CN116694809A - 一种与小麦粒重相关的kasp引物组与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种与控制小麦粒重的QTL位点Qgw‑5B相关的KASP引物组及其应用；Qgw‑5B位于小麦5B染色体上，在中国春参考基因组上的物理位置为577.22 Mb‑586.35 Mb；Qgw‑5B能够显著增加小麦粒重，在小麦高产育种中具有应用潜力；该KASP引物组包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的引物KASP‑5B_584612037‑1、KASP‑5B_584612037‑2和KASP‑5B_584612037‑3；该KASP引物组为高粒重小麦的筛选提供了一种检测简便、结果可靠、分析通量高的分子标记，适合大规模育种材料的高效检测，且不受作物生长阶段的限制，可实现对粒重性状进行早期鉴定，缩短育种时间，提高选择效率，也可辅助实现千粒重位点与其他优良性状的聚合，加快选育产量突出且综合性状优良的小麦新品种。
Description
技术领域
本发明涉及小麦遗传育种领域，特别是涉及与小麦粒重QTL位点Qgw-5B相关的KASP标记的开发与应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L)是世界上种植最广的作物，也是我国最重要的主粮作物之一，小麦的高产、稳产对我国的粮食安全意义重大。小麦籽粒重量(Grain Weight，GW)，通常用千粒重衡量，是三个主要产量因素(即亩穗数、穗粒数、干粒重)之一，也是影响小麦高产的重要限制因素(慕晓茜,慕美财,刘新程.(2010)高产小麦几个性状的相关性研究.中国生态农业学报18(04):787-791)。提高小麦粒重是现代育种中优良品种选育的一个重要目标。
粒重是受多基因共同作用的复杂性状，主要为加性效应，属于典型的数量遗传性状(Cao S,Xu D,HanifM,et al.(2021)Genetic architecture underpinning yieldcomponent traits in wheat.TheorAppl Genet 133(6):1811-1823)。相比其他产量性状的构成因素，粒重具有更高的遗传力，因此也成为现代小麦育种中提高作物产量的首选因素。在小麦粒重的遗传改良中，通过传统人工选育的方法往往面临着工作量巨大、周期缓慢、效率低下等诸多困难。随着分子生物学和数量遗传学的发展，从基因水平对目标性状进行选择和改良已成为育种工作者的迫切愿望，而发掘控制产量相关性状的QTL(Quantitative trait loci,数量性状位点)\基因，以及开发与其紧密连锁的分子标记是实现这一目标的重要环节(Würschum T.(2012)Mapping QTL for agronomic traits inbreeding populations.Theor Appl Genet125:201-210)。
迄今，关于小麦粒重的遗传研究已有诸多成果，许多QTL被定位，一些重要的基因也相继被克隆。控制小麦粒重的QTL已报到分布于小麦多条染色体上(Yang F,Zhang J,Zhao Y,et al.(2022)Wheat glutamine synthetase TaGSr-4B is acandidate gene fora QTL ofthousand grain weight on chromosome 4B.Theor Appl Genet 135(7):2369-2384)。例如Li等(2018)(Li F,Wen W,He Z,et al.(2018)Genome-wide linkage mappingof yield-related traits in three Chinese bread wheat populations using high-density SNPmarkers.TheorAppl Genet 131(9):1903-1924)使用3个重组自交系群体在2A、2B、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5D、6A、6B、7A和7B染色体上定位到17个千粒重QTL。Liu等(2020)(Liu H,Zhang X,Xu Y,et al.(2020)Identification and validation ofquantitative trait loci for kernel traits in common wheat(Triticum aestivumL.).BMC Plant Biol 20:529)利用PuBing3228×Gao8901 RIL群体进行QTL定位，共鉴定到5个环境稳定的与千粒重相关的QTL。在基因方面，目前包括TaSus1-7A、TaSus2-2B、TaGW2-6A、TaSPL14等涉及糖代谢、转录因子等途径的基因也陆续得到鉴定(Tillett B,Hale C,Martin J,et al.(2020)Genes impacting grain weight and number in wheat(Triticum aestivum L.ssp.aestivum).Plants 11(13):1772)。然而相比其他作物，小麦基因组巨大且结构复杂，对粒重这样的复杂性状的遗传基础解析依然面临困难，可用于育种利用的QTL、分子标记等缺乏。基于骨干品系，结合高质量遗传图谱的粒重相关QTL定位与育种可用的分子标记开发，有望推动小麦产量的分子育种进程，促进对产量性状的遗传改良。
小麦品种宁麦9号和扬麦158是分别是江苏省农业科学院与江苏省里下河地区农业科学研究所育成的高产、优质、抗病小麦品种，曾在长江中下游麦区(该麦区的定义参见程顺和等(2012)(程顺和,郭文善,王龙俊等(2012)《中国南方小麦》.江苏科学技术出版社)小麦生产上占主导地位，他们在粒重、穗数等重要性状上各有突出，以其为骨干亲本育成的品种近百个，如扬麦23、扬辐麦4号和宁麦14等至今都是长江中下游麦区的大面积主栽品种。然而迄今，有关宁麦9号和扬麦158粒重等重要产量性状的遗传解析鲜有报道，实用性强、适合于高通量准确检测优异变异的育种可用的分子标记尤其匮乏。
KASP，即竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele-specific PCR)标记技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNPs和InDels(Insertions or Deletions,插入或缺失)进行高精度的双等位基因分型方法，具有通量高、成本低、准确度高等优点，已经成为新一代的SNP分型标记，在作物的基因精细定位、MAS(Molecular marker-assistedselection，分子标记辅助选择)育种等领域具有很大的应用潜力(杨青青,唐家琪,张昌泉等.(2022)KASP标记技术在主要农作物中的应用及展望.生物技术通报38(04):58-71)。因此发掘粒重相关QTL，并开发育种可用的新一代高通量KASP分子标记，不仅可以为小麦高产育种提供新的功能位点和基因资源，也可进一步结合分子标记高效、精准选择优异基因型，为小麦的产量MAS育种提供技术支撑。
发明内容
为解决上述技术中存在的问题，本发明首次发现针对与小麦粒重QTL位点Qgw-5B并据此设计KASP引物组，所提供QTL位点Qgw-5B能够显著地增加小麦粒重，与之对应的KASP标记分型简便、精确度高，综上对小麦高产分子育种具有很高的应用价值。
具体而言，本申请提供的技术方案如下：
首先，本发明提供了一组与小麦粒重相关的KASP引物组，该KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的正向竞争性引物KASP-5B_584612037-1、核苷酸序列如SEQID NO.11所示的正向竞争性引物KASP-5B_584612037-2、核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的反向通用性引物KASP-5B_584612037-3。
该KASP引物组是针对小麦粒重QTL位点Qgw-5B开发的，Qgw-5B位于小麦的5B染色体上，对比中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0上的物理位置为577.22Mb-586.35Mb之间，其两侧的SNP分子标记分别是5B_577227492和5B_586354348。
该KASP引物组正向引物KASP-5B_584612037-1与正向引物KASP-5B_584612037-2的5’端连接有不同的荧光标签。其中，KASP-5B_584612037-1的5’端连接有FAM荧光探针标签(SEQ ID NO.16)，KASP-5B_584612037-2的5’端连接有HEX荧光探针标签(SEQ IDNO.17)。
其次，本申请还提供了上述KASP引物组在检测小麦粒重中的应用，具体方法包括：以待测小麦的基因组DNA为模板，利用所述的KASP引物进行荧光定量PCR扩增，再利用荧光定量PCR仪对扩增产物进行荧光信号扫描，根据荧光信号对待测小麦材料进行基因分型：若待测小麦材料出现KASP引物组的正向引物KASP-5B_584612037-1的荧光探针信号(荧光信号强度值聚合在接近Y轴、与扬麦158聚集，显示蓝色的样本)，而不含有正向引物KASP-5B_584612037-2的荧光探针信号，则该待测小麦材料含有所述的小麦粒重QTL位点Qgw-5B；若待测小麦材料出现KASP引物组的正向引物KASP-5B_584612037-2的荧光探针信号(荧光信号强度值聚合在接近X轴、与宁麦9号聚集，显示红色的样本)，而不含有正向引物KASP-5B_584612037-1的荧光探针信号，则该待测小麦材料不含所述的小麦粒重QTL位点Qgw-5B。将含有所述的小麦粒重QTL位点Qgw-5B的小麦材料的基因型记为A基因型(扬麦158基因型类型)，不含所述的小麦粒重QTL位点Qgw-5B的小麦材料的基因型记为B基因型(宁麦9号基因型类型)，则判断A基因型小麦株系的粒重显著高于B基因型小麦株系。上述待测小麦品种优选长江中下游麦区小麦品种。
以上所涉及的PCR扩增反应体系为10μL，包括：浓度为120ng/ul的基因组DNA 2.5μL,2×KASP Master Mix(LGC)5μL,KASP Assay Mix 0.14μL,ddH2O 2.36μL；
其中，KASPAssay Mix配制方法如下：每100μLKASPAssay Mix包含浓度为100μM的两条正向竞争性引物各12μL、浓度为100μM的反向通用性引物30μL、ddH2O 46μL。
PCR扩增反应程序如下：1)94℃热激活15min；2)94℃变性20s，61～55℃退火延伸1min，循环10次，每次循环退火延伸温度下降0.6℃；3)94℃变性20s，55℃退火延伸1min，28个循环。扩增产物30℃保温，采集荧光信号。
第三，本申请的目的还包括对所提供KASP引物组的应用，该应用包含以下任意一种：1)在用于检测小麦粒重QTL位点Qgw-5B和相关基因定位中的应用；2)在选育和创制高粒重小麦品种中的应用；3)在用于推广小麦粒重QTL位点Qgw-5B与的其它优良性状位点间聚合育种的应用。
本申请的有益效果在于：
1)本申请利用长江中下游小麦骨干亲本宁麦9号和扬麦158构建高代重组自交群体，通过连锁分析定位了一个稳定的、控制小麦粒重的QTL位点Qgw-5B，Qgw-5B位于5B染色体上，物理位置为577.22Mb-586.35Mb，此QTL能够显著地增加小麦粒重，不仅可以为小麦高产育种提供新的功能位点和基因资源，也可进一步结合分子标记进行育种转化利用，促进对粒重性状的分子改良，对于小麦高产育种具有很高的利用价值。
2)进一步，本申请针对该位点开发了可用于高效、精确地检测粒重QTL Qgw-5B的KASP分子标记及其应用方法，该分子标记与Qgw-5B紧密连锁，具有扩增稳定，分型精准，检测快捷的优点，非常契合小麦育种中对大规模遗传品系基因型的精准检测需求，可用于对小麦粒重优异基因型的筛选。
3)本申请提供的分子标记引物组合可促进小麦粒重QTL Qgw-5B在高产小麦育种中的应用，实现以产量为育种靶标的小麦早期鉴定和辅助选择，提高育种选择的针对性、准确性和高效性，提升育种效率；也可辅助实现优异千粒重位点与其他优良性状的聚合，加快选育产量突出且综合性状优良的小麦新品种。
附图说明
图1为控制小麦粒重QTL位点Qgw-5B遗传定位示意图。
图2为本发明所提供KASP分子标记组合的分型效果和对供试材料的基因型检测结果图。
其中，a为KASP分子标记组合在检测样本中的分型效果图，b为KASP分子标记组合在供试小麦材料中的检测结果；坐标轴数值代表等位基因荧光信号强度，黑点代表阴性对照(NTC)(即ddH20)，蓝、红点分别代表不同基因型。
图3为供试小麦材料经KASP分子标记检测出的两种不同基因型的粒重比较结果图。其中：A、B为两种基因型，GW代表千粒重。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术内容和优点更加清楚，特举以下实施例详细说明。
本发明中所使用的术语，除非有特殊说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。实施实例中，未详细描述的各种过程和方法均为本领域中公知的常规方法。
下述实施例中所用的试剂、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中所用的小麦材料均为江苏省省级种质资源库(农作物)—扬州大学农学院保存的种质资源材料，可被本领域技术和研究人员获得使用。
实施例1小麦粒重QTL位点QTkw-5B及标记区间的获得
(1)本实施例以小麦品种宁麦9号为母本，扬麦158为父本杂交获得F1代，F1代自交得到F2代，通过单粒传法获得含有282个株系的高代重组自交系遗传群体。
(2)利用illumina 90k基因芯片对宁麦9号×扬麦158构建的包含282个株系的重组自交群体进行基因组扫描，构建连锁遗传图谱，遗传连锁图谱覆盖小麦的21条染色体，全长3022cM。
(3)于2020-2021和2021-2022连续2年将上述重组自交群体种植于扬州大学试验基地(119.40°E,32.34°N)，单行播种，行长1.2m，行距0.3m，3次重复。试验基地土壤条件均匀，在成熟收获之前，参考马鸿翔等(2021)(马鸿翔,顾克军,陈怀谷(2021)《小麦产业关键实用技术100问》,中国农业出版社.)公开的方法，给予完全一致的田间管理。待籽粒成熟，每株系均随机收获5株长势均匀的植株，籽粒完成脱粒后经自然晾晒，再从中随机选择1,000粒种子测其重量，以千粒重代表粒重，取其平均值用于数据分析。
另随机选取了来自于长江中下游麦区的211份不同小麦品种和育成品系(如表2所示)作为验证材料，包括：1)95份已通过审定的小麦品种(申请人将该材料自编号为Va001-Va095)；2)来自于2022年江苏省农科院小麦科企联合体和江苏里下河地区农科所科企小麦联合体的57份品种试验材料(申请人将该材料自编号为QY001-QY057)；3)来自于申请人单位利用大面积推广品种(包括华麦2668、皖麦54、襄麦25、扬麦11、安农92484、华麦5号、镇261、扬辐麦3号、苏麦188、漯麦6010、瑞华306等)通过杂交组配所获得的小麦高代(F7～F8)育种品系中的59份小麦材料(申请人将其自命名为Line001-Line059)，采用同样方法测量上述共211份小麦材料的千粒重，用于后续验证。
(4)联合基因型与表型数据，利用软件QTL IciMapping v4进行粒重性状QTL定位(Meng L,Li H,Zhang L,et al.(2015)QTL IciMapping:Integrated software forgenetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping inbiparental populations.Crop J 3:269-283)，采用完备区间作图法(ICIM-ADD)，以LOD值2.5作为显著性的阈值。最终定位到一个来源于扬麦158的增加粒重并且在不同环境下都检测到的稳定QTL，申请人将其自命名为Qgw-5B，其遗传定位如图1所示。Qgw-5B位于小麦5B染色体上，其两侧的SNP分子标记分别是5B_577227492和5B_586354348，对比中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0上的物理位置为577.22Mb-586.35Mb之间。
实施例2KASP分子标记的开发、筛选与验证
(1)为了更好地对实施例1筛选获得的Qgw-5B位点进行育种利用，查找并筛选位于此QTL区间内的SNP，进一步开发适用于高通量分型的KASP标记。如表1所示，通过查找共获得5个SNP，即5B_577229458、5B_580518333、5B_582426258、5B_584612037和5B_586323624。分别调取上述各SNP上下游150bp的序列信息，利用Primer Premier5(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)设计多组扩增引物，然后利用DNAMAN对所设计的引物质量进行评估，利用Ensembl Plants数据库进行引物特异性检测，再将筛选后的引物序列转化为KASP引物(杨青青,唐家琪,张昌泉等.(2022)KASP标记技术在主要农作物中的应用及展望.生物技术通报38(04):58-71)，所涉及到的KASP引物序列如表1所示，每一对引物由3条序列组成，即：正向竞争性引物1：FAM标签序列+扩增引物序列；正向竞争性引物2：HEX标签序列+扩增引物序列；反向通用性引物：扩增引物序列；其中，FAM标签序列和HEX标签序列的核苷酸序列如下：
FAM标签序列(SEQ ID NO.16)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
HEX标签序列(SEQ ID NO.17)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
表1KASP引物设计
注：SNP组成(a/b)中a代表扬麦158变异类型，b代表宁麦9号变异类型。
(2)从宁麦9号×扬麦158重组自交群体中随机选取50份材料，连同两个亲本一起取幼嫩叶片，参照Stein等(2001)(SteinN,Herren G,andKeller B(2001)A new DNAextraction method for high-throughput marker analysis in a large-genomespecies such as Triticum aestivum.Plant Breed 120:354-356)，采用CTAB法从中提取基因组DNA，再用灭菌的超纯水将DNA统一稀释至浓度约120ng/ul。
利用表2中获得的KASP引物组进行荧光定量PCR扩增，反应体系、扩增程序和基因型分型方法分别如下：
1)KASP反应体系：总量为10μL，包括样品DNA(120ng/ul)2.5μL，2×KASP MasterMix 5μL(LGC Genomics,Hoddeston,UK)，KASP Assay Mix 0.14μL，ddH2O 2.36μL。
其中，KASPAssay Mix配制方法如下：每100μLKASPAssay Mix包含浓度为100μM的两条正向竞争性引物各12μL、浓度为100μM的反向通用性引物30μL、ddH2O 46μL。
2)KASP反应程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸1min，循环10次，每次循环退火延伸温度下降0.6℃；94℃变性20s，55℃退火和延伸1min，28个循环。扩增产物30℃保温，采集荧光信号。
3)基因型分型：利用荧光定量PCR仪Applied BiosystemsABI Viia7 Real TimePCR System(Thermo Scientific,USA)扫描荧光信号并进行基因型分型，具体是：聚合在接近Y轴、显示蓝色的样本的荧光类型是FAM荧光基团类型，为扬麦158基因型类型；聚合在接近X轴、显示红色的样本的荧光类型是HEX荧光基团类型，为宁麦9号基因型类型；聚合在接近原点、显示黑色的样本为空白对照。
根据分型结果，最终筛选出一组扩增效率高、分型清晰，且与对应基因型亲本聚集完全一致的KASP引物组(如图2中a所示)，申请人将该引物组自命名为KASP-5B_584612037，该KASP引物组核苷酸序列包括KASP-5B_584612037-1、KASP-5B_584612037-2和KASP-5B_584612037-3三条序列，可应用于小麦粒重位点Qgw-5B的育种选择，其优势等位变异为来源于扬麦158，非优势等位变异为来源于宁麦9号。
实施例3KASP-5B_584612037分子标记的应用
利用实施例2获得的KASP引物组合KASP-5B_584612037，对随机选取的211份不同来源小麦材料(即表2中的Va001-Va095，QY001-QY057，Line001-Line059)，连同两个亲本提取基因组DNA并进行荧光定量PCR扩增与基因分型。DNA提取、KASP反应体系、扩增程序和基因分型方法均与实施例2所述方法一致(如图2中b所示)。
最终结果与扬麦158相同荧光信号的记为A基因型，与宁麦9号相同荧光信号的记为B基因型(表2)。
表2随机选取的211份小麦材料的表型与基因分型
统计分析采用SPSS 19.0。对比表2中A、B基因型，和分别携带这两种基因型材料的粒重表型数据，结果发现携带A基因型类型的小麦粒重高于携带B基因型类型的小麦粒重(图3)。
t检验进一步表明，高粒重基因型(A基因型)与低粒重基因型(B基因型)的表型差异达到极显著水平(表3)。
表3t检验结果
注：*表示显著性水平0.05下呈现差异，**表示显著性水平0.01下呈现差异
由此可见，携带所提供QTL位点Qgw-5B的基因型(A基因型)类型能够显著增加小麦粒重，与之相关的KASP标记能够完成对优势等位变异的精准分型。以上实施例中供试小麦包括由长江中下游骨干小麦品种扬麦158和宁麦9号作为亲本衍生的群体材料、长江中下游麦区已通过审定和参试的小麦品种，以及申请人利用长江中下游麦区品种通过杂交组配创建的小麦高代(F7～F8)育成品系，因此鉴定获得的QTL位点Qgw-5B以及开发的KASP分子标记对小麦，尤其是长江中下游麦区小麦高产分子育种具有很高的应用价值。
Claims (4)
1.一种与小麦粒重相关的KASP引物组，其特征在于，所述KASP引物组由核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的正向引物KASP-5B_584612037-1、核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物KASP-5B_584612037-2、核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的反向通用引物KASP-5B_584612037-3组成。
2.如权利要求1所述的KASP引物组在检测小麦粒重中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指，以待测小麦的基因组DNA为模板，利用所述的KASP引物组进行荧光定量PCR扩增，获得扩增产物；再对扩增产物进行荧光信号扫描，若待测小麦出现所述正向引物KASP-5B_584612037-1的荧光信号，而未出现所述正向引物KASP-5B_584612037-2的荧光信号，则将该小麦记为A基因型；若待测小麦出现所述正向引物KASP-5B_584612037-2的荧光信号，而未出现所述正向引物KASP-5B_584612037-1的荧光信号，则将该小麦材料记为B基因型；A基因型小麦的粒重高于B基因型小麦。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增是指：
PCR扩增体系：浓度为120 ng/ul的模板DNA 2.5 μL，2×KASP Master Mix 5 μL，KASPAssay Mix 0.14 μL, ddH2O 补足至10 μL；
其中，每100 μL KASP Assay Mix的配制方法如下：浓度为100 μM的所述正向引物KASP-5B_584612037-1 12 μL、浓度为100 μM的所述正向引物KASP-5B_584612037-2 12 μL、浓度为100 μM的反向通用引物KASP-5B_584612037-3 30 μL、ddH2O 46 μL；
PCR扩增程序：94℃热激活15 min；94℃变性20 s，61～55℃退火延伸1 min，循环10次，每次循环退火延伸温度下降0.6℃；94℃变性20 s，55℃退火延伸1 min，28个循环；最后30℃保温，采集荧光信号。
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