚壁嫩度相关，大致在320Mb位置。
表2 BSA-Seq(Bulked segregant sequencing)所用极端株系
第一基因池组成株系 第二基因池组成株系
F2-4 F2-3
F2-13 F2-6
F2-27 F2-19
F2-30 F2-36
F2-32 F2-38
F2-33 F2-67
F2-39 F2-83
F2-41 F2-91
F2-63 F2-103
F2-77 F2-105
F2-82 F2-108
F2-89 F2-113
F2-94 F2-122
F2-97 F2-127
F2-99 F2-128
F2-101 F2-130
F2-110 F2-132
F2-112 F2-134
F2-116 F2-162
F2-118 F2-169
F2-137 F2-185
F2-143 F2-189
F2-146 F2-191
F2-149 F2-193
F2-157 F2-196
F2-160 F2-203
F2-167 F2-204
F2-179 F2-208
F2-183 F2-224
F2-215 F2-227
3)主效基因的精细定位
基于BSA-Seq分析结果，以130MB-350MB作为锚定定位区间，参考测序所得的全基因组SNP、InDel及其双侧翼序列信息，按照LGC Genomics公司(LGC Genomics，UK)内置引物设计程序及默认参数设计KASP引物，每对KASP引物均包括2条正向引物和1条反向引物，并在2条正向引物序列的5’端分别加上FAM和HEX荧光基团接头，成为KASP分子标记；从初步设计的、位于130MB-350MB锚定区间内的42对KASP引物中，挑选出在区间染色体上分布均匀且在双亲中扩增性强、稳定性好的27对KASP引物(请参见表3所示)对F2群体进行高通量基因分型，联合群体单株表型数据及分型数据进行连锁分析，最终将目标基因定位在297MB-302MB之间。
表3 KASP引物信息
Figure BDA0002958246150000121
Figure BDA0002958246150000131
4)豌豆荚壁嫩度相关KASP分子标记的开发
基于连锁分析和精细定位结果，获得距离目标区间最近的两侧的分子标记作为荚壁嫩度相关KASP分子标记(SEQ ID NO.28-SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.34-SEQ ID NO.36)，分别特异性检测豌豆的Chr1LG6染色体的第297000666位点(G/A)和第302006525位点(T/C)，其中，豌豆的Chr1LG6染色体的第297000666位点的上下游55bp序列请参见SEQID NO.82所示(其中第297000666位点为A，当然其也可以为G)，豌豆的Chr1LG6染色体的第302006525位点的上下游55bp序列请参见SEQ ID NO.83所示(其中第297000666位点为C，当然其也可以为T)，并再次在亲本及F2群体材料中进行基因型-表型验证。具体为：
采用上述KASP分子标记对亲本及F2群体材料进行PCR扩增反应，反应体系及扩增程序如下：
PCR体系(10μL)：包括1.5μL样品DNA(50ng μL-1)，KASP Mix 5μL(LGC Genomics，Hoddeston，UK)和0.04μL KASP Assay Mix；
其中，KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的每条正向引物各12μL、浓度为100μM的反向引物30μL、加入46μL ddH2O补足至100μL。
PCR程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s，10个循环(touch-down，每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，34个循环。
利用Applied Biosystems 7300Plus Real Time PCR System(ThermoScientific，USA)检测荧光信号并进行基因分型。
上述方法在亲本及群体材料中进行基因型检测结果如图4、图5所示，图4为KASP-10分型结果，图5为KASP-12分型结果，检测结果显示分型结果良好，并且与表型数据(请参见图6所示)完全一致，说明KASP分子标记开发成功，可进一步应用于育种材料检测和以粒用型/食荚型豌豆品种的辅助育种。
因此，本发明利用基因组重测序及BSA-Seq技术发现一个与豌豆软硬荚形成(在此称其为荚壁嫩度)相关的位于Chr1LG6上的QTL。参考测序所得的全基因组SNP、InDel及其双侧翼序列信息开发特异性KASP分子标记，并在群体中进行高通量基因分型。联合群体单株表型数据及分型数据分析获得两个距靶标QTL最近，稳定性好、扩增性强的KASP分子标记。
本发明的有益效果在于：
A利用本发明提供的KASP分子标记进行扩增，结合荧光信号扫描，能够实现高精度、高通量的基因型分型；
B本发明提供的KASP分子标记能够对豌豆的荚壁嫩度性状进行预判，打破了因生长阶段造成的性状选择限制，实现了豌豆生长后期性状的早期鉴定；
C应用本发明提供的KASP分子标记可实现以粒用/食荚型豌豆品种为育种靶标的早期鉴定和辅助选择；也可帮助与其他优良性状进行聚合，实现以不同类型豌豆品种为需求的，且综合性状优良的品种选育。
综上所述，本发明的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁，可在豌豆生长早期快速、准确对荚壁嫩度进行预判，实现以软荚型或硬荚型为育种靶标的分子标记辅助选择，提高育种选择精度，加快育种进程，在豌豆食荚品质改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> 与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记及其开发方法和应用
<160> 83
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(30)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-1的KASP-1-COM反向引物
<400> 1
gcaagtctgc caacatagaa tttaaatcta 30
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-1的KASP-1-FAM正向引物
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tgatttgtgt gacataagac 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-1的KASP-1-HEX正向引物
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tgatttgtgt gacataagat 40
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-2的KASP-2-COM反向引物
<400> 4
aggcttatac caccaccgag ga 22
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(46)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-2的KASP-2-FAM正向引物
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc tttgattact cccagagact cgtcga 46
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(46)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-2的KASP-2-HEX正向引物
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat tttgattact cccagagact cgtcgg 46
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-3的KASP-3-COM反向引物
<400> 7
aaaaggttcc ccaagggacg tg 22
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-3的KASP-3-FAM正向引物
<400> 8
gaaggtgacc aagttcatgc tcattgcccc ttcggttttg 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-3的KASP-3-HEX正向引物
<400> 9
gaaggtcgga gtcaacggat tcattgcccc ttcggtttta 40
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-4的KASP-4-COM反向引物
<400> 10
tcttgagaaa gaaatggttg ac 22
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(44)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-4的KASP-4-FAM正向引物
<400> 11
gaaggtgacc aagttcatgc tcttccacag tatgaacccg acat 44
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(44)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-4的KASP-4-HEX正向引物
<400> 12
gaaggtcgga gtcaacggat tcttccacag tatgaacccg acag 44
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-5的KASP-5-COM反向引物
<400> 13
gctccaaatt agcagagtca ct 22
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-5的KASP-5-FAM正向引物
<400> 14
gaaggtgacc aagttcatgc tgaccacttg acgctgagat agtta 45
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-5的KASP-5-HEX正向引物
<400> 15
gaaggtcgga gtcaacggat tgaccacttg acgctgagat agttg 45
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-6的KASP-6-COM反向引物
<400> 16
acctatattt atactcgaaa aatc 24
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-6的KASP-6-FAM正向引物
<400> 17
gaaggtgacc aagttcatgc ttcctatttt gtcctctgga 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-6的KASP-6-HEX正向引物
<400> 18
gaaggtcgga gtcaacggat ttcctatttt gtcctctggg 40
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-7的KASP-7-COM反向引物
<400> 19
caatggttgg gtgttatgac gatggg 26
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-7的KASP-7-FAM正向引物
<400> 20
gaaggtgacc aagttcatgc ttagcgtcat gccatcacaa 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-7的KASP-7-HEX正向引物
<400> 21
gaaggtcgga gtcaacggat ttagcgtcat gccatcacag 40
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-8的KASP-8-COM反向引物
<400> 22
aaatagtctt aacacaactt acaatc 26
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-8的KASP-8-FAM正向引物
<400> 23
gaaggtgacc aagttcatgc tgacattgaa gattcgttat atcca 45
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-8的KASP-8-HEX正向引物
<400> 24
gaaggtcgga gtcaacggat tgacattgaa gattcgttat atccg 45
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-9的KASP-9-COM反向引物
<400> 25
atcgccttaa aggggtatca ttgc 24
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-9的KASP-9-FAM正向引物
<400> 26
gaaggtgacc aagttcatgc tagtgcgatg atactcgtta 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-9的KASP-9-HEX正向引物
<400> 27
gaaggtcgga gtcaacggat tagtgcgatg atactcgttg 40
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-10的KASP-10-COM反向引物
<400> 28
gcaggagatt gtcaagtatt acgagatg 28
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(41)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-10的KASP-10-FAM正向引物
<400> 29
gaaggtgacc aagttcatgc tctattaccg tttggaattc g 41
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(41)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-10的KASP-10-HEX正向引物
<400> 30
gaaggtcgga gtcaacggat tctattaccg tttggaattc a 41
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-11的KASP-11-COM反向引物
<400> 31
aagctatgta atttctatta tcactt 26
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-11的KASP-11-FAM正向引物
<400> 32
gaaggtgacc aagttcatgc tggcatcttt tgtattttta ggttt 45
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-11的KASP-11-HEX正向引物
<400> 33
gaaggtcgga gtcaacggat tggcatcttt tgtattttta ggttc 45
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(30)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-12的KASP-12-COM反向引物
<400> 34
tagttttggg ttttgactta aggagtaggt 30
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(42)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-12的KASP-12-FAM正向引物
<400> 35
gaaggtgacc aagttcatgc tcaagaataa tggttactcc ct 42
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(42)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-12的KASP-12-HEX正向引物
<400> 36
gaaggtcgga gtcaacggat tcaagaataa tggttactcc cc 42
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-13的KASP-13-COM反向引物
<400> 37
atcactctct aaagcttcat ag 22
<210> 38
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(46)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-13的KASP-13-FAM正向引物
<400> 38
gaaggtgacc aagttcatgc tcacttgtag ttagttattc ccattg 46
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(46)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-13的KASP-13-HEX正向引物
<400> 39
gaaggtcgga gtcaacggat tcacttgtag ttagttattc ccattt 46
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-14的KASP-14-COM反向引物
<400> 40
atcactgacc taacctaatt ga 22
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(46)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-14的KASP-14-FAM正向引物
<400> 41
gaaggtgacc aagttcatgc tgatgagttc atttggtaag ttcaag 46
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(46)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-14的KASP-14-HEX正向引物
<400> 42
gaaggtcgga gtcaacggat tgatgagttc atttggtaag ttcaac 46
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-15的KASP-15-COM反向引物
<400> 43
ttataatgca gcaaaagaga at 22
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(44)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-15的KASP-15-FAM正向引物
<400> 44
gaaggtgacc aagttcatgc tcagagtttt tcaatccctg atta 44
<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(44)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-15的KASP-15-HEX正向引物
<400> 45
gaaggtcgga gtcaacggat tcagagtttt tcaatccctg attt 44
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-16的KASP-16-COM反向引物
<400> 46
gaacaagtat aaacagacag aagaca 26
<210> 47
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(41)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-16的KASP-16-FAM正向引物
<400> 47
gaaggtgacc aagttcatgc tgtaacaata attcccgaca c 41
<210> 48
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(41)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-16的KASP-16-HEX正向引物
<400> 48
gaaggtcgga gtcaacggat tgtaacaata attcccgaca t 41
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-17的KASP-17-COM反向引物
<400> 49
aaggtttgaa aattttactt tc 22
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-17的KASP-17-FAM正向引物
<400> 50
gaaggtgacc aagttcatgc ttggttttag ttttagccat 40
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-17的KASP-17-HEX正向引物
<400> 51
gaaggtcgga gtcaacggat ttggttttag ttttagccag 40
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-18的KASP-18-COM反向引物
<400> 52
ttaaagcatc taatggtgga ga 22
<210> 53
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(43)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-18的KASP-18-FAM正向引物
<400> 53
gaaggtgacc aagttcatgc tctcacttaa atagtgcatg gtg 43
<210> 54
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(43)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-18的KASP-18-HEX正向引物
<400> 54
gaaggtcgga gtcaacggat tctcacttaa atagtgcatg gta 43
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-19的KASP-19-COM反向引物
<400> 55
agttgagctt tttacttcgt tcc 23
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-19的KASP-19-FAM正向引物
<400> 56
gaaggtgacc aagttcatgc tgacattttc aaaatgacgc 40
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-19的KASP-19-HEX正向引物
<400> 57
gaaggtcgga gtcaacggat tgacattttc aaaatgacgt 40
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-20的KASP-20-COM反向引物
<400> 58
aattgtaatt agaccccaaa aactta 26
<210> 59
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(42)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-20的KASP-20-FAM正向引物
<400> 59
gaaggtgacc aagttcatgc tgatggcgtt gaagatgtga ca 42
<210> 60
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(42)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-20的KASP-20-HEX正向引物
<400> 60
gaaggtcgga gtcaacggat tgatggcgtt gaagatgtga cg 42
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(27)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-21的KASP-21-COM反向引物
<400> 61
tcatttttca tgagatactt attcttg 27
<210> 62
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(43)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-21的KASP-21-FAM正向引物
<400> 62
gaaggtgacc aagttcatgc tgatggttac gtttttcaaa ctt 43
<210> 63
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(43)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-21的KASP-21-HEX正向引物
<400> 63
gaaggtcgga gtcaacggat tgatggttac gtttttcaaa ctc 43
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(30)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-22的KASP-22-COM反向引物
<400> 64
attttttcac tatcatataa ttttttattc 30
<210> 65
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-22的KASP-22-FAM正向引物
<400> 65
gaaggtgacc aagttcatgc tctgaaaagt gggttatttt gagat 45
<210> 66
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-22的KASP-22-HEX正向引物
<400> 66
gaaggtcgga gtcaacggat tctgaaaagt gggttatttt gagaa 45
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(30)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-23的KASP-23-COM反向引物
<400> 67
ggttagtttt gggcttagaa gtcctatcat 30
<210> 68
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(42)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-23的KASP-23-FAM正向引物
<400> 68
gaaggtgacc aagttcatgc tccttattct ttcactacct tt 42
<210> 69
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(42)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-23的KASP-23-HEX正向引物
<400> 69
gaaggtcgga gtcaacggat tccttattct ttcactacct tc 42
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(30)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-24的KASP-24-COM反向引物
<400> 70
gtaagtttac tataggttgc ttttataatc 30
<210> 71
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-24的KASP-24-FAM正向引物
<400> 71
gaaggtgacc aagttcatgc tccaaacaca tcagggacat 40
<210> 72
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(40)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-24的KASP-24-HEX正向引物
<400> 72
gaaggtcgga gtcaacggat tccaaacaca tcagggacac 40
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-25的KASP-25-COM反向引物
<400> 73
tgattctgtt gttgcagggt aa 22
<210> 74
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-25的KASP-25-FAM正向引物
<400> 74
gaaggtgacc aagttcatgc tctcctttgc aatttaggat gtccg 45
<210> 75
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-25的KASP-25-HEX正向引物
<400> 75
gaaggtcgga gtcaacggat tctcctttgc aatttaggat gtcca 45
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-26的KASP-26-COM反向引物
<400> 76
ttgcacacgt aatgaacttg taagct 26
<210> 77
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(44)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-26的KASP-26-FAM正向引物
<400> 77
gaaggtgacc aagttcatgc tcaccaccat taattagtgt ctat 44
<210> 78
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(44)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-26的KASP-26-HEX正向引物
<400> 78
gaaggtcgga gtcaacggat tcaccaccat taattagtgt ctaa 44
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-27的KASP-27-COM反向引物
<400> 79
attaaaaagt cttgtttcaa aa 22
<210> 80
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-27的KASP-27-FAM正向引物
<400> 80
gaaggtgacc aagttcatgc tggaattatc tacacagtac tagac 45
<210> 81
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(45)
<223> 豌豆KASP分子标记KASP-27的KASP-27-HEX正向引物
<400> 81
gaaggtcgga gtcaacggat tggaattatc tacacagtac tagat 45
<210> 82
<211> 111
<212> DNA
<213> 豌豆（Pisum sativum L.）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(111)
<223> 豌豆Chr1LG6染色体第297000666位点及上下游55bp序列
<400> 82
cactcttgcc ctcacataaa taaataaaat gtcaatctat taccgtttgg aattcagaga 60
caattttgac gatgtaaaac atctcgtaat acttgacaat ctcctgcaga c 111
<210> 83
<211> 111
<212> DNA
<213> 豌豆（Pisum sativum L.）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(111)
<223> 豌豆Chr1LG6染色体第302006525位点及上下游55bp序列
<400> 83
aattctgtga atacaatgtt atgacttctc tattacaaga ataatggtta ctccccctat 60
ttatagattt aggttaacct actccttaag tcaaaaccca aaactataaa a 111

Claims (10)

1.一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于，包括第一KASP分子标记和/或第二KASP分子标记，所述第一KASP分子标记特异性检测豌豆的Chr1LG6染色体的第297000666位点，所述第二-KASP分子标记特异性检测所述的豌豆的Chr1LG6染色体的第302006525位点。
2.根据权利要求1所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于，所述第一KASP分子标记包括如SEQ ID NO：28～SEQ ID NO：30所示的引物序列，所述第二KASP分子标记包括如SEQ ID NO：34～SEQ ID NO：36所示的引物序列。
3.一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将硬荚型豌豆品种和软荚型豌豆品种作为亲本材料配置杂交组合，构建F2群体，将所述F2群体进行种植，测量所述F2群体的嫩荚期豆荚厚度，并观测所述F2群体的成熟期荚壁为脆薄半透明型还是柔韧且坚硬型，获得所述F2群体的表型数据；
(2)从所述F2群体中选取多个嫩荚期豆荚薄且成熟期荚壁脆薄半透明型的极端个体组成第一基因池，选取多个嫩荚期豆荚厚且成熟期荚壁柔韧且坚硬型的极端个体组成第二基因池，并连同所述亲本材料展开基因组重测序，分析得到所述第一基因池的SNPs位点和所述第二基因池的SNPs位点，分别计算所述SNPs位点的频率及所述SNPs位点中相对应的SNPs位点的频率差值即delta值，并进行统计分析，以SNPs-index为纵坐标、染色体位置为横坐标作图，发现与豌豆的荚壁嫩度相关的主效基因的位置区域；
(3)基于所述位置区域，参考所述基因组重测序所得的全基因组SNP、InDel及其双侧翼序列信息，设计KASP引物，从中挑选出在所述位置区域的染色体上分布均匀，且在所述亲本材料中扩增性强、稳定性好的多对KASP引物，对所述F2群体进行高通量基因分型获得所述F2群体的分型数据，联合所述的F2群体的表型数据及所述的F2群体的分型数据进行连锁分析，获得所述的与豌豆的荚壁嫩度相关的主效基因的目标区间；
(4)根据所述目标区间，获得距离所述目标区间最近的KASP引物作为所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记。
4.根据权利要求3所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述硬荚型豌豆品种为PS71，所述软荚型豌豆品种为PS35。
5.根据权利要求3所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述F2群体包含230个株系。
6.根据权利要求3所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的嫩荚期豆荚厚且成熟期荚壁柔韧且坚硬型的极端个体和所述的嫩荚期豆荚薄且成熟期荚壁脆薄半透明型的极端个体均为30个。
7.根据权利要求3所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述统计分析分别在100MB，10KB、100KB，1KB、10KB，1KB3种不同窗口和步长下进行。
8.一种与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于，采用权利要求3～权利要求7中任一项所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法获得。
9.根据权利要求1～权利要求2中任一项所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记或者权利要求3～权利要求7中任一项所述的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记的开发方法获得的与豌豆荚壁嫩度主效QTL紧密连锁的KASP分子标记在早期检测豌豆荚壁嫩度中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)以待测豌豆的基因组DNA为模板，采用所述KASP分子标记进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描；以及
2)根据所述荧光信号扫描的结果判断位于所述第297000666位点为G还是A，判断位于所述第302006525位点为T还是C，当所述第297000666位点为G和/或所述第302006525位点为T时，则所述待测豌豆为软荚类型，当所述第297000666位点为A和/或所述第302006525位点为C时，则所述待测豌豆为硬荚类型。
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