CN116356073B - 与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记及应用,属于分子育种领域。本发明利用1份松散型花椰菜育种高代自交系材料及其EMS突变体库中的矮茎材料,基于BSA群体定位获得与松散型花椰菜矮茎性状紧密连锁的染色体区域,并在候选区间内开发了分子标记。根据候选基因的单碱基突变设计了1个KASP分子标记,利用该标记对428个单株进行基因型鉴定,与表型符合率达到100%。本发明可以直接用于松散型花椰菜矮茎植株的分子标记辅助育种,提高育种的选择效率,加快育种进程;同时为矮茎基因CauSS的克隆、功能验证及植物主茎生长、发育等相关研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于花椰菜分子育种领域,涉及一种与花椰菜矮茎基因连锁的SNP分子标记及应用。
背景技术
花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis L.)属于十字花科芸薹属植物,由于其营养丰富,深受广大消费者的喜爱。目前我国已成为世界上最大的花椰菜生产国和消费国,花椰菜在保证我国蔬菜出口创汇和周年均衡供应中起重要作用。近年,松散型花椰菜(简称松花菜)已成为我国主要消费类型,栽培面积占总面积的90%以上,为我国农业增效、农民增收提供了重要保障。
随着人工成本的增加,选育适宜机械化采收的品种显得尤为迫切。目前,机械化采收已经成为松花菜主要育种目标之一。松花菜主茎长度是实际生产与生长发育过程中重要的农艺性状之一。主茎过高俗称“高脚”,植株容易倒伏,不利于田间管理;主茎过矮俗称“矮脚”,不利于机械化采收。适当的主茎长度不仅有利于机械化采收,而且有助于花球远离土壤中的病原微生物,对花球的健康发育和品质保障具有积极作用。
目前国内外尚未见花椰菜主茎长度基因的定位、克隆等研究,花椰菜高矮茎形成机制尚不明确,不利于现有花椰菜品种的遗传改良。因此,在开展高矮茎的遗传分析与基因克隆基础上,阐明其目标基因的功能及其相关的分子调控机制,对花椰菜种质创新、品种改良具有重要的理论意义和实际应用价值。
在前期研究中,我们发现了1个松散型花椰菜矮茎突变体‘SS-5-16’,本发明以该突变体为主要材料,开展了矮茎基因的定位及连锁分子标记的开发。
发明内容
本发明的首要目的在于针对松散型花椰菜出现的高矮茎现象,提供一种与矮茎基因连锁的分子标记,为矮茎突变体的筛选提供新的途径。
一种与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记,为花椰菜9号染色体第1732384位核苷酸处G向A的突变。
进一步的,所述的分子标记对应的基因型:A:A为具有矮茎表型的基因型,G:A和G:G为不具有矮茎表型的基因型。
进一步的,针对该突变位点设计的引物(Cau-SS1标记)如下:
正向引物Primer_AlleleX(SS-1):GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAG(SEQ ID NO.1);
正向引物Primer_AlleleY(SS-2):GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAA(SEQ ID NO.2);
反向引物Primer_Common:CAATGGCTGCAATACCATCAGTAG(SEQ ID NO.3);
进一步的,两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列FAM和HEX。
接头序列:
FAM:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT;
HEX:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT;
荧光接头序列为FAM或HEX(LGC公司合成)。优选:连接了FAM荧光接头序列的正向引物SS-1:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAG;连接了HEX荧光接头序列的正向引物SS-2:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAA。
本发明的第二个目的是提供上述分子标记的应用,有利于松散型花椰菜高矮茎的选育,且为克隆矮茎基因、研究植物茎生长和发育的分子机制奠定基础。具体如下:
所述的分子标记用于鉴定和辅助筛选松散型花椰菜高矮茎。
进一步的,所述的分子标记用于松散型花椰菜高矮茎筛选育种,尤其是矮茎突变体的筛选。
进一步的,所述的分子标记应用时,采用PCR反应进行检测。
具体包括以下步骤:
(1)以待测样品基因组DNA为模板,利用分子标记的扩增引物进行PCR扩增,获得扩增产物;
(2)对扩增产物进行检测与分析。
进一步的,对扩增产物进行荧光检测时,如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物SS-2对应的荧光信号,则检测位点为A:A基因型,判定为具有矮茎表型的纯合突变体单株;如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物SS-1对应的荧光信号,则检测位点为G:G基因型,判定为不具有矮茎表型的纯合野生单株(高茎表型);若同时检测到连接了荧光接头序列的引物SS-1和SS-2对应的两种荧光信号,则检测位点为G:A基因型,判定为不具有矮茎表型的杂合野生单株(高茎表型)。
进一步的,所述的分子标记应用时,采用Touchdown PCR。
进一步的,Touchdown PCR扩增程序为:94℃15min;95℃20s;65℃-56℃60s,10个循环,每个循环退火延伸温度降0.8℃;94℃20s;57℃60s,26个循环。
另外,包含上述分子标记引物的试剂盒,可以用于鉴定花椰菜矮茎性状,具体应用时,可以选择含有上述分子标记引物的试剂做成试剂盒。
用于检测所述分子标记是否存在的试剂在花椰菜矮茎基因CauSS定位中的应用,扩增所述分子标记引物的正向引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。利用本发明的分子标记,可以对花椰菜矮茎基因CauSS进行定位,上述这些应用均可以按照常规的方法进行。
本发明还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后,本领域技术人员可以根据不同的需要,将重组载体转化到合适的细胞中,得到含有该重组载体的重组细胞。因此,本发明还保护含有所述重组载体的重组细胞。
本发明的优点:
本发明利用BSA群体定位结合传统遗传连锁分析,定位到一个与松散型花椰菜矮茎基因连锁的标记,该突变位点位于9号染色体的1732384处,开发了与该松散型花椰菜矮茎基因相关联的KASP分子标记,可以直接用于松散型花椰菜高矮茎表型和对应基因型的鉴定,进而依赖该分子标记进行辅助育种,加快育种效率。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到目标植株,有效地减小了种植规模,减少了后期田间鉴定的工作量,提高了选择的效率和准确性。本发明在松散型花椰菜高矮茎育种实践及植物茎生长和发育相关理论研究上均具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中的松散型花椰菜矮茎突变体‘SS-5-16’和高茎野生型材料‘JL-137’。图1A表示:矮茎突变体‘SS-5-16’;图1B表示:高茎野生型‘JL-137’。Bar=5cm。
图2为本发明‘SS-5-16’与‘JL-137’构建群体定位结果。图2A表示BSA定位结果;图2B表示本发明候选区段内标记开发与连锁定位示意图。SS:矮茎;HS:高茎。1-9代表染色体编号,矮茎基因CauSS位于9号染色体,即箭头指示处。
图3为本发明的Cau-SS1分子标记在‘SS-5-16’与‘JL-137’构建的F2群体中进行基因分型的部分结果。
A处表示:PCR产物为连接了荧光接头序列的引物SS-1对应的荧光信号,为高茎的纯合单株;
B处表示:PCR产物具有连接了荧光接头序列的引物SS-1和SS-2两种荧光信号,为高茎的杂合单株;
C处表示:PCR产物为连接了荧光接头序列的引物SS-2对应的荧光信号,为矮茎的纯合单株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法,未经特殊说明,均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法,均可通过商业渠道获得。本发明中所涉及的松散型花椰菜种质(‘JL-137’,‘SS-5-16’)均由天津市农业科学院蔬菜研究所提供,也可保证对外出售至少20年。
实施例1松散型花椰菜矮茎基因连锁分子标记的获得
1.分离群体的构建
以松散型花椰菜高代自交系材料‘JL-137’(高茎,图1B)为父本,以其突变体‘SS-5-16’(矮茎,图1A)为母本,该突变体能够稳定遗传,本发明的高茎和矮茎是两者相比较得出的,具有相对性。将‘SS-5-16’与‘JL-137’进行杂交得到F1代,F1代自交后获得F2群体。
2.主茎长度鉴定
在3~4叶期,可对植株茎长度进行高/矮鉴定。
3.矮茎基因的初定位
在‘SS-5-16’×与‘JL-137’的F2群体中随机选取20个高茎植株和20个矮茎植株的苗期幼嫩叶片分别混池,其中高茎为显性子代混池HS;矮茎隐性子代混池SS,显性亲本‘JL-137’及隐性亲本‘SS-5-16’。利用CTAB法提取4个混池总的DNA,利用TruSeqDNA LT SamplePrep Kit(Illumina公司)对4个混池DNA建库,通过Illumina Novaseq 6000进行基因组重测序,获得的数据。利用bwa进行mapping、samtools进行SNP的calling,过滤条件是碱基质量值大于等于30,mapping质量值大于等于30,碱基depth在两个F2混池中大于等于2且小于等于60,共获得9523个差异SNP。然后以10个SNP为窗口,4个SNP为步长做SNP-index分布图(如图2),平均Δ(SNP-index)为0,而候选区间的Δ(SNP-index)大于0.5,候选区间为9号染色体398071-5138039bp。
4.矮茎基因的精细定位
为了进一步缩小步骤3获得的控制矮茎基因的候选区域,扩大了F2群体进行精细定位。根据亲本重测序结果,比对花椰菜参考基因组序列,找到SNP变异位点,开发KASP标记,利用开发的KASP分子标记对F2群体的单株进行基因分型,确定交换单株。基于高矮茎表型数据和交换单株的基因型,将控制矮茎基因定位在9号染色体的1294948-2500244bp区间,如图2B。进一步结合区间内显性亲本和隐性亲本纯合,同时隐性池差异且纯合,显性池纯合或杂合的位点,发现仅1732384位点符合EMS诱变偏好性的G-A,注释为非同义突变,功能为AUXIN SIGNALING F BOX PROTEIN 1,且与表型100%连锁。
5.矮茎基因相连锁的分子标记的开发
用该标记对‘SS-5-16’与‘JL-137’构建的F2群体428个单株进行基因分型。出现了3种荧光信号,其中A:A的荧光信号有105个单株,G:A的荧光信号有213个单株,G:G的荧光信号有110个单株。结合表型调查数据发现基因型与表型完全一致,符合率达到了100%。以上结果充分说明,本发明Cau-SS1标记具有通用性和准确性,可以应用于松散型花椰菜矮茎性状的预测、鉴定和筛选。
6.分子标记的应用
(1)以待测样品基因组DNA为模板,利用分子标记的扩增引物进行Touchdo-wnPCR扩增,获得扩增产物;
(2)对扩增产物进行检测与分析。
正向引物Primer_AlleleX(SS-1):GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAG;
正向引物Primer_AlleleY(SS-2):GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAA;
反向引物Primer_Common:CAATGGCTGCAATACCATCAGTAG;
两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列;正向引物SS-1的5’端连接FAM荧光接头序列,正向引物SS-2的5’端连接HEX荧光接头序列;FAM和HEX荧光接头序列分别为:
FAM:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT;
HEX:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT;
对扩增产物进行荧光检测时,如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物SS-2对应的HEX荧光信号,则检测位点为A:A基因型,判定为具有矮茎表型的突变体单株;如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物SS-1对应的FAM荧光信号,则检测位点为G:G基因型,判定为不具有叶色矮茎表型的野生单株(高茎);若同时检测到连接了荧光接头序列的引物SS-1和SS-2对应的两种荧光信号,则检测位点为G:A基因型,判定为不具有矮茎表型的野生单株(高茎)。
分子标记应用时,采用Touchdown PCR。Touchdown PCR扩增程序为:94℃15min;95℃20s;65℃-56℃60s,10个循环,每个循环退火延伸温度降0.8℃;94℃20s;57℃60s,26个循环。
采用本发明的Cau-SS1标记对待测样本叶片的基因型进行检测,对其表型进行统计,结果见表1(部分结果)。
表1 Cau-SS1标记在F2群体中高矮茎表型及基因型
上述鉴定结果表明,在育种中通过分子标记鉴定筛选,保留检测到引物连接了荧光接头序列的引物SS-2对应的HEX荧光信号的材料,就能够选育出矮茎的纯合材料。保留检测到连接了荧光接头序列的引物SS-1对应的FAM荧光信号的材料,就能够选育出高茎的纯合材料。保留检测到连接了荧光接头序列的引物SS-1和SS-2两种荧光信号的材料,就能够选育出高茎的杂合材料。通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量,加速育种进程。
Claims (6)
1.一种用于检测松散型花椰菜主茎长度高矮茎性状的分子标记,其特征在于,所述分子标记是以松散型花椰菜的基因组DNA为模板,由以下引物采用Touchdown PCR扩增得到:
正向引物SS-1:
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAG-3’;
正向引物SS-2:
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAA-3’;
反向引物Primer_Common:5’-CAATGGCTGCAATACCATCAGTAG-3’。
2.根据权利要求1所述的分子标记,其特征在于,正向引物SS-1的5’端连接FAM荧光,正向引物SS-2的5’端连接HEX荧光。
3.权利要求1或2所述的分子标记在鉴定或辅助鉴定松散型花椰菜高矮茎植株性状中的应用。
4.一种鉴定松散型花椰菜高矮茎植株性状的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)以待测花椰菜样品基因组DNA为模板,利用权利要求2中所述的分子标记引物进行Touchdown PCR扩增,获得扩增产物;
(2)对扩增产物进行荧光检测与分析,如果样品PCR产物只检测到引物SS-2对应的HEX荧光信号,则检测位点为A:A基因型,判定为具有矮茎表型的纯合单株;如果样品PCR产物只检测到引物SS-1对应的FAM荧光信号,则检测位点为G:G基因型,判定为高茎表型的纯合单株;若同时检测到引物SS-1和SS-2对应的两种HEX和FAM荧光信号,则检测位点为G:A基因型,判定为高茎表型的杂合单株。
5.根据权利要求4所述的鉴定松散型花椰菜高矮茎植株性状的方法,其特征在于,Touchdown PCR扩增程序为:94℃15min;95℃20s;65℃-56℃60s,10个循环,每个循环退火延伸温度降0.8℃;94℃20s;57℃60s,26个循环。
6.一种用于鉴定松散型花椰菜高矮茎植株性状的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1或2中所述的引物。
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